MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 255-262 Emilia Chudzik 2, Karolina Karabin 2, Tomasz Dzieciątkowski 1, Anna Majewska 1, Maciej Przybylski 1, Anna Midak-Siewirska 1, Mirosław Łuczak 1,Grażyna Młynarczyk 1 Wykrywanie oraz różnicowanie wirusów opryszczki typu 1 i 2 metodą real-time PCR z wykorzystaniem sond HybProbe 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny Kierownik: prof. dr hab. G. Młynarczyk 2 Wydział Rolnictwa i Biologii, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego Kierownik: prof. dr hab. B. Zagdańska Celem pracy była optymalizacja metody real-time PCR do wykrywania oraz różnicowania zakażeń ludzkimi wirusami opryszczki typu 1 i 2, zwłaszcza w przypadkach infekcji przebiegających z niewielkim nasileniem replikacji patogenu. Herpeswirusy są grupą DNA-wirusów człowieka wywołujących powszechne zakażenia (14). Do zakażenia dochodzi w wyniku bezpośredniego kontaktu, podczas gdy wrota zakażenia stanowi błona śluzowa lub uszkodzona skóra. Cechą charakterystyczną wirusów opryszczki typu 1 i 2 (HSV-1 oraz HSV-2) jest zdolność wywoływania zakażeń objawowych o różnym obrazie klinicznym i nasileniu - począwszy od zakażeń skórnych, na neuroinfekcjach kończąc (14, 15). Zmiany skórne wywołane przez HSV-1 zwykle dotyczą skóry twarzy oraz błon śluzowych jamy ustnej, zaś HSV-2 wiązany jest z pierwotnym, lub wynikającym z reaktywacji latentnego wirusa zakażeniem skóry i błon śluzowych, zlokalizowanym najczęściej na skórze i błonach śluzowych narządów płciowych oraz w okolicy okołoodbytniczej (14). Oba te wirusy są także istotnym czynnikiem zakaźnym wielu neuroinfekcji, występujących zarówno wśród osób immunokompetentnych (2), jak i pacjentów z niedoborami immunologicznymi (5). Doniesienia piśmiennictwa wskazują jednak na fakt, iż wirus opryszczki typu 2 jest przyczyną zakażeń ośrodkowego układu nerwowego osób dorosłych, które wcześniej uważano za wywoływane przez HSV-1 (12). W chwili obecnej do laboratoryjnej diagnostyki zakażeń HSV-1/2 powszechnie stosuje się reakcję łańcuchowej polimeryzacji (PCR), która w wariancie tradycyjnym służyła głównie do jakościowego badania obecności (9) i różnicowania wirusa typu 1 od typu 2 (4), a stopniowo ulega zastąpieniu przez metodę ilościową real-time PCR (qpcr) (1, 3) Technika ta, ze względu na swą wysoką czułość oraz szybkość wykonania ma ogromne znaczenie w diagnozowaniu zakażeń w przypadkach neuroinfekcji oraz przy monitorowaniu skuteczności terapii przeciwwirusowej (11). System sond hybrydyzacyjnych HybProbe, zwanych też często sondami LightCycler, oparty jest na użyciu dwu sond oligonukleotydowych hybrydyzujących jedna za drugą do
256 E. Chudzik i inni Nr 3 sąsiadujących sekwencji w matrycowym DNA (6). Każda sonda wyznakowana jest innym fluoroforem; pierwsza sonda ma na końcu 3 fluoresceinę jako donor, druga zaś barwnik akceptorowy LightCycler Red na końcu 5. Dodatkowo grupa 3 OH sond HybProbes jest fosforylowana, by uniemożliwić polimerazie wydłużanie startera podczas reakcji PCR. Gdy fluorofory znajdą się w bliskim sąsiedztwie i donor zostanie wzbudzony przez zewnętrzne źródło światła, następuje między nimi transfer energii i fluorescencja (FRET) (6). Celem pracy