Białystok, r.

Transkrypt

1 dr hab. Adam Tylicki Instytutu Biologii Wydział Biologiczno-Chemiczny Uniwersytet w Białymstoku Ul. Ciołkowskiego 1J Białystok Białystok, r. Ocena rozprawy doktorskiej mgr Agnieszki Dominiak pt. Wpływ organicznego związku selenu (IV) na zaburzenia obrony antyoksydacyjnej oraz aktywację czynników zapalnych w mózgu znaczenie w chorobach ośrodkowego układu nerwowego wykonanej na Wydziale Farmaceutycznym z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego i w Instytucie Medycyny Doświadczalnej i klinicznej PAN im. Mirosława Mossakowskiego w Warszawie, pod kierunkiem prof. dr hab. Piotra Wroczyńskiego i dr hab. Agaty Adamczyk oraz pod opieką dr Anny Wilkaniec Selen, jako pierwiastek chemiczny został odkryty na początku dziewiętnastego wieku i długo był uważany za toksyczny. Pod koniec lat pięćdziesiątych dwudziestego wieku zaobserwowano cytoprotekcyjne działanie selenu w stosunku do komórek wątroby szczurów. Od tej pory poznano molekularny mechanizm pozytywnego oddziaływania selenu na poziomie komórkowym, szczególnie poprzez jego udział w dezaktywacji reaktywnych form tlenu (peroksydazy glutationowe), modyfikacji struktury białek (reduktazy tioredoksynowe i różne selenoproteiny), gospodarki hormonalnej tarczycy (dejonidazy jodotyroninowe), jak też wielu innych procesach związanych z ochroną przed skutkami stresu oksydacyjnego, transportem, odpowiedzią zapalną, a nawet płodnością mężczyzn (różne selenoproteiny). Obecnie w genomie człowieka stwierdza się ponad 20 genów kodujących białka zawierające selenocysteinę. Dzięki swoim właściwościom selen coraz częściej jest rozważany jako potencjalny lek. Przeglądając literaturę fachową można odnieść wrażenie, że obecnie oprócz poznawania mechanizmów działania selenu na różnych poziomach, badania dotyczą poszukiwania najbardziej efektywnych i najmniej toksycznych jego form. W ten właśnie aktualny nurt wpisuje się przedłożona do oceny rozprawa doktorska. Badania dotyczące 1

2 aktywności biologicznej Selolu rozpoczęto pod koniec dwudziestego wieku, kiedy Jastrzębski i wsp. (1995, 1997) oszacowali toksyczność i farmakokinetykę tego nowo zsyntetyzowanego, organicznego donora selenu. Przeglądając literaturę można znaleźć zaledwie około 30 prac dotyczących działania Selolu na organizmy żywe. Prace Ślusarczyk i wsp. opublikowane w ostatnich latach wykazały mniej toksyczne działanie Selolu w porównaniu do nieorganicznych donorów selenu u roślin i grzybów. Z drugiej strony stwierdzano podwyższoną aktywność peroksydazy glutationowej, gromadzenie dialdehydu malonowego i selenoproteiny P, jak również obniżenie aktywności reduktazy tioredoksynowej we krwi myszy w wyniku długotrwałego podawania Selolu, co może świadczyć o stanie stresu oksydacyjnego (badania Sochackiej i wsp r.). Wcześniejsze badania Stańczyk i wsp. z 2010 roku wykonane na szczurach nie wykazały takich efektów. Ostatnio stwierdzono również, że Selol w formie nanokapsułek wykazuje działanie przeciwnowotworowe (przykładowo, praca de Souza i wsp. z 2015 roku). W znanej mi literaturze nie spotkałem natomiast prac dotyczących wpływu Selolu na układ nerwowy, nie licząc publikacji autorstwa Doktorantki. W związku z powyższym odnoszę wrażenie, że wybór zarówno przedmiotu, jak i obiektu badań jest jak najbardziej trafny. Oceniane dzieło jest wynikiem współpracy dwóch ośrodków naukowych: Wydziału Farmaceutycznego z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego i Instytutu Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN. Praca powstała pod promotorstwem prof. Piotra Wroczyńskiego farmaceuty i dr hab. Agaty Adamczyk przy współudziale dr Anny Wilkaniec reprezentujących dziedzinę neurobiologii. Doktorantka umiejętnie wykorzystała doświadczenia i wiedzę swoich mentorów, jak też możliwości techniczne obu ośrodków w celu stworzenia dzieła, które prócz walorów czysto poznawczych niesie również wartości aplikacyjne, co należy uznać za dużą zaletę ocenianej rozprawy. Praca bazuje na trzech artykułach naukowych opublikowanych w 2016 i 2017 roku w czasopismach z dziedziny neurobiologii o zasięgu ogólnoświatowym, legitymujących się dość wysokim współczynnikiem przebicia (łącznie ok. 10) i punktacją MNiSW (80 punktów). Pierwsza ze wspomnianych prac została ogłoszona na łamach Current Neuropharmacology, jest pracą przeglądową, którą traktuję jako wstęp, dobrze ukierunkowujący czytelnika i ugruntowujący postawioną hipotezę i cel rozprawy doktorskiej jako całości. Kolejne dwa artykuły opublikowane w Neurochemical Research i Neurochemistry International są oryginalnymi pracami badawczymi, w których Autorka konsekwentnie realizuje postawione cele, dyskutuje uzyskane wyniki i wyciąga wnioski. Publikacje wchodzące w skład rozprawy 2

