ZASTOSOWANIE TECHNIKI MIKROMACIERZY TKANKOWYCH (TMA) W BADANIACH NAD MARKERAMI NOWOTWOROWYMI W RAKACH GRUCZOŁU PIERSIOWEGO

POSTĘPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM 39 2012 NR 3 (519 530) ZASTOSOWANIE TECHNIKI MIKROMACIERZY TKANKOWYCH (TMA) W BADANIACH NAD MARKERAMI NOWOTWOROWYMI W RAKACH GRUCZOŁU PIERSIOWEGO APPLICATION OF TISSUE MICROARRAY TECHNIQUE (TMA) IN NEOPLASTIC MARKERS STUDIES ON BREAST CANCERS Christopher KOBIERZYCKI¹, Agnieszka MALIŃSKA², Piotr DZIĘGIEL¹ ¹Katedra i Zakład Histologii i Embriologii, Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu, ²Katedra i Zakład Histologii i Embriologii, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu Streszczenie: Technika mikromacierzy tkankowych (TMA) została zaprezentowana po raz pierwszy przeszło 15 lat temu. Od tego czasu jej wykorzystanie systematycznie rośnie, a preparaty uzyskiwane przy jej pomocy spełniają wszelkie standardy wymagane do prowadzenia zawansowanych badań naukowych. W niniejszym artykule przedstawione zostaną metody tworzenia klasycznych TMA, jak i alternatywne rozwiązania proponowane przez niektórych autorów. Zaprezentowany zostanie również zarys badań naukowych dotyczących poszukiwania nowych markerów proliferacji komórek nowotworowych w rakach gruczołu piersiowego przy użyciu techniki TMA. Ponadto, omówione zostaną możliwości i trudności wynikające z zastosowania tej nowoczesnej metody. Celem artykułu jest zwrócenie uwagi na możliwość częstszego wykorzystania techniki mikromacierzy tkankowych do diagnostyki oraz badań naukowych prowadzonych w Polsce. Słowa kluczowe: mikromacierze tkankowe, TMA, markery proliferacyjne, rak gruczołu piersiowego Summary: The tissue microarray technique (TMA) was presented for the first time over 15 years ago. Since then, its use grows steadily and preparations achieved with its help meet all standards required to conduct advanced research. In this article methods for creating classic TMA and the alternative solutions proposed by some authors will be shown. An overview of research conducted with the use of TMA will be presented, concerning studies for new markers of tumor cell proliferation in breast cancers. Moreover further possibilities and difficulties arising from the use of this modern method will be discussed. This article aims to draw attention to the possibility of more frequent use of tissue microarray technique for diagnostic and research conducted in Poland. Key words: tissue microarrays, TMA, proliferation markers, breast cancer

520 CH. KOBIERZYCKI, A. MALIŃSKA, P. DZIĘGIEL OPIS METODY TWORZENIA MIKROMACIERZY TKANKOWYCH Technika mikromacierzy tkankowych (TMA, ang. Tissue microarray) została opisana po raz pierwszy przez Wan i wsp. w 1987 roku i była modyfikacją metody zaproponowanej przez H. Battifore w 1986 [2, 3, 49]. Ideą tego pomysłu było stworzenie pojedynczego bloczka parafinowego zawierającego materiał tkankowy licznych zmian nowotworowych. W roku 1998 J. Kononen z zespołem opracowali urządzenie, przy pomocy którego można manualnie, szybko oraz powtarzalnie wytwarzać TMA [26]. W 2001 roku ukazały się dwa obszerne artykuły autorstwa badaczy z Uniwersytetu Yale dotyczące konstruowania, wykorzystania oraz interpretowania wyników TMA [40, 41]. Obecnie dostępny jest również sprzęt do automatycznego oraz półautomatycznego tworzenia mikromacierzy tkankowych. Technika TMA polega na tworzeniu pojedynczych parafinowych lub mrożonych bloczków histologicznych zawierających materiał tkankowy pobrany z licznych badanych zmian. W klasycznej formie, preparatyka obejmuje bloczki parafinowe, jednak coraz częściej wykorzystywany jest materiał mrożony. Decyzja związana z lokalizacją miejsca pobrania cylindrycznego rdzenia tkanki (ang. tissue core) jest podejmowana przez patologa na podstawie wcześniejszej oceny preparatu barwionego metodą hematoksylina eozyna. Za pomocą specjalnej igły (ang. punch) z obszaru zainteresowania, oznaczonego na szkiełku podstawowym markerem, pobierany jest analogiczny fragment tkanki badanej, który zostaje umieszczony w uprzednio przygotowanym bloczku z wydrążonymi lożami. Bloczki z których pobierany jest materiał nazywamy bloczkami dawcami (ang. donor blocks), podczas gdy bloczek przyjmujący, stanowiący TMA bloczkiem biorcą (ang. recipient block). Przygotowany w ten sposób bloczek TMA przechodzi kolejne, typowe