FAKULTET - FIZJOLOGIA BAKTERII Koordynator - dr hab. Magdalena Popowska, prof. UW ĆWICZENIE: IDENTYFIKACJA GENÓW OPORNOŚCI NA TETRACYKLINĘ, STREPTOMYCYNĘ I ERYTROMYCYNĘ W WYBRANYCH BAKTERIACH GLEBOWYCH Autor i główny prowadzący dr hab. Magdalena Popowska, prof. UW Asysta: mgr Marta Piotrowska, mgr Rafał Ostrowski Wstęp teoretyczny TETRACYKLINA Antybiotyk należący do grupy tetracyklin; Działanie bakteriostatyczne; Wykazuje szerokie spektrum aktywności skierowane przeciw bakteriom gramdodatnim, gramujemnym, mikoplazmom, chlamydiom, riketsjom i niektórym pierwotniakom; Szeroko stosowana lecznictwie, weterynarii, przemyśle rolno-spożywczym. STREPTOMYCYNA Działanie bakteriobójcze; Antybiotyk aminoglikozydowy; Wykazuje szerokie spektrum działania wobec bakterii gramdodatnich, gramujemnych. Aktywna wobec prątków gruźlicy; Szerokie zastosowanie w lecznictwie i weterynarii. ERYTROMYCYNA Działanie bakteriostatyczne; Należy do grupy makrolidów; Wykazuje działanie w stosunku do bakterii gramdodatnich, gramujemnych ziarniaków, pierwotniaków, grzybów; Stosowana w lecznictwie, weterynarii, rolnictwie. 5
Geny nadające oporność na tetracyklinę podzielono na grupy: A) Geny kodujące białka błony cytoplazmatycznej o charakterze pomp: teta, tet B, tetc, tetd, tete, tetg, teth, teti, tetj, tetk, tetl, tetp/a, tetv, tety, tetz, tet30; B) Geny kodujące białka chroniące rybosomy przed działaniem tetracykliny: otra, tet, tetm, teto, tets, tetw, tetq, tett, tetp/b, tet 32; C) Geny kodujące enzymy modyfikujące tetracyklinę: tetx; D) Geny nadające oporność na tetracyklinę o nie znanej dotąd funkcji: tetu. Geny otra, tet są spotykane tylko u producentów. Geny oporności na streptomycynę: A) Geny kodujące enzymy modyfikujące streptomycynę: aac, aada2, aadk, stra, strb; B) Geny powodujące ograniczone wnikanie aminoglikozydów przez osłony bakteryjne: ecfb. Geny oporności na erytromycynę: A) Geny kodujące enzymy modyfikujące erytromycynę o aktywności metylazy: erma, erm B, ermc, ermd, erme, ermf, ermg, ermq, ermv, ermx; B) Geny kodujące białka z rodziny transporterów ABC: msra, msrb, oleb, srmb, vga; Cześć wymienionych wyżej genów znajduje się w chromosomie, a część w plazmidach, ponadto niektóre z nich są zlokalizowane w transpozonach i w formie kaset genowych w integronach, co zwiększa ich mobilność. Wykonanie ćwiczenia Izolacja bakterii, z badanych środowisk glebowych, opornych na wysokie stężenia tetracykliny, streptomycyny i erytromycyny 1. Próbki gleby należy zawiesić w roztworze soli fizjologicznej oraz dobrze wymieszać (1 g gleby/1ml RF). 2. Próby odwirować z wykorzystaniem mikrowirówki (1 min, 6 tyś. rpm), uzyskany supernatant wykorzystać jak inoculum, rozdzielić na dwie części, jedną przenieść do 20 ml płynnego podłoża Davisa (podłoże minimane), a drugą do bulionu odżywczego (podłoże pełne). 3. Hodowle inkubować z wytrząsaniem w temperaturze 30 o C przez okres 5-7 dni. Selekcja szczepów zdolnych do wzrostu na wybranych stężeniach badanych antybiotyków 6
1. Należy przygotować szalki z podłożem stałym (Agar odżywczy), zawierającym antybiotyki w następujących stężeniach: - 7 μg/ml dla tetracykliny - 5 μg/ml dla streptomycyny - 5 μg/ml dla erytromycyny 2. Na szalki należy wysiać, namnożone wcześniej bakterie na podłożu płynnym (ww. pkt. 3), pobierając 0,1 ml hodowli na każdą szalkę i dokładnie rozgłaskując za pomocą jałowych głaszczek. 3. Szalki inkubować w temperaturze 30 o C przez okres 3-5 dni. Następnie uzyskane kolonie bakterii rozsiać sektorowo na nową szalkę z analogicznym stężeniem antybiotyku. Badanie wrażliwości metodą krążkowo-dyfuzyjną (DD, ang. disk-diffusion) Metoda Analizę należy wykonać na podstawie wytycznych EUCAST (ang. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) (EUCAST, 2012). Metoda DD umożliwia określenie wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki, jak również aktywności leku, w stosunku do badanego szczepu. 1. Przygotowanie zawiesiny bakterii o gęstości 0,5 w skali McFarlanda. a) Za pomocą jałowej wymazówki należy pobrać niewielką ilości kolonii bakteryjnych, pochodzących z 24-godzinnych hodowli i zawiesić w jałowym roztworze RF (około 5 ml). b) Po dokładnym wymieszaniu (w celu uzyskania jednorodnego roztworu), za pomocą densytometru sprawdzić gęstość przygotowanej zawiesiny. 2. Przy użyciu jałowego wacika zawiesinę należy wysiać na podłoże MHA. 3. Po upływie kilku minut (nie więcej niż 15 min) za pomocą pęsety, należy nałożyć na podłoże krążki nasączone danym antybiotykiem (tetracyklina, streptomycyna, erytromycyna), o określonym stężeniu. 4. Szalki należy inkubować w warunkach tlenowych, w temperaturze 35±1 C, przez 16 20 godzin. 5. Odczyt dokonuje się poprzez pomiar stref zahamowania wzrostu bakterii wokół krążków z badanym antybiotykiem. 6. Stopień wrażliwości badanych szczepów należy określić ano na podstawie wytycznych EUCAST (2010/2011) lub/oraz rekomendacji CLSI (ang. Clinical and Laboratory Standards Institute) (CLSI, 2006). Izolacja całkowitego DNA z użyciem 0,25 % SDS-u i 0,05 M NaOH 1. Szczepy bakterii z szalki zawiesić przy pomocy jałowej ezy w probówkach Eppendorf, zawierających 20 μl roztworu 0,25 % SDS i 0,05 M NaOH. 7
2. Próby inkubować przez 15 min w termomikserze (Eppendorf) w 95 C, a następnie dodać 180 μl zimnej dd H 2 O. Uzyskany roztwór stanowi źródło matrycy DNA dla reakcji amplifikacji PCR. Metoda amplifikacji PCR 1. Przygotować próby do przeprowadzenia reakcji amplifikacji PCR - dd H 2 O 15,9 μl - dntp 0,5 μl - bufor do polimerazy Taq + (NH 4 ) 2 SO 4 MgCl 2 2,5 μl - 2,5 mm MgCl 2 2,5 μl - startery (nierozcieńczone) po 0,5 μl lewy i prawy - polimeraza Taq 0,1 μl 2. Program wykorzystany do przeprowadzenia reakcji PCR: (35 cykli) 94 C 05:00 min 94 C 00:30 min temperatura przyłączania starterów 00:30 min 72 C 01:00 min 72 C 07:00 min 4 C 0 - Elektroforeza w 0,8 % żelu agarozowym 1. Do każdej kieszonki, wcześniej przygotowanego, 0,8 % żelu agarozowego w 1x stężonym buforze TAE należy nanieść po 10 μl próbki (produktu amplifikacji PCR), do której wcześniej dodano bufor obciążający. Elektorforezę prowadzono przez 80 min (dla dużego żelu) lub 50 min (dla małego żelu) przy napięciu 110 V. 2. Po rozdziale elektroforetycznym żele powinny zostać umieszczone w wodnym roztworze bromku etydyny (ok. 10 min), a następnie wypłukane w wodzie (ok. 15 min). Wyniki rozdziału DNA będą wizualizowane w systemie Image Master VDS (Video Documentation System), firmy Amersham Pharmacia Biotech. Bufory i roztwory używane do elektorofrezy DNA - bufor TAE: 40 mm Tris base, 20 mm kwas octowy, 0,5 mm EDTA, ph 8,0-50 x stężony TAE, skład: 242 g Tris base; 57,1 ml kwas octowy; 100 ml 0,5 M EDTA; woda destylowana do 1 litra - bufor obciążający: 0,25% błękit bromofenolowy, 30% glicerol - roztwór wodny bromku etydyny w barwieniu DNA w żelach agarozowych o stężeniu końcowym 0,5 μg/ml - żele agarozowe: 0,8% agaroza rozpuszczona w buforze TAE 8
Literatura uzupełniająca: 1.Wykłady z Fizjologii Bakterii. Popowska M., Korsak D. 2. Bakterie, antybiotyki, lekooporność. Markiewicz Z., Kwiatkowski Z.A., PWN 2001 3. Chopra I., Roberts M. 2001. Tetracycline Antibiotics: Mode of Action, Applications, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65 (2):232-260 4. Leo S. van Overbeek et al. 2002. Prevalence of streptomycin-resistance genes in bacterial populationsin European habitats. FEMS Microbiology Ecology 42:277-288 5. Leclercq R. 2002. Mechanisms of Resistance to Macrolides and Lincosamides: Nature of the Resistance Elements and Their Clinical Implications. Clinical Infectious Diseases. 34(4):482-492. 6. Popowska M., Rzeczycka M., Miernik A., Krawczyk-Balska A., Walsh F., Duffy B. 2012. Influence of soil use on prevalence of tetracycline, streptomycin, and erythromycin resistance and associated resistance genes. Antimicrob. Agents Chemother. 56(3):1434-43. 7. Popowska M., Miernik A., Rzeczycka M., Łopaciuk A. 2010. The impact of environmental contamination with antibiotics on levels of resistance in soil bacteria. Journal of Environmental Quality. 39(5):1679-87. 9