było opracowanie oraz optymalizacja metody PCR z detekcją w czasie rzeczywistym do wykrywania i różnicowania DNA ludzkich wirusów opryszczki typu 1 i 2 oraz określenie jej czułości analitycznej. MATERIAŁ I METODY Do jakościowych badań techniką real-time PCR (określenie swoistości reakcji) użyto całogenomowego DNA wyizolowanego ze standardowego szczepu McIntyre ludzkiego wirusa opryszczki typu 1 (ATCC nr. VR-539) oraz szczepu MS ludzkiego wirusa opryszczki typu 2 (ATCC nr. VR-540). Jako ujemną kontrolę wykorzystano DNA wyekstrahowane z niezakażonej linii Vero, zaś za kontrole swoistości reakcji posłużyły preparaty DNA izolowanego z: wirusa ospy wietrznej/półpaśca (VZV), wirusa cytomegalii (CMV), wirusa Epsteina-Barr (EBV) oraz ludzkiego adenowirusa typu 7 (HAdV). Określenie czułości metody wykonano z zastosowaniem seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń wzorcowego DNA HSV-1 oraz HSV-2 w jałowej, redestylowanej wodzie w zakresie od 10 0 do 10-5 (50-0,0005 ng/µl). Zakres ten, ustalony przy użyciu komercyjnego testu HSV-1/2 LC PCR Kit (Artus/ Qiagen ), odpowiadał 4,35 x 10 5-4,00x10 2 kopii/ml dla HSV-1 i 4,18 x 10 5-3,82 x 10 2 kopii/ml dla HSV-2. W celu opracowania starterów i sond do metody real-time PCR wykorzystano sekwencje DNA dostępne w internetowej bazie danych GenBank: dla wirusa opryszczki typu 1 kodującą gen US4 (NC 001806), zaś dla wirusa opryszczki typu 2 kodującą gen UL5 (NC 001798). Zaprojektowane do nich, z użyciem oprogramowania LightCycler Probe Design (Roche Diagnostics ), startery amplifikują fragmenty wirusowego genomu o długości odpowiednio, 100 i 127 par zasad (Tabela I). Dodatkowo celem zwiększenia swoistości reakcji zastosowano sondy fluorescencyjne w układzie HybProbes, wyznakowane na końcu 5 fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym LightCycler Red 640 (HSV-1) oraz Light- Cycler Red 670 (HSV-2) (Oligo ). Tabela I. Sekwencje użytych w doświadczeniach starterów i sond Typ wirusa Nazwa Sekwencja(5-3 ) HSV-1 HSV1_D ATC CAC ACC TTA TCG TTT TTG T HSV1_U CGT AAC GCA CGC TAG GGT HSV1_P1 GCG ACA CAC CTG TGT GGC GGT Fluoresceina HSV1_P2 LC Red 640 TCC AGA CGC GGG CGA CGC Fosforan HSV-2 HSV2_F CGC GAG TCA CCT TTA GGT A HSV2_R TTT GTC GTC CCG GAA AGT HSV2_P1 TGT GGG ACG AGA ACA GCC GCG Fluoresceina HSV2_P2 LC Red 670 ACC CCG GAA GGT TGG CCG GGT Fosforan
Nr 3 Wykrywanie wirusów opryszczki metodą real- time PCR 257 Badania techniką real-time PCR wykonywano w aparacie LightCycler 2.0 z użyciem zestawu amplifikacyjnego LightCycler HybProbe DNA Master (Roche Diagnostics ). Mieszanina reakcyjna o końcowej objętości 20 µl zawierała: 2 µl DNA; 1 μl MgCl 2 ; 2,25 µm starterów HSV1_D oraz HSV2_F; 1,75 µm starterów HSV1_U oraz HSV2_R oraz 75 nm każdej z sond. PCR rozpoczynał się etapem aktywacji (hot-start) termostabilnej DNA polimerazy przez 10 min w temp. 95 0 C, po którym następowało 40 cykli składających się z denaturacji 10 s w temp. 95 0 C, przyłączania starterów przez 10 s w temp. 60 0 C oraz wydłużania nici w temp. 72 0 C przez 10 s. Kolejnym etapem była analiza temperatury topnienia produktów (Melting Curves), podczas której próbki schłodzone do temp. 50 0 C podgrzewano przy gradiencie temperaturowym 