Mikroskopia fluorescencyjna Komórki osteoblastomy, fot: J.Korczyński
Podział mikroskopów Optyczne Elektronowe Inne... - świetlny - polaryzacyjny - fluorescencyjny - konfokalny - transmisyjny (TEM) - skaningowy (SEM) - sił atomowych (AFM) - akustyczny - holograficzny
Fluorescencja Co to jest fluorescencja?
Fluorescencja Wzbudzenie i emisja barwnika FITC Diagram Jabłońskiego
Przykłady fluorescencji Mikroskopia fluorescencyjna??? Astrocyty. Autor: dr H.Mansour, University of Syndey
Przykłady fluorescencji Mikroskopia fluorescencyjna Zabezpieczenia banknotów??
Przykłady fluorescencji Mikroskopia fluorescencyjna Zabezpieczenia banknotów Lampy fluorescencyjne (świetlówki)? W świetlówce światło emituje luminofor, wzbudzony przez promieniowanie, powstałe wskutek wyładowania elektrycznego w rurze wypełnionej gazem.
Przykłady fluorescencji Mikroskopia fluorescencyjna Zabezpieczenia banknotów Lampy fluorescencyjne (świetlówki) F F I inne... Fluorescencja chlorofilu zdjęcie z satelity ORBVIEW pokazuje globalną koncentracje chlorofilu w wodach oceanu.
Przykłady fluorescencji Mikroskopia fluorescencyjna Proszek do prania oglądany w świetle dziennym... Zabezpieczenia banknotów Lampy fluorescencyjne (świetlówki) I inne......i w świetle UV.
Przykłady fluorescencji Mikroskopia fluorescencyjna Zabezpieczenia banknotów Fluoryt w świetle dziennym i świetle UV. Lampy fluorescencyjne (świetlówki) I inne...
Fluorescencyjny mikroskop Zwierciadło dichroiczne Filtr barierowy 2015-04-13
Fluorescencyjny mikroskop Wzbudzenie i emisja barwnika FITC
Barwniki fluorescencyjne Stosowane fluorochromy: - Małe molekuły (zwykle z pierścieniem aromatycznym) - Białka fluorescencyjne - Kropki kwantowe (QD) Fluoresceina (FITC) Rodamina
Barwniki fluorescencyjne Zasady fotoaktywacji Mechanizm konwersji barwnika fluorescencyjengo Kaede
Barwniki fluorescencyjne Zasady fotoaktywacji Ruch białek zlokalizowanych w błonie ER znakowanych pagfp (J.Runions, Univ. of Cambridge, UK) Mechanizm konwersji barwnika fluorescencyjengo Kaede
Barwniki fluorescencyjne Stosowane fluorochromy: - Małe molekuły (zwykle z pierścieniem aromatycznym) - Białka fluorescencyjne - Kropki kwantowe (QD)
2008 Nagroda Nobla z dziedziny chemii Za odkrycie i badania nad rozwojem Green Fluorescence Protein (GFP) Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien GFP (wt) 395/475 509 Green Fluorescent Proteins EGFP 484 507 Orange Fluorescent Proteins Kusabira Orange 548 559 Emerald 487 509 Kusabira Orange2 551 565 Superfolder GFP 485 510 morange 548 562 Azami Green 492 505 morange2 549 565 mwasabi 493 509 dtomato 554 581 TagGFP 482 505 dtomato-tandem 554 581 TurboGFP 482 502 TagRFP 555 584 AcGFP 480 505 TagRFP-T 555 584 ZsGreen 493 505 DsRed 558 583 T-Sapphire 399 511 Blue Fluorescent Proteins DsRed2 563 582 EBFP 383 445 DsRed-Express (T1) 555 584 EBFP2 383 448 DsRed-Monomer 556 586 Azurite 384 450 mtangerine 568 585 mtagbfp 399 456 Red Fluorescent Proteins Cyan Fluorescent Proteins mruby 558 605 ECFP 439 476 mapple 568 592 mecfp 433 475 mstrawberry 574 596 Cerulean 433 475 AsRed2 576 592 CyPet 435 477 mrfp1 584 607 AmCyan1 458 489 JRed 584 610 Midori-Ishi Cyan 472 495 mcherry 587 610 TagCFP 458 480 HcRed1 588 618 mtfp1 (Teal) 462 492 mraspberry 598 625 Yellow Fluorescent Proteins dkeima-tandem 440 620 EYFP 514 527 HcRed-Tandem 590 637 Topaz 514 527 Venus 515 528 mplum 590 649 mcitrine 516 529 AQ143 595 655 YPet 517 530 TagYFP 508 524 PhiYFP 525 537 ZsYellow1 529 539 mbanana 540 553
Badania przyżyciowe Glioma C6 Hipokamp szczura
Badania przyżyciowe Źródło: New Scientist
Barwniki fluorescencyjne Stosowane fluorochromy: - Małe molekuły (zwykle z pierścieniem aromatycznym) - Białka fluorescencyjne - Kropki kwantowe (QD) Kropki kwantowe (ang. quantum dots - QD) są to półprzewodnikowe nanokryształy o wielkości od 2-10 nm. Ograniczona liczba atomów oraz średnica kilku nanometrów daje kropkom kwantowym wyjątkowe właściwości absorpcji i emisji promieniowania
Aplikacje w mikroskopii fluorescencyjnej
Obrazowanie przyżyciowe
Obrazowanie przyżyciowe Kontrola środowiska: Nowy inkubator Pecon: oświetlenie, blokada światła lasera Ogrzewany stolik (Tokai) Kontrola temp. i CO 2 zintegrowana w programie LAS X. Glejak C6, fot. J.Korczynski
Obrazowanie przyżyciowe Chamber slides (Lab-Tek) Glass bottom Petri dishes Ludin chambers, heating stages etc.