etapy preparatyki histologicznej. Na skrawkach TMA poszczególne fragmenty tkanki (np. różne przypadki guzów) są reprezentowane przez histiospoty cylindryczne rdzenie pobranych tkanek o średnicy od 0,6 do 3 mm. W zależności od wielkości użytej do przygotowań igły, rozkładu histiospotów na tworzonym bloczku oraz ilości próbek pobranych dla danego przypadku klinicznego pojedyncza macierz może zawierać do 1000 badanych zmian. Niezwykle istotne jest precyzyjne oznaczenie lokalizacji konkretnych przypadków klinicznych w tworzonej macierzy, aby możliwa była ich późniejsza analiza. Wykorzystanie techniki TMA w zestawieniu z licznymi danymi klinicznopatologicznymi wiąże się niejednokrotnie z rozbudowaną, czasochłonną oraz trudną analizą statystyczną [8, 13, 14, 25]. W pracach Krenacs i wsp. oraz Liu i wsp., zostały zaprezentowane podstawowe i zaawansowane metody oceny wyników uzyskanych techniką mikromacierzy [27, 30]. Poza klasyczną formą parafinową, coraz częściej proponuje się wykorzystanie materiału mrożonego. Jest on trudniejszy w preparatyce i tworzeniu mikromacierzy, jednak może dawać większy zakres możliwości badawczych. Poza

MIKROMACIERZE TKANKOWE W RAKACH PIERSI 521 metodami immunohistochemii (IHC) i immunofluorescencji (IF) można wówczas wykonać badania molekularne również na poziomie DNA oraz RNA [17, 22, 48]. Przygotowywanie TMA odbywa się zazwyczaj przy użyciu odpowiedniego sprzętu do tworzenia macierzy z wykorzystaniem aparatury manualnej, półautomatycznej lub automatycznej, dostępnej obecnie w ofercie różnych producentów sprzętu laboratoryjnego. Coraz częstszą praktyką staje się także stosowanie sprzętu niespecjalistycznego powszechnie występującego w laboratoriach lub zaadaptowanego do tych procedur. Ma to głównie na celu obniżenie kosztów tworzenia TMA. Jednym z powszechnie proponowanych tego typu rozwiązań jest pobieranie materiału do badań na etapie śródoperacyjnym przy pomocy standardowych igieł biopsyjnych [9, 12, 38, 54]. WYBRANE MARKERY W RAKACH GRUCZOŁU PIERSIOWEGO W diagnostyce raka gruczołu piersiowego rutynowo oraz często dodatkowo oznaczanymi markerami prognostyczno-predykcyjnymi są: receptory estrogenowe (ER), progesteronowe (PgR) oraz naskórkowego czynnika wzrostu 2 (Her-2); marker proliferacyjny antygen Ki-67; białka regulatorowe cyklu komórkowego biało p53, cykliny D1 i E; białka adhezji komórkowej m.in. kadheryny oraz białka związane z angiogenezą CD31, CD34; a także czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) [39, 47]. Ponadto, wciąż trwają liczne badania nad nowymi markerami o walorach wysokiej swoistości i czułości. W dwóch cytowanych pracach opisujących przegląd badań z tego zakresu, w oparciu o internetową bazę Pubmed, przeanalizowano ponad 600 prac związanych z badanymi markerami raka gruczołu piersiowego [29, 36]. W przedstawionej pracy skupiamy się na markerach proliferacyjnych, badanych przy użyciu techniki TMA powszechnie uznanego antygenu Ki-67 oraz na nowych markerach, których wartość prognostyczna i predykcyjna nie została jeszcze w pełni potwierdzona. Standardowo oznaczany marker proliferacyjny antygen Ki-67 jest wykorzystywany w diagnostyce i badaniach naukowych wielu nowotworów do oceny tzw. indeksu mitotycznego miary komórek aktywnie dzielących się. Ki-67 jest stosunkowo czułym markerem jednak w krytyce oznaczania jego ekspresji pojawiają się dwa argumenty niska swoistość oraz niepoznana funkcja [33]. Proponowane białka, zaangażowane w proliferację komórkową, mogące potencjalnie znaleźć zastosowanie w diagnostyce onkologicznej raka gruczołu piersiowego, to m.in. przedstawiciele rodziny białek MCM (ang. Minichromosome Maintenance Proteins). Należą one do związków wysoce konserwatywnych w swojej budowie i biorą udział w tworzeniu oraz stabilizacji widełek replikacyjnych. Ich fizjologiczna ekspresja gwarantuje jeden podział materiału genetycznego w jednym cyklu komórkowym [37]. Kolejnym intensywnie badanym