0,1 0 C /s przy ciągłym pomiarze fluorescencji do temp. 80 0 C. Reakcję kończyło schłodzenie próbek do temp. 40 0 C na 60 sekund. Odczyt fluorescencji odbywał się przy długościach fali 640 nm (HSV-1) oraz 670 nm (HSV-2), odpowiednich dla zastosowanych barwników reporterowych LightCycler Red 640 i LightCycler Red 670. Wzrost poziomu fluorescencji był proporcjonalny do ilości produktu w mieszaninie. Dla porównania wykonano standardowy PCR służący do wykrywania i różnicowania typu 1 i 2 ludzkich herpeswirusów wg. Kimury (4) w końcowej objętości 50 µl z użyciem 10 µl wyizolowanego DNA. DNA szczepów laboratoryjnych McIntyre (HSV-1) i PT368 (HHV-2) służyło za kontrolę dodatnią. Kontrolę ujemną stanowiło DNA izolowane z niezakażonej linii Vero. Rozdziału produktów dokonywano poprzez elektroforezę w 1% żelu agarozowym zabarwionym bromkiem etydyny. Wizualizację przeprowadzano przy świetle ultrafioletowym za pomocą transiluminatora UV. Materiał do badań stanowiły 34 izolaty z hodowli komórkowych, pochodzących z kolekcji szczepów Katedry i Zakładu Mikrobiologii Lekarskiej WUM oraz 16 próbek surowicy krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego, pobranych od pacjentów z Kliniki Neurologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego w latach 2008-2010. Izolację DNA przeprowadzono przy użyciu zestawu High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics ), zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta, zawieszając wyizolowane DNA w końcowej objętości 35 µl buforu elucyjnego. Wszystkie opisane powyżej badania prowadzono w dwukrotnych, niezależnych powtórzeniach. WYNIKI W opracowanej metodzie real-time PCR wynik dodatni, wyrażony wykładniczym przyrostem fluorescencji mieszaniny reakcyjnej, osiągnięto tylko w próbkach zawierających materiał genetyczny ludzkich wirusów opryszczki typu 1 i 2. W pozostałych próbkach, zawierających kontrolne DNA niezakażonej linii Vero, wirusa ospy wietrznej/półpaśca, wirusa cytomegalii, wirusa Epsteina-Barr oraz adenowirusa typu 7, nie zaobserwowano fluorescencji, co wskazuje na brak w nich swoistej amplifikacji kwasu nukleinowego. Obserwacja taka poczyniona dla próbek zawierających materiał genetyczny innych wirusów świadczy o wysokiej specyficzności metody (Ryc.1 i 2). Podczas określania zakresu czułości metody technika real-time PCR umożliwiała wykrycie DNA HSV-1 we wszystkich użytych rozcieńczeniach, zaś DNA HSV-2 zakresie od 10 0 do 10-4 (Ryc.3 i 4). W rozcieńczeniu 10-5 preparatu DNA wirusa opryszczki typu 2
258 E. Chudzik i inni Nr 3 Ryc.1 Wynik reakcji real-time PCR w kierunku wykrywania ludzkiego wirusa opryszczki typu 1. Krzywa oznaczona HSV-1 oznacza amplifikację DNA wirusa opryszczki typu 1. Wykres K (-) to kontrola ujemna (DNA izolowane z niezakażonej linii Vero), zaś wykresy: HSV-2, VZV, CMV, EBV oraz HAdV7 oznaczają kontrole specyficzności reakcji. Ryc.2 Wynik reakcji real-time PCR w kierunku wykrywania ludzkiego wirusa opryszczki typu 2. Krzywa oznaczona HSV-2 oznacza amplifikację DNA wirusa opryszczki typu 2. Wykres K (-) to kontrola ujemna (DNA izolowane z niezakażonej linii Vero), zaś wykresy: HSV-1, VZV, CMV, EBV oraz HAdV7 oznaczają kontrole specyficzności reakcji.