Obrazowanie przyżyciowe Automatyczny podajnik immersji wodnej (Water microdispenser) Długotrwałe eksperymenty z immersją wodną Sterowanie z poziomu programu LAS X
Obrazowanie przyżyciowe Zmotoryzowana korekcja obiektywu dla grubości szkiełka.
Intensywność fluorescencji Pomiar intensywności barwienia immunofluorescencyjnego R&D Systems protocol
Intensywność fluorescencji Pomiar intensywności barwienia immunofluorescencyjnego LAS AF
Badanie ilości białek Technika Western blot Źródło: Leinco Technologies Inc.
Badanie ilości białek Technika Western blot Sondy fluorescencyjne Źródło: Abcam Co.
Pomiary wapniowe
Obraz ratio pokazuje zmiany w poziomie wewnątrzkomórkowego wapnia. Pomiary wapniowe FURA AM barwnik fluorescencyjny wrażliwy na stężenie wapnia exc. 340 nm stężenie wapnia związanego exc. 380 nm stężenie wolnych jonów wapnia
Pomiary wapniowe Reakcja wapniowa po stymulacji receptora P2Y 2 za pomocą UTP była mierzona na powiomie subkomórkowym za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Leica AF7000. UTP UTP Reakcja wapniowa w komórkach z blokadą ROCK. Ratio 340 / 380
Kolokalizacja Pomiar współwystępowanie receptorów P2Y 2 z integrynami α V β 5 Komórki kontrolne Czerwony α V β 5, zielony P2Y 2 Rs LAS AF Boulte et al. Journal of Microscopy, 2006
Kolokalizacja Pomiar współwystępowanie receptorów P2Y 2 z integrynami α V β 5 Komórki kontrolne Czerwony α V β 5, zielony P2Y 2 Rs
Mikroskopia konfokalna dr Jarosław Korczyński Specjalista ds. mikroskopii
Zobaczyć niewidoczne Podział komórki - metafaza Mikroskopy konfokalne osiągnęły limit rozdzielczości określonej dla mikroskopii świetlnej przez Ernsta Abbego 2015-04- 13 22:09
Mikroskopia konfokalna Marvin Minsky wynalazca i konstruktor pierwszego mikroskopu konfokalnego (1955) Idealny mikroskop świetlny powinien: - Odcinać światło nie pochodzące z płaszczyzny ostrości obiektywu. - Skanować preparat punkt po punkcie. 2015-04-
Mikroskopia konfokalna Idealny mikroskop świetlny powinien: - Odcinać światło nie pochodzące z płaszczyzny ostrości obiektywu. - Skanować preparat punkt po punkcie. Marvin Minsky Zalety Lepsza rozdzielczość i kontrast Akwizycja cienkich skrawków optycznych próbki rekonstrukcja 3D
Mikroskopia konfokalna - Odcinać światło nie pochodzące z płaszczyzny ostrości obiektywu. - Skanować preparat punkt po punkcie. Marvin Minsky Glejak C6 Korczyński et. al. Acta Biochim Pol. 2011
Mikroskopia konfokalna Leica TCS SPE Leica TCS SP5 II Leica TCS SMD Leica TCS STED CW Leica TCS LSI
Mikroskopia konfokalna 2015-04-
Mikroskopia konfokalna Źródło światła Schemat Leica SP8
Źródło światła Laser Ściśle zdefiniowana dł. fali Wysoka moc światła Punktowe źródło światła AOTF (Acousto Optical Tunable Filter) Wybór danej długości fali światła Ustawianie intensywności światła 2015-04-
Źródło światła Laser Ściśle zdefiniowana dł. fali Wysoka moc światła Punktowe źródło światła AOTF (Acousto Optical Tunable Filter) Wybór danej długości fali światła Ustawianie intensywności światła Źródło światła White Light Laser Biały laser umożliwia wybór dowolnej długości fali światła wzbudzającego z dokładnością do 1 nm w zakresie od 470 nm do 670 nm.
Mikroskopia konfokalna Dzielnik wiązki 2015-04-
Dzielnik wiązki AOBS Dichroic mirrors 2015-04-
Dzielnik wiązki AOBS Wyższa transmisja Elektronicznie ustawiane zakresy Jedno stałe urządzenie (bez mechanicznych ruchów) Szybki czas przełączania (mikrosekundy) Do 8 linii światła wzbudzenia oraz emisji jednocześnie Kryształ AOBS 2015-04-
Mikroskopia konfokalna Fotodetektory Leica SP8 scheme 2015-04-
Fotodetektory Detektory spektralne: Płynna regulacja zakresu odbieranych fal Zapobiega nakładaniu się barwników na obrazie (crosstalk) Brak filtrów barierowych podwyższa jakość obrazu Fotopowielacz: Wzmocnienie słabego sygnału emisji Ochrona preparatu przed wyświecaniem
Aplikacje w mikroskopii konfokalnej: F-techniki
FRET (Förster resonance energy transfer) Thodor Förster - w 1946 roku opublikował w Naturwissenschaften artykuł dotyczący przeniesienia energii pomiędzy dwiema molekułami fluorochromu w roztworze po wzbudzeniu jednej z nich. G. L. Liu et al. Nature Methods 4, 1015 (2007)
FRET FRET (Fluorescence/Forster resonance energy transfer) Bada mechanizm wymiany energii między dwoma wybarwionymi cząsteczkami (donor i akceptor) Przekazanie energii następuje bez emisji światła. Dystans między donorem a akceptorem: < 10 nm (prawdziwa kolokalizacja). Diagram Jabłońskiego Zasada oddziaływania FRET
FRET FRET zachodzi gdy: 1) widmo emisji fluorescencji donora pokrywa się z widmem absorpcji akceptora 2) odległość między cząsteczką donora a akceptora jest mniejsza niż 10 nm 3) gdy występuje odpowiednia, wzajemna orientacja między momentami dipolowymi przejścia dla emisji donora i absorpcji akceptora E wydajność FRET R 0 odległość Forstera r dystans między donorem a akceptorem Spektrum wzbudzenia i emisji dla białek CFP (donor) i YFP (akceptor). Nakładanie się spektrum emisji donora ze spektrum wzbudzenia akceptora zaznaczono na szaro.
FRET Black box Zapytanie Odpowiedź
FRET Black box Zapytanie Odpowiedź FRET?
FRET Acceptor Photobleaching PreBleach Image
FRET Acceptor Photobleaching Bleaching
FRET Acceptor Photobleaching PostBleach Image
FRET Acceptor Photobleaching Quantification Image
FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Technika do obserwacji ruchu wybarwionych cząstek na poziomie subkomórkowym. Używa się w tym celu silnego źródła światła wyświecającego fluorochromy w danym miejscu preparatu.
FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Dyfuzja koniugatu FITC-dekstran w wodzie. Ruch konstruktu H1-GFP w mysich fibroblastach in vivo FRAP: MF [%] = 103 Theory: MF [%] = 100 FRAP: MF [%] = 91 Theory: MF [%] = ~90 From: Kappel C., Eils R. FRAP with the Leica TCS SP2
FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Monitorowanie spadku fluorescencji w sąsiadujących obszarach podczas ciągłego wyświecania określonego miejsca.
FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Ocena ciągłości błon komórkowych Ocena płynności błon komórkowych - Komóki Mel JuSo z podjednostkami proteasomów znakowanych GFP - Sekwencyjne wyświecanie miejsca w cytoplazmie lub w jądrze w komórkach przez 180 min. - Intensywność fluorescencji pomiędzy jądrem, a cytoplazmą jest różna - Wniosek: Proteasomy nie dyfundują pomiędzy tymi obszarami (przez otoczkę jądrową) From: Lippincott-Schwartz J, et al., Photobleaching and photoactivation: following protein dynamics in living cells, Nat Cell Biol. 2003
FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) FISH metoda służąca do wykrywania w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji DNA za pomocą fluorescencyjnych sond. Procedura: Wyizolowanie jąder komórkowych Naniesienie fluorescencyjnej sondy DNA Denaturacja zerwanie wiązań pomiędzy nićmi DNA Inkubacja hybrydyzacja sond Odpłukanie sond i barwienie DAPI Źródło: Bishop R, Bioscience Horizons 2010
FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) Zastosowanie Diagnostyka chorób genetycznych Rozpoznawanie mikroorganizmów Badanie relacji ewolucyjnych między gatunkami Fish analysis di george syndrome autorstwa Adriano R Tonelli1, Kalyan Kosuri1, Sainan Wei2 and Davoren Chick1 - Seizures as the first manifestation of chromosome 22q11.2 deletion syndrome in a 40-year old man: a case report.
Wybór właściwego mikroskopu Cienki preparat? (<50 um) nie Czy jest z fluorescencją? tak Czy jest z fluorescencją? tak Fluorescencyjny tak nie Czy rozprasza światło? nie tak Ciemne pole Konfokal Czy jest kontrastująco Wybarwiony? tak Jasne pole nie Czy jest przeźroczysty? tak Kontrast fazowy lub DIC nie Czy zawiera kryształy? tak Polaryzacja Rubbi, C.P., 1994
Dziękuję za uwagę! jaroslaw.korczynski@kawaska.pl