522 CH. KOBIERZYCKI, A. MALIŃSKA, P. DZIĘGIEL białkiem jest mitozyna białko centromerowe, obecne w późnej fazie G1, S oraz M, a nieobecne w fazie G0. Jest ono odpowiedzialne za prawidłową segregację chromatyd w procesie podziału, a zaburzenia jej budowy i funkcji przejawiają się zatrzymaniem procesu podziału komórkowego [11, 42]. Badania z wykorzystaniem mitozyny, podobnie jak w przypadku kolejnego białka telomerazy, są jeszcze na bardzo wstępnym etapie. Telomeraza jest enzymem zapobiegającym skracaniu się telomerów, skrajnych części chromosomów, wraz z każdym kolejnym cyklem podziałowym. Rezultaty badań w zakresie biologii nowotworów, sugerują wzrost jej ekspresji w komórkach guza nowotworowego, jednak eksperymenty prowadzone m.in. przez Winnikow i wsp. wykazały dużą heterogenność ekspresji telomerazy, co daje niespójny obraz jej ewentualnego zastosowania [51]. MOŻLIWOŚCI WYKORZYSTANIA I TWORZENIA MIKROMACIERZY TKANKOWYCH Powszechne stosowanie TMA w zaawansowanych naukowo laboratoriach na świecie spowodowało zastępowanie konwencjonalnego układu jeden skrawek jeden przypadek przez układ, w którym na jednym skrawku analizowane są dziesiątki lub setki zmian. W zależności od celu prowadzonych badań oraz zastosowanej preparatyki ocenie podlega RNA, DNA bądź ekspresja białka [8, 20]. Prowadzone obecnie badania z wykorzystaniem TMA można generalnie podzielić na dwie grupy badania porównujące w różnych aspektach technikę TMA z klasyczną metodą pełnych skrawków (WS, ang. whole sections) oraz badania analizujące głównie ekspresję markerów nowotworowych przy użyciu TMA w oparciu o dane kliniczno-patologiczne [8]. Pierwszy typ badań wykazuje w znacznej większości dużą lub bardzo dużą zgodność wyników uzyskiwanych przy użyciu zarówno metody WS jak i TMA [24, 47]. Kwestią sporną, nadal analizowaną w literaturze, pozostaje ilość próbek (ang. tissue core) pojedynczej zmiany na jednej tworzonej mikromacierzy. Generalną zasadą jest wykorzystanie pojedynczej próbki do tworzenia TMA, jednak niektóre badania dowodzą, że zastosowanie ich większej liczby podnosi wiarygodność uzyskiwanych wyników. Rosen i wsp. zastosowali dwie próbki dla jednego przypadku, co podniosło powtarzalność wyników w odniesieniu do całych skrawków z 90 do 95% [43]. Analogiczne rezultaty uzyskały również zespoły Wärnberg i wsp. oraz Lin i wsp., które badały ekspresję receptorów ER, PgR oraz Her-2 na WS i TMA. Sugerują oni wykorzystanie do badań nawet do 3 rdzeni dla 1 przypadku [31, 50]. Takie postępowanie jest zalecane w odniesieniu do tkanek wykazujących wysoki stopień heterogenności, co z kolei jest cechą typową dla guzów nowotworowych. Ponadto w celu analizy stopnia heterogenności obszarów centralnych i obwodowych guzów piersi, Kyndi i wsp. przeprowadzili badania nad ekspresją ER, PgR oraz Her-2. Porównywali ekspresję ww. markerów w wytypowanych obszarach, przygotowanych przy użyciu TMA w odniesieniu do ekspresji na WS. We

MIKROMACIERZE TKANKOWE W RAKACH PIERSI 523 wszystkich zestawieniach TMA vs. WS wykazali oni silną korelację pomiędzy wynikami uzyskanymi obydwoma metodami [28]. Ponadto, Bolton i wsp. sugerują, aby do oceny tkanek o dużej heterogenności i zróżnicowanym rozkładzie ekspresji badanych antygenów wykorzystywać automatyczne programy do analizy obrazu, które po weryfikacji histopatologicznej, skwantyfikują wynik [5]. Uzyskiwanie tak powtarzalnych wyników w powyżej opisanych badaniach pierwszego typu sprawia, że technika TMA może być powszechnie używana w badaniach IHC do ustalania stężenia stosowanych przeciwciał, obiektywizowania stopnia nasilenia reakcji barwnej jak również znajdzie szerokie zastosowanie jako pozytywna oraz negatywna kontrola wewnętrzna. Stworzona mikromacierz pozwala porównywać liczne zmiany podczas pojedynczej oceny mikroskopowej, co znacząco ułatwia pracę patologa oszczędzając czas i zwiększając obiektywizm oceny. Ponadto, należy również wspomnieć o standaryzacji warunków reakcji dla wszystkich zmian na danym preparacie, co jest cechą typową dla TMA i również jedną z jej większych zalet. Pewne wątpliwości podczas wprowadzania do powszechnego użycia techniki TMA, budziła średnica igieł używanych do pobierania materiału. W dużych badaniach porównujących ekspresję antygenu Ki- 67 w TMA, utworzonych z rdzeni tkankowych różnych średnic, wykazano jednak, że TMA utworzone przy użyciu igieł o średnicy 0,6 mm są tak samo wiarygodne i reprezentatywne, jak te, do budowy których użyto igieł o większej średnicy [1, 19, 23]. Z kolei argumentem stawianym przeciwko powszechnemu stosowaniu techniki TMA, jest drogi sprzęt wykorzystywany do produkcji mikromacierzy. Powstały już jednak liczne prace pokazujące, że alternatywne metody pobrania materiału jak i tworzenia bloczka TMA są wiarygodne. Na przykład Vogel i Blutmann proponują, aby do pobrania materiału tkankowego używać typowych igieł biopsyjnych [54]. Ponadto Hidalgo i wsp. wykazali, że igły biopsyjne mogą być również z powodzeniem wykorzystywane do przygotowywania bloczków biorców [21]. Inna modyfikacja obniżająca koszty produkcji TMA opiera się na zastosowaniu specjalnie przygotowanej taśmy klejącej, na której można osadzać rdzenie tkankowe, a następnie wspólnie je zatapiać w parafinie. Wyniki uzyskiwane metodami alternatywnego przygotowywania TMA są w pełni wiarygodne i powtarzalne [9, 12, 21, 38, 54]. WYKORZYSTANIE MIKROMACIERZY TKANKOWYCH DO OCENY PROLIFERACJI KOMÓREK RAKA GRUCZOŁU PIERSIOWEGO Inny rodzaj eksperymentów z wykorzystaniem techniki TMA stanowią badania porównujące ekspresję wybranych markerów nowotworowych z określonymi danymi kliniczno-patologicznymi. W perspektywie powtarzalnych wyników uzyskiwanych z porównawczych badań pierwszego typu (porównanie reakcji IHC na TMA z reakcjami na WS) zaczęto powszechnie wykorzystywać technikę TMA

524 CH. KOBIERZYCKI, A. MALIŃSKA, P. DZIĘGIEL do typowych badań oceny nasilenia ekspresji markerów nowotworowych. Metoda TMA daje możliwości analizy licznych grup przypadków w bardzo krótkim czasie, gwarantując standaryzację warunków prowadzonych reakcji (np. IHC). Zalety wykorzystania mikromacierzy tkankowych w powyżej prezentowanym typie badań widać doskonale w pracy Ruiz i wsp. [46]. W tym ważnym badaniu z 2006 roku, dokonano porównania ekspresji markerów nowotworowych za pomocą metod IHC i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w odniesieniu do klinicznego przebiegu choroby oraz danych patologicznych. Grupę badawczą stanowiło ponad 2200 pacjentek z rakiem gruczołu piersiowego. Do badań użyto 6 TMA przygotowanych z materiału parafinowego, przy użyciu igły o średnicy 0,6 mm. Już na tym etapie widać w jak znacznym stopniu zastosowana metoda zminimalizowała przede wszystkim czas przygotowania materiału do dalszej części badań. Przeprowadzono reakcje z wykorzystaniem metody IHC do oceny ekspresji ER, PgR, białka Bcl-2, receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), białka p16 i białka p53 oraz metody FISH w kierunku Her-2, białka Mdm-2, cykliny D1 (CcnD1) a także białka Myc. Bezsprzeczna jest ogromna oszczędność odczynników, którą uzyskano dzięki zastosowaniu TMA. Analiza statystyczna uzyskanych wyników wykazała silną dodatnią korelację ekspresji Ki-67 ze stopniem histologicznej złośliwości G oraz zajęciem węzłów chłonnych. Ponadto, pacjentki z nasiloną ekspresją antygenu Ki-67 charakteryzowały się znacznie krótszym okresem przeżycia. Dodatnie korelacje zaobserwowano również pomiędzy wzrostem ekspresji Ki-67 a ekspresją białka p53 i białka p16 oraz EGFR, a także wykazano ujemne korelacje pomiędzy ekspresją Bcl-2, ER i PgR. Wraz ze wzrostem ekspresji Ki-67 stwierdzono również amplifikację wszystkich markerów badanych metodą FISH. Opisane badania zostały zaprojektowane na wzór wcześniejszych eksperymentów prowadzonych na mniejszych grupach pacjentów bez użycia techniki mikromacierzy. W obu przypadkach uzyskano analogiczne rezultaty [10, 34, 45]. Otrzymane w ten sposób wyniki potwierdzają, że stosowanie metody TMA daje wiarygodne i powtarzalne rezultaty, a duża liczba jednoczasowo analizowanych przypadków powoduje, że analiza statystyczna uzyskanych wyników jest bardzo wiarygodna. Eksperyment ten bezwzględnie stanowi silne poparcie dla użyteczności metody TMA jako specyficznego narzędzia badawczego. W odniesieniu do proponowanych nowych markerów proliferacyjnych w rakach gruczołu piersiowego z zastosowaniem techniki TMA, jak do tej pory badane było wyłącznie białko MCM-2. Kobierzycki i wsp. wykazali silną ekspresję białka MCM-2 w komórkach raka gruczołu piersiowego oraz silną dodatnią korelację jego ekspresji z ekspresją antygenu Ki-67 (ryc. 1). Wyżej wymienieni autorzy w celu określenia wiarygodności metody TMA porównali otrzymane wyniki oceny stopnia ekspresji markerów proliferacyjnych: białka MCM-2 oraz antygenu Ki-67 na WS i TMA (r=0.87, p<0.05; r=0.91, p<0.05, odpowiednio). Dla porównania powtarzalności metod użyto także testu Bland-Altman a, który wykazał niski poziom odstępstwa wyników obu zastosowanych metod