Nr 3 Wykrywanie wirusów opryszczki metodą real- time PCR 259 Ryc.3 Badanie czułości metody real-time PCR w kierunku wykrywania HSV-1. Poszczególne krzywe oznaczają amplifikację DNA seryjnych rozcieńczeń szczepu McIntyre w zakresie od 10 0 do 10-5. Wykres K (-) to kontrola ujemna reakcji: DNA izolowane z niezakażonej linii Vero. nie wykryto, jednak odpowiada ono wiremii na poziomie kilkudziesięciu kopii na mililitr badanego materiału (Ryc.4). Ryc.4 Badanie czułości metody real-time PCR w kierunku wykrywania HSV-2. Poszczególne krzywe oznaczają amplifikację DNA seryjnych rozcieńczeń szczepu MS w zakresie od 10 0 do 10-4. Wykres K (-) to kontrola ujemna reakcji: DNA izolowane z niezakażonej linii Vero. W użytej do porównania metodzie PCR połączonej z rozdziałem elektroforetycznym produktów (4) uzyskano także specyficzną amplifikację sekwencji HSV 1/2. Jednak roz-
260 E. Chudzik i inni Nr 3 cieńczenia DNA obu typów wirusa opryszczki amplifikowane konwencjonalną metodą PCR, dawały wynik dodatni w postaci widocznych prążków w żelu agarozowym wyłącznie w zakresie rozcieńczeń od 10 0 do 10-3 (Ryc.5). Ryc.5 Badanie czułości tradycyjnej metody PCR w kierunku wykrywania i różnicowania wirusów opryszczki typu 1 i 2. Poszczególne ścieżki elektroforetogramu oznaczają DNA pochodzące z seryjnych rozcieńczeń HSV-1/2 w zakiesie od 10 0 do 10-5 ; K (-) to kontrola ujemna reakcji - DNA izolowane z niezakażonej linii Vero; marker - wzorce masowe DNA 100 bp oraz 1 kbp (Invitrogen ). Izolaty z hodowli komórkowych oraz próbki kliniczne poddano opracowanej reakcji real-time PCR z użyciem sond fluoroscencyjnych typu HybProbe. Wzrost poziomu fluorescencji, będący następstwem przyrostu ilości produktu w mieszaninie zaobserwowano we wszystkich próbkach zawierających DNA izolowane ze szczepów wirusa namnożonych w hodowli komórkowej (31 określono jako HSV-1, a 3 jako HSV-2) oraz w 10 materiałach klinicznych (wszystkie typowano jako HSV-1). Pozostałe 6 próbek pochodzących od osób z podejrzeniem neuroinfekcji nie wykazało przyrostu fluorescencji podczas amplifikacji, co świadczy o braku w nich obecności sekwencji DNA typowych dla ludzkich wirusów opryszczki. DYSKUSJA Wirusy opryszczki typu 1 i 2 wywołują powszechne na całym świecie zakażenia o zróżnicowanym nasileniu i objawach, które często przybierają charakter atypowy i uogólniony. Dodatkowy problem stanowi fakt, że wirusy te po zakażeniu pierwotnym ustalają stan latencji w komórkach nerwowych, z których mogą ulec reaktywacji (14, 15). Częstość nawrotów oraz intensywność choroby zależą od wydolności układu immunologicznego gospodarza, zarówno od odpowiedzi humoralnej, jak i komórkowej (14).