3 są wieloautorskie, w których mgr Agnieszka Dominiak jest pierwszym autorem. Z dołączonych do rozprawy oświadczeń bezspornie wynika Jej wiodący udział w powstawaniu tych publikacji zarówno podczas badań laboratoryjnych, jak również w interpretacji wyników i przygotowania materiałów do druku. Uzupełnieniem rozprawy jest ponad czterdziestostronicowy komentarz w języku polskim, w którym Autorka wprowadza czytelnika w zagadnienia rozprawy, konkretyzuje hipotezę i cel badań, skrótowo charakteryzuje obiekt i metody badań, opisuje i podsumowuje uzyskane wyniki. Praca, zgodnie z ogólnie przyjętymi zasadami, opatrzona jest streszczeniem w języku polskim i angielskim. Podsumowując formalną stronę dzieła, należy stwierdzić, że spełnia ono kryteria ustawowe przypisane rozprawom doktorskim. Autorka dzięki połączeniu potencjałów badawczych ośrodków, w których realizowała rozprawę miała możliwość przetestowania hipotezy głoszącej, że Selol poprzez swoje właściwości antyoksydacyjne i przeciwzapalne wykazuje działanie cytoprotekcyjne w stosunku do komórek układu nerwowego, dzięki czemu może wspomagać leczenie chorób neurodegeneracyjnych, u podstawy których leży stres oksydacyjny i procesy zapalne. Testowanie tak sformułowanej hipotezy jest w pełni uzasadnione w świetle rosnącej liczby przypadków chorób neurodegeneracyjnych, starzejącego się społeczeństwa, jak również ograniczonych możliwości poprawy komfortu życia osób chorych i braku skutecznych metod leczenia. Biorąc pod uwagę rolę selenu w procesach oksydoredukcyjnych związanych z eliminacją wolnych rodników, poszukiwanie skutecznego jego źródła o formule odpowiedniej do wykorzystania klinicznego, jest szczególnie istotne w obliczu niepożądanych efektów jego związków nieorganicznych lub słabych skutków przy podawaniu niektórych z jego form organicznych. Ogromną rolę w poszukiwaniu odpowiedniej i skutecznej formy selenu odgrywają badania przedkliniczne z wykorzystaniem testów in vitro na liniach komórkowych oraz in vivo na zwierzętach, czego w swojej pracy podjęła się Doktorantka. Polski komentarz do rozprawy dobrze wprowadza czytelnika w zagadnienie patomechanizmu chorób otępiennych. Wskazuje najnowsze odkrycia związane z ich podłożem, ze szczególnym uwzględnieniem roli reaktywnych form tlenu i procesów zapalnych w rozwoju choroby. W komentarzu zawarte są też informacje dotyczące naturalnych mechanizmów obrony ośrodkowego układu nerwowego przed działaniem RTF. Autorka w swoich rozważaniach kładzie nacisk na rolę selenoprotein w tych procesach i ukazuje tkankę nerwową jako szczególnie narażoną na uszkodzenia wolnorodnikowe. Stanowi to rozszerzenie publikacji przeglądowej wchodzącej w skład rozprawy, świadczące o 3