MIKROMACIERZE TKANKOWE W RAKACH PIERSI 525 przygotowywania materiału [24]. W kontekście uprzednio przeprowadzonych badań [52], uzyskiwane wyniki dają nadzieję na wykorzystanie białka MCM-2 jako specyficznego i czułego markera proliferacji, między innymi w rakach gruczołu piersiowego. Według analizy dostępnej literatury medycznej, głównie w oparciu o bazę internetową Pubmed, inne badania nowych markerów proliferacyjnych raka gruczołu piersiowego z zastosowaniem techniki TMA nie zostały jeszcze przeprowadzone. A B µm µm RYCINA 1. Ekspresja antygenu Ki-67 (A) oraz białka MCM-2 (ang. Minichromosome Maintenance Protein 2) (B) w histiospotach TMA inwazyjnego raka gruczołu piersiowego [24]. Za zgodą Anticancer Research, International Journal of Cancer Research and Treatment FIGURE1. Expression of Ki-67 antigen (A) and MCM-2 protein (B) on TMA histiospots of invasive breast cancer [24]. With the consent of Anticancer Research, International Journal of Cancer Research and Treatment WYKORZYSTANIE MIKROMACIERZY TKANKOWYCH W METODZIE FLUORESCENCYJNEJ HYBRYDYZACJI IN SITU (FISH) Obok badań ekspresji różnych markerów przy użyciu techniki TMA z wykorzystaniem klasycznej IHC coraz częściej stosowana jest również metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH). Jest to technika molekularna, powszechnie używana w diagnostyce strukturalnych oraz ilościowych nieprawidłowości chromosomalnych, umożliwiająca wizualizowanie translokacji jak również amplifikacji i delecji w jądrze komórkowym w stadiach metafazy i interfazy [18]. Metoda ta jest równie często wykorzystywana w diagnostyce nowotworowej i okazuje się, że zastosowanie techniki TMA także umożliwia jej użycie. Stworzenie mikromacierzy tkankowych z archiwalnego materiału parafinowego do badań techniką FISH jest problematyczne [32]. Brown i Huntsman opisują w swojej pracy przygotowanie sond, hybrydyzację oraz potencjalne wykorzystanie metody FISH w aspekcie TMA [7]. Z kolei zespół

526 CH. KOBIERZYCKI, A. MALIŃSKA, P. DZIĘGIEL z Memorial Sloan-Kettering Cancer Center z Nowego Jorku, prowadząc badania na materiale 114 inwazyjnych raków gruczołu piersiowego porównywał stopień zgodności wyników oceny ekspresji markerów ER, PgR i Her-2 z TMA i WS metodą IHC. Ponadto do oceny receptora Her-2 użyto dodatkowo metody FISH. Dla ekspresji w IHC uzyskano zgodność na poziomie odpowiednio 97%, 89% i 86%, podczas gdy w przypadku FISH dla Her-2 uzyskano zgodność na poziomie 99%, uznając TMA za metodę w pełni wiarygodną dla tego typu badań [4]. Analogiczne rezultaty dotyczące IHC jak i FISH pod kątem białka Her-2 uzyskał Rossing i wsp., którzy dodatkowo analizowali uzyskane rezultaty z danymi kliniczno-patologicznymi badanych przypadków raka gruczołu piersiowego [44]. Rezultaty uzyskane w wyniku przeprowadzenia zaprezentowanych powyżej eksperymentów, stanowią dowód na możliwość wykorzystania techniki TMA bezpośrednio w procesie diagnostyczno-terapeutycznym pacjentów. Mimo możliwości wykonania badania FISH na materiale parafinowym, optymalną formą zabezpieczania materiału do badań molekularnych pozostaje utrwalanie metodą szybkiego głębokiego mrożenia [48]. Fejzo i wsp. w swoich pracach opisują metodykę przygotowywania tego typu macierzy mrożeniowych, a ponadto na podstawie uzyskanych wyników, w oparciu o dane literaturowe pokazują, że TMA przygotowywane z materiału mrożonego dają wiarygodne wyniki na poziomie analizy DNA, RNA oraz białek [15, 16, 55]. W kontekście licznych zastosowań jakie niesie ze sobą technika TMA, ważnym aspektem wydaje się być również możliwość wielokrotnego wykorzystania raz przygotowanej mikromacierzy tkankowej. Stworzony bloczek TMA stanowi swoistą bibliotekę zmian, a zarchiwizowane bloczki dawcy mogą być użyte zarówno do kolejnych pobrań, jak i ewentualnego ponownego badania histopatologicznego w celu np. weryfikacji rozpoznania [35, 53]. Ponadto mały rozmiar TMA sprawia, że mogą one być wykorzystywane do prowadzenia szkoleń, tworzenia zestawów porównawczodydaktycznych jak również wypożyczania innym jednostkom badawczym. PODSUMOWANIE Zespół z uznanego amerykańskiego ośrodka onkologicznego Bethesda Cancer Center uznaje, że technika mikromacierzy tkankowych jest typowym narzędziem medycyny translacyjnej, łączącej badania laboratoryjne z faktycznymi implikacjami klinicznymi [6]. Wykorzystanie TMA na większą skalę w przyszłości może pozwolić dokładnie profilować badania molekularne w kierunku poznawania nowych markerów prognostycznych i predykcyjnych w chorobach nowotworowych.

MIKROMACIERZE TKANKOWE W RAKACH PIERSI 527 PODZIĘKOWANIA Praca finansowana z projektu Narodowego Centrum Badań i Rozwoju, numer umowy NR13 0006 06/2009. LITERATURA [1] ANAGNOSTOU VK, LOWERY FJ, SYRIGOS KN, CAGLE PT, RIMM DL. Quantitative evaluation of protein expression as a function of tissue microarray core diameter: is a large (1.5 mm) core better than a small (0.6 mm) core? Arch Pathol Lab Med 2010; 134: 613-619. [2] BATTIFORA H. The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing. Lab Invest 1986; 55: 244-248. [3] BATTIFORA H, MEHTA P. The checkerboard tissue block. An improved multitissue control block. Lab Invest 1990; 63: 722-724. [4] BHARGAVA R, LAL P, CHEN B. Feasibility of using tissue microarrays for the assessment of HER- 2 gene amplification by fluorescence in situ hybridization in breast carcinoma. Diagn Mol Pathol 2004; 13(4): 213-6. [5] BOLTON KL, GARCIA-CLOSAS M, PFEIFFER RM, DUGGAN MA, HOWAT WJ, HEWITT SM, YANG XR, CORNELISON R, ANZICK SL, MELTZER P, DAVIS S, LENZ P, FIGUEROA JD, PHAROAH PD, SHERMAN ME. Assessment of automated image analysis of breast cancer tissue microarrays for epidemiologic studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2010; 19: 992-999. [6] BRAUNSCHWEIG T, CHUNG JY, HEWITT SM. Perspectives in tissue microarrays. Comb Chem High Throughput Screen 2004; 7(6): 575-85. [7] BROWN LA, HUNTSMAN D. Fluorescent in situ hybridization on tissue microarrays: challenges and solutions. J Mol Histol 2007; 38(2): 151-7. [8] CAMP RL, NEUMEISTER V, RIMM DL. A decade of tissue microarrays: progress in the discovery and validation of cancer biomarkers. J Clin Oncol 2008; 26: 5630-5637. [9] CHEN N, ZHOU Q. Constructing tissue microarrays without prefabricating recipient blocks: a novel approach. Am J Clin Pathol 2005; 124(1): 103-7. [10] CLAHSEN PC, VAN DE VELDE CJ, DUVAL C, PALLUD C, MANDARD AM, DELOBELLE- DEROIDE A, VAN DEN BROEK L, VAN DE VIJVER MJ. The utility of mitotic index, oestrogen receptor and Ki-67 measurements in the creation of novel prognostic indices for node-negative breast cancer. Eur J Surg Oncol 1999; 25: 356 63. [11] CLARK GM, ALLRED DC, HILSENBECK SG, CHAMNESS GC, OSBORNE CK, JONES D, LEE WH. Mitosin (a new proliferation marker) correlates with clinical outcome in node-negative breast cancer. Cancer Res 1997; 57(24): 5505-8. [12] DATTA MW, KAHLER A, MACIAS V, BRODZELLER T, KAJDACSY-BALLA A. A simple inexpensive method for the production of tissue microarrays from needle biopsy specimens: Examples with prostate cancer. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2005; 13: 96-103. [13] DHIR R. Tissue microarrays: an overview. Methods Mol Biol 2008; 441: 91-103. [14] FEDOR HL, DE MARZO AM. Practical methods for tissue microarray construction. Methods Mol Med 2005; 103: 89-101. [15] FEJZO MS, SLAMON DJ. Frozen tumor tissue microarray technology for analysis of tumor RNA, DNA, and proteins. Am J Pathol 2001; 159: 1645-1650. [16] FEJZO MS, SLAMON DJ. Tissue microarrays from frozen tissues-oct technique. Methods Mol Biol 2010; 664: 73-80. [17] FOWLER CB, MAN YG, ZHANG S, O LEARY TJ, MASON JT, CUNNINGHAM RE. Tissue microarrays: construction and uses. Methods Mol Biol 2011; 724: 23-35. [18] GRAHAM AD, FARATIAN D, RAE F, THOMAS JS. Tissue microarray technology in the routine assessment of HER-2 status in invasive breast cancer: a prospective study of the use of immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization. Histopathology 2008; 52(7): 847-55.

528 CH. KOBIERZYCKI, A. MALIŃSKA, P. DZIĘGIEL [19] GULBAHCE HE, GAMEZ R, DVORAK L, FORSTER C, VARGHESE L. Concordance Between Tissue Microarray and Whole-section Estrogen Receptor Expression and Intratumoral Heterogeneity. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2012; 20(4): 340-3. [20] HENSHALL S. Tissue microarrays. J Mammary Gland Biol Neopl 2003; 8(3): 347-58. [21] HIDALGO A, PIÑA P, GUERRERO G, LAZOS M, SALCEDO M. A simple method for the construction of small format tissue arrays. J Clin Pathol 2003; 56(2): 144 146. [22] JAWHAR NM. Tissue Microarray: A rapidly evolving diagnostic and research tool. Ann Saudi Med 2009; 29(2): 123-7. [23] KARLSSON C, BODIN L, PIEHL-AULIN K, KARLSSON MG. Tissue microarray validation: a methodologic study with special reference to lung cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2009; 18: 2014-2021. [24] KOBIERZYCKI C, PUŁA B, WOJNAR A, PODHORSKA-OKOŁÓW M, DZIĘGIEL P. Tissue microarray technique in evaluation of proliferative activity in invasive ductal breast cancer. Anticancer Res 2012; 32(3): 773-7. [25] KONG X, ZHAO Y, KSIONSK M, ZHOU M, WALDEN P, BOSLAND M, PEI Z, LEE P, MELAMED J. Radiographic determination of tissue thickness in paraffin blocks: application to the construction of tissue microarrays. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2007; 15(1): 108-12. [26] KONONEN J, BUBENDORF L, KALLIONIEMI A, BARLUND M, SCHRAML P, LEIGHTON S, TORHORST J, MIHATSCH MJ, SAUTER G, KALLIONIEMI OP. Tissue microarrays for highthroughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med 1998; 4: 844-847. [27] KRENACS T, FICSOR L, VARGA SV, ANGELI V, MOLNAR B. Digital microscopy for boosting database integration and analysis in TMA studies. Methods Mol Biol 2010; 664: 163-75. [28] KYNDI M, SØRENSEN FB, KNUDSEN H, OVERGAARD M, NIELSEN HM, ANDERSEN J, OVERGAARD J. Tissue microarrays compared with whole sections and biochemical analyses. A subgroup analysis of DBCG 82. Acta Oncol 2008; 47: 591-599. [29] LARI SA, KUERER HM. Biological Markers in DCIS and Risk of Breast Recurrence: A Systematic Review. J Cancer 2011; 2: 232-61. [30] LIU X, MININ V, HUANG Y, SELIGSON DB, HORVATH S. Statistical methods for analyzing tissue microarray data. J Biopharm Stat 2004; 14(3): 671-85. [31] LIN Y, HATEM J, WANG J, QUINN A, HICKS D, TANG P. Tissue microarray-based immunohistochemical study can significantly underestimate the expression of HER2 and progesterone receptor in ductal carcinoma in situ of the breast. Biotech Histochem 2011; 86(5): 345-50. [32] LORING P, CUMMINS R, O'GRADY A, KAY EW. HER2 positivity in breast carcinoma: a comparison of chromogenic in situ hybridization with fluorescence in situ hybridization in tissue microarrays, with targeted evaluation of intratumoral heterogeneity by in situ hybridization. Appl Immunohistochem Mol Morphol 2005; 13(2): 194-200. [33] LUPORSI E, ANDRE F, SPYRATOS F, MARTIN PM, JACQUEMIER J, PENAULT-LLORCA F, TUBIANA-MATHIEU N, SIGAL-ZAFRANI B, ARNOULD L, GOMPEL A, EGELE C, POULET B, CLOUGH KB, CROUET H, FOURQUET A, LEFRANC JP, MATHELIN C, ROUYER N, SERIN D, SPIELMANN M, HAUGH M, CHENARD MP, BRAIN E, DE CREMOUX P, BELLOCQ JP. Ki- 67: level of evidence and methodological considerations for its role in the clinical management of breast cancer: analytical and critical review. Breast Cancer Res Treat 2012; 132(3): 895-915. [34] MOLINO A, MICCIOLO R, TURAZZA M, BONETTI F, PIUBELLO Q, BONETTI A, NORTILLI R, PELOSI G, CETTO GL. Ki-67 immunostaining in 322 primary breast cancers: associations with clinical and pathological variables and prognosis. Int J Cancer 1997; 74: 433 7. [35] MUNIRAH MA, SITI-AISHAH MA, REENA MZ, SHARIFAH NA, ROHAIZAK M, NORLIA A, RAFIE MK, ASMIATI A, HISHAM A, FUAD I, SHAHRUN NS, DAS S. Identification of different subtypes of breast cancer using tissue microarray. Rom J Morphol Embryol 2011; 52: 669-677. [36] NOFECH-MOZES S, SPAYNE J, RAKOVITCH E, HANNA W. Prognostic and predictive molecular markers in DCIS: a review. Adv Anat Pathol 2005; 12(5): 256-64. [37] NOWIŃSKA K, DZIĘGIEL P. The role of MCM proteins in cell proliferation and tumorigenesis. Postepy Hig Med Dosw (Online) 2010; 64: 627-35. [38] PIRES AR, ANDREIUOLO FDA M, DE SOUZA SR. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagn Pathol 2006; 1: 14.

MIKROMACIERZE TKANKOWE W RAKACH PIERSI 529 [39] POTEMSKI R, KORDEK R. Prognostic significance of cyclin E in breast cancer. Onkologia w Praktyce Klinicznej 2005; 2(1): 76 82. [40] RIMM DL, CAMP RL, CHARETTE LA, COSTA J, OLSEN DA, REISS M. Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources. Cancer J 2001; 7(1): 24-31. [41] RIMM DL, CAMP RL, CHARETTE LA, OLSEN DA, PROVOST E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol 2001; 70(3): 255-64. [42] ROGALSKA SM, ACHREM M, KALINKA A. Proteins involved in proper chromatid segregation. Postepy Biologii Komorki 2008; 35(3): 315-332. [43] ROSEN DG, HUANG X, DEAVERS MT, MALPICA A, SILVA EG, LIU J. Validation of tissue microarray technology in ovarian carcinoma. Mod Pathol 2004; 17(7): 790-7. [44] ROSSING HH, TALMAN ML, LAENKHOLM AV, WIELENGA VT. Implementation of TMA and digitalization in routine diagnostics of breast pathology. APMIS 2012; 120(4): 341-7. [45] RUDOLPH P, MACGROGAN G, BONICHON F, FRAHM SO, DE MASCAREL I, TROJANI M, DURAND M, AVRIL A, COINDRE JM, PARWARESCH R. Prognostic significance of Ki-67 and topoisomerase IIa expression in infiltrating ductal carcinoma of the breast. A multivariate analysis of 863 cases. Breast Cancer Res Treat 1999; 55: 61-71. [46] RUIZ C, SEIBT S, AL KURAYA K, SIRAJ AK, MIRLACHER M, SCHRAML P, MAURER R, SPICHTIN H, TORHORST J, POPOVSKA S, SIMONR, SAUTER G. Tissue microarrays for comparing molecular features with proliferation activity in breast cancer. Int J Cancer 2006; 118(9): 2190-4. [47] SAPINO A, MARCHIÒ C, SENETTA R, CASTELLANO I, MACRÌ L, CASSONI P, GHISOLFI G, CERRATO M, D AMBROSIO E, BUSSOLATI G. Routine assessment of prognostic factors in breast cancer using a multicore tissue microarray procedure. Virchows Arch 2006; 449(3): 288-96. [48] TSAO SC, WU CC, WEN CH, HUANG YC, CHAI CY. A simple and economical method for the manual construction of frozen tissue arrays. APMIS 2010; 118: 739-43. [49] WAN WH, FORTUNA MB, FURMANSKI P. A rapid and efficient method for testing immunohistochemical reactivity of monoclonal antibodies against multiple tissue samples simultaneously. J Immunol Methods 1987; 103: 121-129. [50] WÄRNBERG F, AMINI RM, GOLDMAN M, JIRTSTRÖM K. Quality aspects of the tissue microarray technique in a population-based cohort with ductal carcinoma in situ of the breast. Histopathology 2008; 53(6): 642-9. [51] WINNIKOW EP, MEDEIROS LR, EDELWEISS MI, ROSA DD, EDELWEISS M, SIMÕES PW, SILVA FR, SILVA BR, ROSA MI. Accuracy of telomerase in estimating breast cancer risk: a systematic review and meta-analysis. Breast 2012; 21(1): 1-7. [52] WOJNAR A, KOBIERZYCKI C, KRÓLICKA A, PUŁA B, PODHORSKA-OKOŁÓW M, DZIĘGIEL P. Correlation of Ki-67 and MCM-2 proliferative marker expression with grade of histological malignancy (G) in ductal breast cancers. Folia Histochem Cytobiol 2010; 48(3): 442-6. [53] VODUC D, KENNEY C, NIELSEN TO. Tissue microarrays in clinical oncology. Semin Radiat Oncol 2008; 18(2): 89-97. [54] VOGEL UF, BÜLTMANN B. Application of a novel and low cost technique to construct paraffin tissue microarrays out of paraffinised needle biopsy specimens from patients with breast cancer. J Clin Pathol 2010; 63: 640-643. [55] ZHOU L, HODEIB M, ABAD JD, MENDOZA L, KORE AR, HU Z. New tissue microarray technology for analyses of gene expression in frozen pathological samples. Biotechniques 2007; 43(1): 101-5. Redaktor prowadzący M. Nowicki Otrzymano: 18.07.2012 Przyjęto: 31.07.2012 Christopher Kobierzycki Katedra i Zakład Histologii i Embriologii Uniwersytet Medyczny we Wrocławiu ul. Chałubińskiego 6a, 50-368 Wrocław tel.: (071) 784 00 81

530 CH. KOBIERZYCKI, A. MALIŃSKA, P. DZIĘGIEL fax: (071) 784 00 82 e.mail: christopher.kobierzycki@am.wroc.pl