Nr 3 Wykrywanie wirusów opryszczki metodą real- time PCR 261 Neuroinfekcje, w tym opryszczkowe zapalenie mózgu (herpes simplex encephalitis HSE) wciąż stanowią poważny problem diagnostyczny. Powszechnie stosowane testy ELISA wykazują niewielką skuteczność, zarówno z powodu niskiego poziomu przeciwciał anty-hsv w płynie mózgowo-rdzeniowym, jak i małej specyficzności w różnicowaniu serotypów wirusa (7). Pewna rolę mogą tu odgrywać metody diagnostyki obrazowej jak CT, MRI, EEG, czy badania CSF pod kontem zawartości leukocytów i białek, choć te testy nie wykazują się zbyt dużą czułością (np. EEG zaledwie 32,5%) (13). Mogą być one natomiast skuteczne w połączeniu z innymi badaniami (15). Często stosowana niegdyś biopsja mózgu, wyparta została przez technikę PCR, która jest obecnie metodą z wyboru w diagnostyce HSE (8). Wariant real-time PCR prócz zwiększonej czułości, umożliwia również określenie ilości kopii DNA wirusa w badanej próbce (11). Aspekt ten jest bardzo przydatny przy określaniu obciążenia wirusem (viral load), co pozwala na monitorowanie statusu pacjentów podczas terapii antywirusowej (11). Miano wirusa we krwi może być także pomocne przy określaniu jego patogenności (3). Większość negatywnych opinii dotyczących metodyki qpcr odnosi się do wysokiego kosztu zarówno samego urządzenia, jak i jego eksploatacji. Są to jednak pozory, udowodniono bowiem, że zakup nowej aparatury pozwala często znacznie obniżyć czas i koszty związanie ze zleceniami badań innemu laboratoriom (10). Uzyskane rezultaty sugerują możliwość zastosowania real-time PCR do wykrywania i różnicowania zakażeń wywołanych przez wirusy opryszczki pospolitej, szczególnie w przypadkach nauroinfekcji i u pacjentów z niedoborami odporności. Obecnie w Polsce rozpoznanie zakażeń o etiologii opryszczkowej dokonuje się głównie na podstawie objawów klinicznych, co może prowadzić do błędów i pomyłek z innymi infekcjami wirusowymi. Nieprawidłowa diagnoza może skutkować wdrożeniem błędnego leczenia, poza tym szybkie rozpoznanie czynnika etiologicznego wpływa w znacznym stopniu na rokowania pacjenta i zwiększa jego szanse na wyleczenie. Opracowana technika wydaje się być szczególnie przydatna przy wykrywaniu zakażeń centralnego układu nerwowego, gdzie wirus występuje w bardzo niskich mianach. Ze względu na wysoką swoistość, czułość i szybkość detekcji mogłaby stać się metodą z wyboru w przypadku zakażeń CNS (1). E.Chudzik, K.Karabin, T. Dzieciątkowski, M. Przybylski, A.Majewska, A.Midak-Siewirska, G. Młynarczyk Development of a novel real-time PCR method for detection of HSV types 1 and 2 DNA using HybProbe chemistry SUMMARY Herpes simplex viruses types 1 and 2 are members of the Alphaherpesviridae subfamily, as they can infect both skin and nerves and develop latent infection within the dorsal root and trigeminal ganglia. Infections with these viruses are common worldwide and cause wide range of clinical syndromes. Although HSV-1/2 infect healthy children and adults, disease is more severe and extensive in the immunocompromised individuals and/or during neuroinfections. The aim of the study was development of real-time PCR assay for detection and differentiation of herpes simplex viruses type 1 and 2. DNA in clinical samples, using specific dual-channel HybProbe chemistry. The nalytical