4 szerokiej wiedzy Doktorantki i ugruntowujące czytelnika w przekonaniu o słuszności podjętych badań. Cennym uzupełnieniem komentarza jest charakterystyka Selolu, jego struktury chemicznej i farmakodynamiki. Komentarz zawiera zwięzłe sformułowanie celu pracy i zadań badawczych służących weryfikacji postawionej hipotezy. Opis stosowanych metod w komentarzu jest bardzo skrótowy, co odbieram za walor, gdyż metody są bardziej szczegółowo opisane w publikacjach stanowiących zasadniczą część rozprawy. Część komentarza dotyczącą wyników rozprawy można by właściwie pominąć, gdyż powtarza treści zawarte w publikacjach. W części dotyczącej podsumowania oczekiwałbym szerszej, połączonej dyskusji obu prac oryginalnych wokół postawionej hipotezy i perspektyw praktycznego wykorzystania zaobserwowanych właściwości Selolu. Autorka kończy swój komentarz trafnie sformułowanymi wnioskami. Ostatni z nich jest może zbyt odważny, ale budzi nadzieję na zastosowanie kliniczne Selolu w niedalekiej przyszłości w celu poprawy komfortu życia ludzi dotkniętych stanami neurodegeneracyjnymi i otępiennymi. Komentarz zakończony jest szeroką literaturą przedmiotu zawierającą zarówno najnowsze jak i starsze pozycje. Zasadnicza część rozprawy obejmuje dwie oryginalne publikacje prezentujące metodykę, rezultaty i wnioski z przeprowadzonych badań. W swojej pracy Doktorantka posłużyła się modelami i metodami odpowiednio dobranymi do postawionych zadań. Wykorzystała analizy spektrofotometryczne w celu badania aktywności enzymów i stężenia glutationu, spektrofluorometrię w celu określenia poziomu RTF w komórkach i mózgach szczurów, metody mikroskopii fluorescencyjnej do obserwacji procesu apoptozy, analizy molekularne przy ocenie poziomu ekspresji genów, metody immunochemiczne i spektroskopię mas w celu określenia poziomu białek związanych z procesami zapalnymi i stężenia selenu w badanych modelach. Należy podkreślić, że Doktorantka przed przystąpieniem do właściwego eksperymentu wykonała badania wstępne w celu określenia odpowiednich dla modelu komórkowego dawek nitroprusydku sodu i Selolu, jak również przegląd literatury w celu wyboru adekwatnej dawki lipopolischacharydu i Selolu w modelu zwierzęcym. Autorka w wyniku prawidłowo zaplanowanych i wykonanych eksperymentów wykazała cytoprotekcyjne działanie Selolu in vitro wobec komórek PC12 podczas stresu oksydacyjnego wywołanego nitroprusydkiem sodu. Selol zwiększał żywotność komórek i ograniczał ich apoptozę. Aktywność Selolu wynikała z eliminacji wolnych rodników powstałych pod wpływem nitroprusydku sodu poprzez podwyższenie aktywności peroksydazy glutationowej, reduktazy glutationowej i reduktazy tioredoksynowej, co 4

5 wpływało na przywrócenie prawidłowego stosunku glutationu zredukowanego do utlenionego. Cytoprotekcyjny efekt Selolu odnotowany w badaniach in vitro Autorka potwierdziła na modelu zwierzęcym, w którym szczurom indukowano stan zapalny podając bakteryjne lipopolisacharydy. Wykazano, że zastosowany model powoduje typową odpowiedź zapalną organizmu, dodatkowo odnotowano u szczurów podwyższony poziom tiobarbituranów i czynnika TNFα, co może wskazywać na stan stresu oksydacyjnego. Na tym tle w tkance mózgowej szczurów badano efekt podawania Selolu. Autorka stwierdziła, że związek ten wykazuje ochronne działanie w stosunku do zmian powodowanych stanem zapalnym. U podłoża tego zjawiska leży obniżenie poziomu utlenionego glutationu w wyniku przywrócenia normalnej aktywności reduktazy glutationowej, czemu towarzyszyło również podwyższenie poziomu mrna selenoprotein w stosunku do obniżonego poziomu ich ekspresji wskutek działania lipopolisacharydów. Dodatkowo stwierdzono, że przeciwzapalne i protekcyjne działanie Selolu wynika również z hamowania uwalniania cytokin i aktywacji syntezy neurotrofiny BDNF w wyniku podwyższenia poziomu ekspresji genu tego czynnika odpowiedzialnego za procesy naprawcze neuronów. Powyżej wskazane odkrycia wyjaśniające antyoksydacyjne oraz przeciwzapalne działanie Selolu są niepodważalnym walorem naukowym ocenianej rozprawy i stanowią oryginalny wkład Autorki w rozwój wiedzy dotyczącej sposobów przeciwdziałania przyczynom stanów neurodegeneracyjnych i otępiennych. Przyznaję, że z uwagą i zaciekawieniem przeczytałem rozprawę doktorską mgr Agnieszki Dominiak. Pomijam tu drobne błędy i nieścisłości, które nie mają zasadniczego znaczenia dla oceny tego dzieła jako całości. Przedstawiona praca została wcześniej oceniona przez grono recenzentów wydawniczych, będących na pewno lepszymi ode mnie specjalistami w dziedzinie neurobiologii. Mam jednak obowiązek wskazania zagadnień do wyjaśnienia podczas obrony, wchodząc w dyskusję nie tylko z Autorką pracy, ale pośrednio również z jej wcześniejszymi recenzentami. We wstępie rozprawy według mnie brakuje informacji dotyczących toksycznego działania selenu na komórki i organizmy, jak też związanych z tym problemów z suplementacją pacjentów tym pierwiastkiem. Ufam, że pani Agnieszka Dominiak wskaże te treści podczas obrony. Zastanawia mnie dlaczego Autorka zdecydowała się na samice szczurów podczas badań in vivo? Jak wiadomo szczury uzyskują dojrzałość płciową szybko (5-6 tygodni po urodzeniu). Trzymiesięczne samice podlegają już rójkom, co powoduje zmiany ich statusu 5

6 hormonalnego i metabolicznego w zależności od fazy cyklu owulacyjnego. Czy wobec tego stan hormonalny samic nie miał wpływu na uzyskane wyniki i czy nie lepiej było użyć w badaniach o wiele bardziej stabilnych pod tym względem samców? Autorka nie wyjaśnia również, czy stosując metodę analizy wariancji testowała dane na normalność rozkładu. Rozkład normalny danych jest warunkiem progowym stosowania tej metody. Sprawa jest szczególnie istotna przy niewielkich liczebnościach porównywanych grup. W odniesieniu do badania apoptozy komórek PC12 zastosowanie fluorochromu Hoechst daje możliwość obserwacji stopnia kondensacji chromatyny w jądrach, co faktycznie może być związane z procesem apoptozy, szczególnie gdy fragmenty chromatyny stwierdzane są w ciałkach apoptotycznych będących skutkiem rozpadu komórek. Jednak należy pamiętać, że komórka może rozpaść się na wiele ciałek apoptotycznych i liczenie tych ciałek trudno odnieść do liczby komórek podlegających apoptozie (wykres na fig. 1e w pracy dotyczącej komórek PC12). W związku z tym, czy w przyszłych badaniach nie lepiej będzie oprócz barwienia Hoechst em zastosować dodatkowo np. prosty test z aneksyną V na obecność na powierzchni błony komórkowej fosfatydyloseryny, co jest uznanym, wczesnym markerem apoptozy? W ten sposób unikamy dyskusji dotyczących liczenia komórek apoptotycznych. Uważam też, że prócz testu MTT, który faktycznie informuje nas o aktywności metabolicznej komórek, w następnych badaniach można by dodatkowo, w celu określenia przeżywalności komórek, wykonać test z błękitem trypanu lub dwuoctanem fluoresceiny i wyznaczyć krzywe wzrostu komórek w różnych wariantach eksperymentu, co może przynieść cenne informacje na temat tempa przyrostu liczby komórek i zmian ich przeżywalności pod wpływem Selolu. Zastanawia mnie również, czy Autorka w trakcie krytycznej analizy swoich wyników zadała sobie pytanie o dostępność w komórkach NADPH jako donora elektronów w reakcjach katalizowanych przez reduktazę glutationową i reduktazę tioredoksynową. Stwierdzenie podwyższonej aktywności tych enzymów w warunkach, gdzie egzogennie dostarczamy wysycające stężenia wszystkich wymaganych kofaktorów właściwie świadczy o większej ilości białka katalizującego badaną reakcję. Aby bezspornie interpolować to do układu komórki należałoby rozważyć stosunek NADP/NADPH, który jest jednym z czynników limitujących badane procesy. Wobec tego, jakie jest zdanie Autorki w temacie możliwości zabezpieczenia odpowiednich ilości NADPH w komórkach w warunkach stresu i poddanych działaniu Selolu? Jakie procesy metaboliczne mają tu szczególne znaczenie? 6

7 Podsumowując ocenę rozprawy doktorskiej Pani Agnieszki Dominiak stwierdzam, że zawarte w recenzji uwagi mają na celu sprowokowanie dyskusji i wskazanie możliwości wzbogacenia badań, a uzyskane wyniki są pionierskie w temacie cytoprotekcyjnych właściwości Selolu wobec komórek tkanki nerwowej. Biorąc pod uwagę wszystkie argumenty z pełnym przekonaniem stwierdzam, że przedmiotowe opracowanie spełnia wymogi ustawowe stawiane rozprawom doktorskim. W związku z powyższym wnioskuję do Rady Wydziału Farmaceutycznego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego o dopuszczenie mgr Agnieszki Dominiak do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Dodatkowo biorąc pod uwagę wartość naukową ocenianej rozprawy i jej potencjalne walory aplikacyjne wnoszę o wyróżnienie tej pracy zgodnie z zasadami przyjętymi na Wydziale Farmaceutycznym Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. 7