The influence of an altered Prx III-expression to RINm5F cells Marta Michalska Praca magisterska wykonana W Zakładzie Medycyny Molekularnej Katedry Biochemii Klinicznej Akademii Medycznej w Gdańsku Przy współpracy z Instytutem Biochemii Medycznej i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Ernst-Moritz-Arndt w Greifswaldzie (Niemcy) Pod opieką Prof. Dr hab. med. Tadeusza Pawełczyka Prof. Rer. nat. Reinharda Walthera
Układ pracy Wstęp i cel pracy Wyniki 1. Ekspresja i supresja Peroksyredoksyny III w stabilnie transfekowanej linii komórkowej RINm5F 2. Indukcyjna syntaza tlenku azotu (inos) 3. Polimeraza poli(adp-rybozy) (PARP) 4. Mitochondrialny potencjał przezbłonowy ( ψ m ) 5. Produkcja i sekrecja insuliny Wnioski
Cukrzyca typ 1 Atak autoimmunologiczny Stres oksydacyjny Uszkodzenia mitochondrialne Destrukcja komórek β trzustki
Antyoksydacyjny system obronny SOD: Dysmutaza ponadtlenkowa Gpx: Peroksydaza glutationowa GR: Reduktaza glutationowa Prx: Peroksyredoksyna TrxR: Reduktaza tioredoksyny
Peroksyredoksyny Tiol-zaleŜna peroksydaza red. ox. ROOH S S NADPH+H + Peroksyredoksyna Tioredoksyna Reduktaza tioredoksyny S S ROH+H 2 O S S NADP + ox. red. Funkcje fizjologiczne: Antyoksydacyjna Ochrona przed stresem oksydacyjnym Transdukcja sygnału Proliferacja komórek, apoptoza
Peroksyredoksyny N-terminalna Cysteina: antyoksydacyjna funkcja enzymu C-terminalna Cysteina: Regeneracja, Dimeryzacja Podział: 1. typowe 2 Cys-Prxs: Prx 1, 2, 3, 4 2. atypowe 2 Cys-Prxs: Prx 5 3. 1 Cys-Prxs: Prx 6 Redoxaktywne Cys Konserwatywne Cys Lokalizacja: Cytoplazma, Mitochondria, Peroksysomy
Peroksyredoksyna III (Prx III) Człowiek AOP-1 antioxidant protein 1 Mysz MER5 murine erythroleukemia-related cdna Szczur Prx III peroxiredoxin III
Cele pracy Cytokiny ALL, STZ H 2 O 2 FADD inos RFT Caspase 8/10 ψ Cyto c PrxIII Apaf-1 Caspase 9 Caspase 3 Caspase 7 Spadek produkcji i sekrecji insuliny Apoptoza PARP
Indukcyjna ekspresja i supresja PeroksyredoksynyIII w stabilnie transfekowanej linii komórek RINm5F sens/antysens W stabilnie transfekowanej linii RINm5F PeroksyredoksynaIII ulega nadekspresji bądź supresji RT-PCR Western blot Rys.1 Tet-On-System w stabilnie transfekowanej linii komórek RINm5F-PrxIII sens/antysens Rys.2 Stabilnie transfekowana linia komórek RINm5F traktowana 4 dni +/- doxycykliną, a) 1 µg RNA wykorzystano do metody RT-PCR, b) 50 µg białka wykorzystano do metody Western blot dla pokazania ekspresji peroksyredoksyny III, przeciwciało przeciw PrxIII w rozcieńczeniu 1:1000 Tylko w obecności doksycykliny, transkrypcja genu peroksyredoksyny ulega aktywacji
PeroksyredoksynaIII redukuje indukcję syntazy tlenku azotu (inos) * # Rys.3 Indukcja syntazy tlenku azotu w stabilnie transfekowanej linii komórek RINm5F-PrxIII sens/antysens po 24h od zastosowania cytokin, 100U/ml TNFα, 50U/ml IL1β, 100U/ml IFNγ, 50 µg białka wykorzystano w metodzie Western blot, rozcieńczenie przeciwciał 1:10000 dla detekcji inos, 1:1000 dla detekcji GAPDH, mix oznacza kombinację cytokin TNFα, IL1β, IFNγ Rys.4 Analiza statystyczna indukcji inos w stabilnie transfekowanej linii komórek RINm5F po zastosowaniu cytokin, wyniki sąśrednimi z trzech niezaleŝnych eksperymentów +/- SE, *) p=0,0010, #) p=0,0023, mix oznacza kombinację cytokin TNFα, IL1β, IFNγ
PeroksyredoksynaIII chroni przed rozpadem polimerazy poli(adp-rybozy) (PARP) ± * # Rys.5 Rozpad PARP w stabilnie transfekowanej linii komórek RINm5F-PrxIII sens/antysens po 24h od zastosowania cytokin, 100U/ml TNFα, 50U/ml IL1β, 100U/ml IFNγ, 50 µg białka wykorzystano w metodzie Western blot, rozcieńczenie przeciwciał 1:1000 dla detekcji PARP, 1:1000 dla detekcji GAPDH, mix oznacza kombinację cytokin TNFα, IL1β, IFNγ Rys.6 Analiza statystyczna rozpadu PARP w stabilnie transfekowanej linii komórek RINm5F po zastosowaniu cytokin, wyniki sąśrednimi z trzech niezaleŝnych eksperymentów +/- SE, *) p<0,00010, #) p=0,131, ±) p=0,0315, mix oznacza kombinację cytokin TNFα, IL1β, IFNγ
Peroksyredoksyna III chroni przed rozpadem PARP # * Rys.7 Rozpad PARP w stabilnie transfekowanej linii komórek RINm5F-PrxIII sens/antysens po24h od zastosowania substancji diabetogennych i nadtlenku wodoru, 4mM ALL, 4mM STZ, 0,3% H 2 O 2, 50 µg białka wykorzystano w metodzie Western blot, rozcieńczenie przeciwciał 1:1000 dla detekcji PARP, 1:1000 dla detekcji GAPDH Rys.8 Analiza statystyczna rozpadu PARP w stabilnie transfekowanej linii komórek RINm5F po zastosowaniu STZ, wyniki sąśrednimi z trzech niezaleŝnych eksperymentów +/- SE, *) p=0,0499, #) p=0,0602
Mitochondrialny potencjał przezbłonowy ( ψ m ) Komórki z niskim potencjałem ψ
Mitochondrialny potencjał przezbłonowy ( ψ m ) RINm5F Prx III sens Prx III antysens Rys.9 Efekt STZ na mitochondrialny potencjał przezbłonowy w stabilnie transfekowanej linii komórkowej RINm5F, analiza została wykonana po 48h od zastosowania 4mM STZ, wykorzystano fluorochrom DIOC do określenia ψ przy uŝyciu cytometrii przepływowej, M1 określa granicę pomiędzy komórkami zdrowymi a obumarłymi
Produkcja insuliny w stabilnie transfekowanej linii komórkowej RINm5F PeroksyredoksynaIII chroni komórki β przed śmiercią i tym samym polepsza produkcję insuliny a) b) Rys.10 Efekt cytokin, H 2 O 2, STZ na ekspresję insuliny w stabilnie transfekowanej linii komórkowej RINm5F-PrxIII sens/antysens, 5 µg RNA wykorzystano w metodzie Nothern blot, cytokiny (100U/mlTNFα, 50U/ml IL1β, 100U/ml IFNγ), 0,3% H 2 O 2, 4mM STZ po 24 h a) komórki RINm5F-PrxIII sens, b) komórki RINm5F-PrxIII antysens Rys.11 Analiza statystyczna przedstawiająca produkcję insuliny w stabilnie transfekowanej linii komórkowej RINm5F-PrxIII sens/antysens, wyniki sąśrednimi z trzech niezaleŝnych pomiarów +/- SE, mix oznacza połączenie cytokin TNFα, IL1β, IFNγ
Sekrecja insuliny w stabilnie transfekowanej linii komórkowej RINm5F Stres oksydacyjny przewaŝa w linii komórkowej RINm5F z supresją peroksyredoksynyiii, podczas gdy nadekspresja tego enzymu chroni tylko przed nadtlenkiem wodoru Rys.12 Analiza statystyczna przedstawiająca sekrecję insuliny w stabilnie transfekowanej linii komórkowej RINm5F-PrxIII sens/antysens przy uŝyciu metody radioimmunologicznej (RIA), wyniki sąśrednimi z trzech niezaleŝnych pomiarów +/- SE, *) p=0,0490, mix oznacza połączenie cytokin TNFα, IL1β, IFNγ
Wnioski Enzym Peroksyredoksyna III odgrywa waŝną rolę podczas stresu oksydacyjnego jako zmiatacz wolnych rodników, chroniąc komórki β przed śmiercią i apoptozą Nadekspresja peroksyredoksyny III hamuje działanie cytokin (TNFα, IL1β, INFγ), diabetogennych substancji (alloxan, streptocotyny) oraz wolnych rodników Nadekspresja tego enzymu chroni takŝe przed aktywacją indukcyjnej syntazy tlenku azotu (inos), rozpadem polimerazy poli(adp-rybozy) (PARP), utrzymuje mitochondrialy potencjał przezbłonowy ( ψ m ), a tym samym zabezpiecza przed apoptozą Peroksyredoksyna III poprawia produkcję i sekrecję insuliny
Podziękowania Szczególne wyrazy wdzięczności naleŝą się promotorom mojej pracy, Prof. Dr hab. Tadeuszowi Pawełczykowi oraz Prof. Rer. Nat. Reinhardowi Waltherowi za opiekę i pomoc w trakcie pisania pracy magisterskiej Dziękuję pracownikom Katedry i Zakładu Medycyny Molekularnej Akademii Medycznej w Gdańsku, jak i pracownikom Instytutu Biochemii Medycznej i Biologii Molekularnej Uniwersytetu Ernst-Moritz-Arndt w Greifswaldzie za pomoc i ciepłe przyjęcie Podziękowania dla pracowników Katedry Farmakologii oraz Katedry Onkologii i Hematologii Uniwersytetu Ernst-Moritz-Arndt w Greifswaldzie za wskazówki podczas pracy w laboratorium