262 E. Chudzik i inni Nr 3 sensitivity of assay was tested using serial dilutions of HSV-1 and HSV-2 DNA in range between 10 0 and 10-5 (4,35x10 5-4,00x10 2 copies/ml and 4,18x10 5-3,82x10 2 copies/ml, respectively). Thirty four cell line isolates and sixteen clinical samples taken from a group of adult patients with neurological signs were tested for the presence of HSV-1/2 DNA in the LightCycler instrument. Described inhouse real-time PCR assay detected herpesviral DNA in all cell line isolates (31 of them were HSV-1 positive; 3 were HSV-2 positive) and in 10 clinical samples (positive only for HSV-1). The conclusion is that developed HybProbe-based real-time PCR test is very reliable and valuable tool for detection and differentiation of HSV-1/2 viremia in different kind of samples. The high level of sensitivity and accuracy provided by this assay is favorable for the quantification of herpes simplex virus 1 and 2 DNA in clinical specimens, especially during low-copy infections. PIŚMIENNICTWO 1. Drago L, Lombardii A, Vecchi ED i inni. Comparison of nested PCR and real-time PCR of herpesvirus infections of central nervous system in HIV patients. BMC Infect Dis; 2004; 4: 1-5. 2. Huppatz C, Durrheim DN, Levi C i inni. Etiology of encephalitis in Australia, 1990-2007. Emerg Infect Dis; 2009; 15: 1359-65. 3. Kawada J, Kimura H, Ito Y i inni. Comparison of real-time PCR and nested PCR assays for detection of herpes simplex virus DNA. Microbiol Immunol; 2004; 48: 411-5. 4. Kimura H, Shibata M, Kuzushima K i inni. Detection and direct typing of herpes simplex virus by polymerase chain reaction. Med Microbiol Immunol (Berl.); 1990; 179: 177-84. 5. Li JZ, Sax PE. HSV-1 encephalitis complicated by cerebral hemorrhage in an HIV-positive person. AIDS Read; 2009; 19: 153-5. 6. Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. Real-time PCR in virology. Nucl Acids Res; 2002; 30: 1292-305. 7. Madhavan HN, Priya K, Anand AR i inni. Detection of herpes simplex virus (HSV) genome using polymerase chain reaction (PCR) in clinical samples. Comparison of PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV. J Clin Virol; 1999; 14: 145-51. 8. Matar GM, Khoudoud W A, Fayad M i inni. Herpes simplex encephalitis casus with typical and atypical symptoms confirmed by PCR-amplification of the DNA polymerase gene. Eastern J Med; 2000; 5: 70-2. 9. Puchhammer-Stöckl E, Popow-Kraupp T, Heinz FX i inni. Establishment of PCR for the early diagnosis of herpes simplex encephalitis. J Med Virol; 1990; 32: 77-82. 10. Rand K, Houck H, Lawrence R. Real-time polymerase chain reaction detection of herpes simplex virus in cerebrospinal fluid and cost savings from earlier hospital discharge. J Mol Diagn; 2005; 7: 511-6. 11. Schloss L, Falk KI, Skoog E i inni. Monitoring of herpes simplex virus DNA types 1 and 2 viral load in cerebrospinal fluid by real-time PCR in patients with herpes simplex encephalitis. J Med Virol; 2009; 81: 1432-7. 12. Tang JW, Coward LJ, Davies NWS i inni. Brain stem encephalitis caused by primary herpes simplex 2 infection in a young woman. J Neurol Neurosurg Psych; 2003; 74: 1323-5. 13. Ustymowicz A, Łukaszewicz A, Tarasów E i inni. Diagnostyka obrazowa opryszczkowego zapalenia mózgu u dorosłych. Pol Przegl Neurol; 2006; 2: 27-31. 14. Whitley RJ, Roizman B. Herpes simplex viruses. W: Clinical virology. Red. D.D. Richman, R.J. Whitley, F.G. Hayden, ASM Press, Washington 2002, 375-401. 15. Whitley RJ. Herpes simplex encephalitis: adolescents and adult. Antiviral Research; 2006; 71: 141-8. Otrzymano: 8 VI 2010 r. Adres autora: 02-004 Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny