Spektroskopia emisyjna Fluorescencja i Fosforescencja
Reguły wyboru przejścia między termami cząsteczkowymi =0, 1 S=0 g u g g u u + + - - + -
Reguła Francka-Condona Najbardziej prawdopodobne są przejścia do takich stanów oscylacyjnych wyższego stanu elektronowego, dla których cząsteczka ma taką geometrię, jak w stanie równowagi dla podstawowego stanu elektronowego. =6 =5 lub =2 =20 lub =18 =0
Losy stanów wzbudzonych elektronowo Proces w wyniku którego cząsteczka oddaje energię wzbudzenia w postaci fotonu nazywany jest zanikiem promienistym Częściej jednak zachodzi proces zwany zanikiem bezpromienistym: (zamiana energii wzbudzenia w energię ruchów termicznych otoczenia czyli ciepło)
Rozpraszanie energii wygaszanie emisji Wygaszanie bezpromieniste w formie wzbudzenia drgań, wzrostu temperatury, kontaktu z rozpuszczalnikiem. Taki proces obecny jest zawsze. Gaszenie wewnętrzne - zmiany strukturalne wewnątrzcząsteczkowe Gaszenie zewnętrzne - oddziaływanie cząsteczki w stanie wzbudzonym z inną cząsteczką lub absorpcja zarówno promieniowania wzbudzającego jak i emitowanego przez inne chromofory obecne w próbce.
Zanik promienisty Fluorescencja Fosforescencja E Diagram poziomów energetycznych E Diagram poziomów energetycznych
Fluorescencja Fluorescencja emisja promieniowania przez naświetlaną substancję, która jest związana z powrotem cząsteczek do stanu podstawowego o tej samej multipletowości spinowej co stan wzbudzony Oba stany są na ogół singletowe Promieniowanie emitowane spontanicznie w procesie fluorescencji zanika natychmiast po wyłączeniu promieniowania wzbudzającego
Fluorescencja - opis zjawiska Geometria cząsteczki nie ulega zmianie w trakcie emisji więc może zostać obsadzony jeden z wyższych poziomów oscylacyjnych podstawowego stanu elektronowego Pasmo fluorescencji wskazuje strukturę oscylacyjną odzwierciedlającą odległości poziomów oscylacyjnych podstawowego stanu elektronowego. Jest ono na ogół przesunięte w kierunku niższych częstości. Wynika to z bezpromienistego (utrata energii na rzecz otoczenia) zaniku wzbudzenia oscylacyjnego na wyższym poziomie elektronowym przed powrotem cząsteczki do stanu podstawowego
Mechanizm fluorescencji S 1 S 0 1. Absorpcja promieniowania wzbudza przejścia sigletsinglet, którym towarzyszy wzbudzenie poziomów oscylacyjnych 2. Następuje bezpromienista utrata energii na rzecz otoczenia 3. Emisja promieniowania następuje z podstawowego poziomu oscylacyjnego wzbudzonego stanu elektronowego Singlet (S 1 ) Singlet (S 0 )
Typowe wzbudzenie fluorescencyjne C-C p * wiązanie Wysoka energia oscylacyjna Wysoka energia, krótkie fale C=C p wiązanie Niska energia oscylacyjna
Typowa emisja fluorescencyjna C-C p * wiązanie Ciepło Wysoka energia oscylacyjna C-C p * wiązanie Niska energia oscylacyjna EMISJA C=C p wiązanie Dłuższe fale, niższa energia światła Niska energia oscylacyjna
Fluorescencja
Diagram energii Franca-Condona E Odległość międzyatomowa
Fluorescencja przesunięcie Stokesa Widmo absorpcyjne (a) wykazuje strukturę oscylacyjną charakterystyczną dla stanu wzbudzonego Widmo fluorescencyjne (b) ukazuje strukturę charakterystyczną dla niższego stanu. Jest przesunięte do niższych energii Absorpcja Fluorescencja Przejścia oscylacyjne 0-0 pokrywają się Energia 0-0 Przejście
Intensywność fluorescencji Fluorescencja - Przesunięcie Stokesowskie W 1852 roku na podstawie obserwacji zostało sformułowane prawo - od nazwiska odkrywcy, nazwane prawem Stokesa, które mówi- że długość fali promieniowania fluorescencyjnego jest zawsze większa od długości fali promieniowania wzbudzającego fluorescencję. Różnica energii pomiędzy pikiem absorpcji a pikiem emisji to przesunięcie Stokesa Fluoresceina Przesunięcie Stokesa 25 nm 495 nm 520 nm
Reguła odbicia lustrzanego ev Poziomy oscylacyjne wzbudzonego stanu elektronowego Poziomy oscylacyjne podstawowego stanu elektronowego
Widmo fluoresceiny Izotiocyjanian fluoresceiny
Siła oscylatora Siła oscylatora Absorpcja Intensywność Absorpcja Intensywność Widma absorpcyjne i fluorescencyjne 2.0 Eksperyment (PDI w etanolu)) wzb =269 nm 0.6 2.0 Eksperyment (PDI w etanolu)) wzb =269 nm 0.6 1.5 1.5 0.4 0.4 1.0 1.0 0.5 0.2 0.5 0.2 0.0 0.0 0.0 0.0 Teoria (TD-B3LYP/6-311++G(d,p)) Teoria (TD-B3LYP/6-311++G(d,p)) 0.2 Obliczenia dla próżni 0.2 Tomasi s PCM Model Obliczenia dla etanolu 0.1 0.1 0.0 200 250 300 350 400 0.0 200 250 300 350 400 Długość Długosc fali (nm) Długosc fali (nm) Długość fali (nm)
Fluorescencja Fluorofory są składnikami cząsteczki, które absorbują energię - są to na ogół pierścienie aromatyczne
Fluorofory Zazwyczaj sa to cząsteczki organiczne Jedyne atomy fluoryzujące: Lantanowce (europ, terb)
Charakterystyka fluorescencji Ze względu na to, że cząsteczka może być na różnych stanach rotacyjnych, oscylacyjnych i elektronowych piki są SZEROKIE Każde widmo jest charakterystyczne dla danej cząsteczki Przed powrotem do swojego podstawowego stanu, elektron pozostaje w stanie wzbudzonym przez ok. 10 8 sekund. Ze względu na to, że stan wzbudzony jest WYSOCE REAKTYWNY może reagować z inną cząsteczką Emitowane promieniowanie rozchodzi się we wszystkich kierunkach
Wydajność kwantowa fluorescencji - Współczynniki ekstynkcji jest miarą zdolności fluoroforu do absorbowania światła - chromofory posiadające wysoki współczynnik ekstynkcji wykazują duże prawdopodobieństwo emisji fluorescencyjnej. Q - wydajność kwantowa fluorescencji prawdopodobieństw że dany stan wzbudzony emituje foton t ilość fotonów emitowanych/ilość fotonów absorbowanych (0-1) - Czas życia fluorescencji- czas w którym cząsteczka pozostaje przed powrotem do stanu podstawowego Czas w którym początkowa intensywność fluorescencji zanika do 1/e (ok 37 %) początkowej intensywności I(t) = I o e (-t/t)
Tryptofan Charakterystyczne pasmo absorpcji i emisji. A 2 Maksimum intensywności 150 Intensywność Fluorescencji 100 50 200 300 400 λ max
Fluorescencja Fluorescencję obserwuje się dla: Sztywnych struktur Delokalizowanych elektronów Intensywnych pasm absorpcyjnych UV (π π* przejścia, Try) Krótkich czasów wzbudzenia (<10 9 sec). Wewnętrzne fluorofory w białkach to Tryptofan (Try), Tyrozyna (Tyr) i Fenyloalanina (Phe) Try i Tyr emisja znacznie silniejsza niż Phe, Zasady DNA,nukleotydy
Zastosowanie Podobne jak spektroskopii UV/VIS Analityczne Strukturalne lokalne konformacje (aromatyczne aminokwasy), struktura trzeciorzędowa białek, denaturacja. Kompleksowanie, tworzenie wiązań. Chemiluminescencja. Mikroskopia fluorescencyjna. Fluorescencja jest znacznie wrażliwsza na zmianę środowiska fluoroforu niż spektroskopia absorpcyjna w zakresie UV/Vis.
Fluorofory Tryptofan Fenyloalanina Tyrozyna
Zasady interpretacji widm fluorescencyjnych białek W białkach fluoryzują tylko 3 aminokwasy: Try, Phe, Tyr Jeśli położenie maksimum emisji Try przesuwa się w kierunku fal krótszych i intensywność rośnie to oznacza, że aminokwas znajduje się w środowisku mniej polarnym W roztworze polarnym przesunięcie oznacza, że tryptofan znajduje się wewnątrz struktury białkowej. Identyczne przesunięcie w roztworze niepolarnym wskazuje na taka zmianę struktury, że Try znajduje się na powierzchni Jeśli obecne są zewnętrzne wygaszacze (jon jodkowy, azotany) i obserwuje się zanik fluorescencji oznacza to, że tryptofan znajduje się na powierzchni. W przypadku braku wygaszania aminokwas jest wewnątrz struktury niedostępnej dla wygaszacza.
Zasady interpretacji widm fluorescencyjnych białek Emisję Try wygaszają protonowane grupy karboksylowe stąd można ocenić sąsiedztwo tego aminokwasu Jeśli wolny aminokwas zmienia intensywność fluorescencji w obecności substratu a w białku substrat nie oddziałuje oznacza to, że substrat wprowadza zmiany konformacyjne, w których Try zostaje ukryty wewnątrz struktury Jeśli substancja wiąże się z białkiem i fluorescencja tryptofanu maleje to można wnioskować albo o zmianie konformacyjnej albo, że Try znajduje się bardzo blisko centrum wiążącego
Białko zielonej fluorescencji Białko zielonej fluorescencji (green fluorescent protein, GFP) naturalnie występujące białko wykazujące fluorescencję. GFP jest małym białkiem meduzy Aequorea victoria (238 aminokwasów, 26,9 kda) Rzeźba Juliana Voss-Andreae Stalowa meduza (Steel Jellyfish) (2006) oparta na strukturze GFP. Obraz przedstawia rzeźbę ze stali nierdzewnej w laboratorium Friday Harbor Laboratory na wyspie San Juan w stanie Waszyngton, w miejscu odkrycia GFP
Metody pomiaru fluorescencji Widmo emisji- wzbudzająca długość fali λ stała, pomiar intensywności fluorescencji (emisji) w zależności od długości fali widmo Widmo wzbudzenia pomiar intensywności fluorescencji dla różnych długości fal wzbudzenia λ, podobne do widm absorpcyjnych. próbka Io λ1 Przepuszczone promieniowanie Źródło światła Monochromator Emisja λ2 Detektor
Źródła wzbudzające Lampy Lasers Ksenon Ksenon/Rtęć Argon (Ar) Krypton (Kr) Hel Neon (He-Ne) Hel Kadm (He-Cd) Krypton-Argon (Kr-Ar)
Mikroskop fluorescencyjny Niektóre substancje obecne w komórkach i tkankach mają zdolność do własnej fluorescencji: porfiryny, chlorofil, hemoglobina, witamina A. Barwniki fluorescencyjne używane są do znakowania interesujących nas molekuł, poprzez wiązanie się z nimi, w utrwalonych i żywych komórkach (fluoresceina, rodamina, DAPI DNA w jądrze wybarwione DAPI 4',6-diamidyno-2-fenyloindol)
Fosforescencja T 1 S 0 Emisja promieniowania związana jest z dezaktywacją cząsteczek, znajdujących się w stanie o innej multipletowości niż stan podstawowy. A F FP
Mechanizm fosforescencji Absorpcja promieniowania wzbudza przejście singletsinglet, któremu towarzyszy wzbudzenie poziomu oscylacyjnego W trakcie bezpromienistego wygaszania oscylacyjnego może dojść do przejścia interkombinacyjnego (konwersji międzysystemowej) z krzywej stanu singletowego na krzywą stanu trypletowego spowodowanego oddziaływaniem spin-orbita.
Mechanizm fosforescencji Przejście to jest ułatwione obecnością wspólnego poziomu oscylacyjnego elektronowych stanów wzbudzonych Stan trypletowy cząsteczki bezpromieniście przechodzi na zerowy poziom oscylacyjny i pozostaje na nim tak długo aż złamanie reguły S=0 pozwoli na powrót do stanu podstawowego i emisję promieniowania elektromagnetycznego Pozostawanie cząsteczek w stanie wzbudzonym przejawia się nieraz długotrwałym świeceniem substancji po ustaniu naświetlania
Mechanizm fosforescencji T 1 S 0 1. Absorpcja promieniowania wzbudza przejście singletsinglet 2. Przejście interkombinacyjne z krzywej stanu singletowego na krzywą stanu trypletowego (przemiana wzbroniona T S) 3. Stan trypletowy cząsteczki bezpromieniście przechodzi na zerowy poziom oscylacyjny 4. Cząsteczka w stanie wzbudzonym przejawia nieraz długotrwałe świecenie
Doświadczalna różnica pomiędzy fluorescencją i fosforescencją. I Fluorescencja zanika natychmiast, gdy usuniemy źródło wzbudzenia, podczas gdy fosforescencja trwa przez dłuższy okres czasu a jej intensywność zanika powoli Intensywność emisji Fosforescencja Fluorescencja T
Diagram Jabłońskiego (1933) Diagram Jabłonskiego (dla naftalenu) w uproszczeniu przedstawia obraz względnego położenia poziomów elektronowych cząsteczki. IC: Konwersja wewnętrzna ISC: Konwersja międzysystemowa
Schemat Jabłońskiego S stany singletowe T stany trypletowe A absorpcja F fluorescencja P fosforescencja IC konwersja wewnętrzna ISC konwersja interkombinacyjna Energia Wzbudzone stany oscylacyjne Stan elektronowy podstawowy
Diagram Jabłońskiego Strzałki proste przejście promieniste Strzałki falowane przejście bezpromieniste
Aleksander Jabłoński 1898-1980 urodził się w roku 1898 na Ukrainie. Fizykę studiował w Charkowie i w Warszawie, gdzie w roku 1930 uzyskał stopień doktora. Studiując w Warszawie grał jednocześnie w sekcji pierwszych skrzypiec orkiestry Teatru Wielkiego. W latach 30. przebywał w Berlinie i w Hamburgu jako stypendysta Fundacji Rockefellera. Habilitował się na Uniwersytecie Warszawskim w dziedzinie ciśnieniowego poszerzania linii widmowych. Tematyka ta, którą kontynuował po przeniesieniu się do Wilna, jest do dziś uprawiana w Instytucie Fizyki UMK. W 1939 roku wziął udział w kampanii wrześniowej, która skończyła się dla niego najpierw internowaniem w obozie sowieckim, a następnie szczęśliwym jego opuszczeniem i wstąpieniem do Armii Andersa. W roku 1943 znalazł się w Wielkiej Brytanii, gdzie przez dwa lata pracował na Uniwersytecie w Edynburgu. Po powrocie do Polski, w roku 1945, pracował najpierw na Uniwersytecie Warszawskim, przeniósł się do Torunia, gdzie został mianowany profesorem zwyczajnym i gdzie od podstaw rozpoczął budowę toruńskiej szkoły fizyki.
Czasy w jakich zachodzą procesy dezaktywacji cząsteczki Absorpcja: 10-15 s Relaksacja wibracyjna: 10-12 - 10-10 s Czas życia w pierwszym stanie wzbudzonym S 1 10-10 - 10-7 s, fluorescencja Konwersja wewnętrzna: 10-11 - 10-9 s Konwersja międzysystemowa: 10-10 - 10-8 s Czas życia stanu wzbudzonego T 1 10-6 1s, fosforescencja
Reguła Kashy Obserwowana fluorescencja lub fosforescencja niemal wyłącznie pochodzi od przejść z najniższego stanu wzbudzonego o danej multipletowości tzn. ze stanu S 1 lub T 1. Wynika to z dużej szybkości bezpromienistej dezaktywacji (10 12 s -1 ), znacznie większej niż szybkość przejść promienistych rzędu 10 9 s -1
Charakterystyka zachodzących procesów w czasie wzbudzenia Konwersja wewnętrzna Jest to bezpromieniste przejście pomiędzy dwoma elektronowymi stanami o tej samej multipletowości (2S+1). W roztworze proces ten zachodzi jako relaksacja wibracyjna z wysokich stanów wibracyjnych do podstawowego wibracyjnego. Dzieje się tak na skutek kolizji z cząsteczkami rozpuszczalnika
Charakterystyka zachodzących procesów w czasie wzbudzenia Kiedy cząsteczka zostaje wzbudzona do wyższego stanu wibracyjnego pierwszego wzbudzonego stanu elektronowego to poprzez procesy wibracyjnej relaksacji lub konwersji wewnętrznej i wibracyjnej relaksacji gdy są to stany elektronowe wyższe przechodzi do stanu podstawowego oscylacyjnego pierwszego stanu wzbudzonego elektronowego w czasie około 10-13 - 10-11 s. Przejście ze stanu elektronowego 1 do 0 jest już mniej prawdopodobne ze względu na największa różnicę energii.
Luminiscencja Zjawisko to, zwane jarzeniem lub niekiedy zimnym świeceniem polega na emitowaniu światła, które powstaje kosztem innych rodzajów energii niż energia cieplna.
Rodzaje luminescencji Fotoluminescencja (świecenie spowodowane promieniowaniem UV lub widzialnym VIS). Fotoluminescencję dzieli się na: fluorescencję i fosforescencję Fluorescencja jest świeceniem krótkotrwałym, trwającym nie dłużej niż 10-8 s Fosforescencja to świecenie długotrwałe, dochodzące do kilku godzin a nawet dni
Fotoluminescencja Fotoluminescencję wykazuje wiele substancji, jak choćby organiczne barwniki stosowane w odblaskowych flamastrach czy luminofory stosowane w świetlówkach-rurach fluorescencyjnych.
Rodzaje luminescencji Termoluminescencja luminescencja następuje po uprzednim naświetleniu substancji i następnie jej ogrzaniu. Mamy tu do czynienia z gromadzeniem energii świetlnej i wypromieniowaniu jej gdy tego chcemy- w momencie podgrzania.
Rodzaje luminescencji Chemiluminescencja to świecenie wywołane reakcjami chemicznymi, np. podczas utleniania fosforu białego lub luminolu. Henning Brand odkrywa fosfor (1669r.)
Chemiluminescencja reakcja chemiczna prowadzi do wzbudzonego elektronowo produktu, który emituje światło w trakcie powrotu do stanu podstawowego Luminol (do wykrywania krwi) A + B C * C + hn NH 2 O NH 2 C C NH NH O 2 /OH- COO - COO - + hn + N 2 + H 2 O O Utlenianie szczawianu difenylu (światło chemiczne)
Bioluminescencja Bioluminescencja,,,zimne" świecenie - żywych organizmów, jeden z rodzajów chemiluminescencji. Występuje u wielu bakterii, grzybów, niektórych pierwotniaków, morskich jamochłonów, gąbek, mięczaków, skorupiaków, owadów, osłonic, ryb. Świecenie jest związane z enzymatycznym utlenianiem lucyferyny z udziałem enzymu lucyferazy (związki te u różnych zwierząt mają różny skład chemiczny). Model lucyferyny robaczków świętojańskich
Bioluminiscencja
Elektroluminiscencja Zjawisko luminescencji w ciałach stałych i gazach pod wpływem przepływu prądu, wyładowania elektrycznego, pola elektrycznego, fali elektromagnetycznej. Działanie diody elektroluminescencyjnej (LED) opiera się na zjawisku rekombinacji nośników ładunku (rekombinacja promienista). Zjawisko to zachodzi w półprzewodnikach wówczas, gdy elektrony przechodząc z wyższego poziomu energetycznego na niższy. Podczas tego przejścia energia elektronu zostaje zamieniona na kwant promieniowania elektromagnetycznego Diody elektroluminescencyjne są wytwarzane z materiałów półprzewodnikowych (pierwiastki z III i V grupy układu okresowego np. arsenek galu GaAs, fosforek galu GaP, arsenofosforek galu GaAsP o odpowiednim domieszkowaniu). Barwa promieniowania emitowanego przez diody elektroluminescencyjne zależy od materiału półprzewodnikowego; są to barwy: niebieska, żółta, zielona, pomarańczowa, czerwona.
Luminofory nieorganiczne Siarczki takie jak siarczek cynku ZnS i siarczek kadmu. Cechuje je wysoka wydajność świetlna. Luminofory siarczkowe są dobrymi katodoluminoforami, elektroluminoforami i rentgenoluminoforami Tlenosiarczek itru aktywowany europem okazał się bardzo dobrym luminoforem czerwonym, stosowanym w telewizji kolorowej Luminofory z grupy halofosforanów wapnia znalazły zastosowanie w świetlówkach. Mają dobrą wydajność świetlną, są aktywowane manganem. Wolframian wapnia aktywowany srebrem i tantalan itru aktywowany niobem są dobrymi rentgenoluminoforami stosowanymi do folii wzmacniających w rentgenodiagnostyce
Luminofory nieorganiczne Luminofory siarczkowe (siarczki metali) najwolniej gasnące-siarczki wapniowców CaS, SrS: Cu, Bi, Pb. kadmu i cynku ZnS, CdS: Ag, Cu, Co, Mn tlenosiarczkowe Y 2 O 2 S: Eu
Świecące kryształy Fosforescencję pod wpływem naświetlania wykazuje np. Diament, baryt, gips, które po wyłączeniu lampy świecą jeszcze przez kilka sekund białoniebieskim światłem Luminiscencja minerału zazwyczaj związana jest z małą domieszką aktywatorów (np. mangan w kalcycie) lub obecnością defektów sieciowych W najbardziej pospolitych diamentach ma zwykle barwę niebieską. Inne barwy fluorescencji diamentów jubilerskich są dużo rzadsze. Mogą być też diamenty z fluorescencją zieloną, żółtawą, żółtawozieloną, pomarańczową i czerwoną. Czasem bywa w diamencie nawet kilka barw fluorescencji jednocześnie. Fosforyzujące diamenty naturalne są rzadkie, natomiast fosforyzujące diamenty syntetyczne są częste.
Świecące kryształy Kalcyt żółta, pom., czerw Cyrkon żółta, złocista Fluoryt fioletowa, jasnożółta Topaz zółta, Gips białoniebieska Dolomit pomarańczowa Apatyt różowa, czerwona
Luminofory organiczne-przykłady -fluoresceina -eozyna -uranina -niektóre polimery luminol
Przykłady fosforów i luminoforów Materiał luminescencyjny: NaI(Tl), np. licznik scyntylacyjny, detekcja promieni X oraz gamma po absorpcji kwantu elektron przechodzi do pasma przewodnictwa NaI, emisję światła (410 nm) powoduje przejście na poziom domieszkowy talu. Fosfory siarczkowe- ZnS:Ag; ZnS:Cu; CdS:Ag kiedyś popularne w farbie świecącej w budzikach składniki luminoforów telewizyjnych, ponieważ ZnS jest półprzewodnikiem, łatwiej następuje przeniesienie e - w paśmie przewodnictwa na domieszkę. Wydajność przenoszenia energii w izolatorach (fosforany) jest mniejsza.