Poznań, 21 listopad 2016 Profesor dr hab. Jadwiga Jaruzelska Instytut Genetyki Człowieka PAN ul. Strzeszyńska 32, 60-479 Poznań jadwiga.jaruzelska@igcz.poznan.pl Recenzja rozprawy doktorskiej pt. Struktura drugorzędowa segmentu 5 RNA(+) wirusa grypy oraz jej konserwatywne motywy strukturalne Dla: Rady Naukowej Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN Doktorantka: Pani mgr Marta Soszyńska-Jóźwiak Jednym z istotnych problemów medycznych i społecznych związanych z wirusem grypy typu A jest jego zmienność i stąd brak skutecznej terapii, która zapobiegałaby wybuchającym w świecie pod wpływem tego wirusa epidemiom i pandemiom. Dlatego opracowanie bardziej skutecznych metod zapobiegania im wydaje się niezwykle istotne. Jednym z warunków odniesienia sukcesu w tej dziedzinie jest lepsze poznanie struktury drugorzędowej oraz przestrzennej wirusa oraz ocena istotności poszczególnych regionów jego genomu w różnych etapach cyklu życiowego, np. w replikacji. Choć główne elementy cyklu replikacji wirusa grypy są dobrze opisane w literaturze, wiedza na temat struktury drugorzędowej jego RNA jest niewielka. Znakomity Zespół Pani Profesor Elżbiety Kierzek od lat zajmuje się próbą poznania struktury wirusa grypy wykorzystując w tym celu szeroki wachlarz technik chemicznych, enzymatycznych oraz bioinformatycznych. Zespół ten opisał niedawno strukturę drugorzędową całego segmentu 8, stanowiącego jeden z ośmiu segmentów genomu wirusa grypy typu A. Należy podkreślić, że jest to jak dotąd jedyny segment genomu tego wirusa, którego struktura drugorzędowa została określona. Rozprawa doktorska Pani mgr Soszyńskiej-Jóźwiak stanowi kontynuację powyższych osiągnięć Zespołu. Wybór segmentu 5 został podyktowany wysokim prawdopodobieństwem występowania w nim termodynamicznie trwałej struktury drugorzędowej, w odniesieniu do obu typów RNA tego segmentu, RNA(+) oraz (-), które zostało ocenione metodami bioinformatycznymi. Pani Soszyńska-Jóźwiak założyła, iż drugorzędowa struktura RNA wirusa jest istotna dla prawidłowego przebiegu jego cyklu replikacyjnego oraz wydajnego namnażania w komórce gospodarza. Istotnym kryterium w 1
wyborze segmentu 5 wirusa do badań struktury drugorzędowej była obecność w nim motywów zakonserwowanych, które mogłyby wskazywać na istotną rolę w powyższych procesach. Pani mgr Soszyńska-Jóźwiak zastosowała imponującą gamę technik bioinformatycznych, chemicznych oraz enzymatycznych, do określenia struktury drugorzędowej dwóch wybranych do badań motywów strukturalnych segmentu 5, motywu M121 oraz M198. Zachowawczość tych motywów sięgała odpowiednio, 91.0 oraz 86,9%. Dużym osiągnięciem w tej części rozprawy było uzyskanie spójnych wyników dotyczących struktury drugorzędowej badanych motywów, przy pomocy różnych analiz. Następny etap rozprawy w naturalny sposób prowadził do sprawdzenia funkcjonalności motywów M121 oraz M198. W tym celu Pani Soszyńska-Jóźwiak zaprojektowała gamę antysensownych oligonukleotydów komplementarnych do niesparowanych a jednocześnie dostępnych fragmentów powyższych motywów. Oczekiwała, że przynajmniej niektóre zaprojektowane przez nią oligonukleotydy nonsensowne spowodują zahamowanie namnażania wirusa grypy w modelowych dwóch liniach komórkowych, MDCK oraz MDCK-HA. W przypadku motywu M121 znaczący efekt hamowania namnażania wirusa udało się uzyskać, podczas gdy efekt antysensownych oligonukleotydów wycelowanych w motyw M198 był stosunkowo niewielki. Dlatego kwestia funkcjonalności tego regionu zostanie poddana dalszym badaniom. W następnym etapie Pani mgr Soszyńska-Jóźwiak przeprowadziła bardzo złożoną analizę struktury drugorzędowej całego segmentu 5 RNA(+) a uzyskany model okazał się w wysokim stopniu uniwersalny dla wirusa grypy typu A. Bardzo ważnym osiągnieciem Pani mgr Soszyńskiej-Jóźwiak było pokazanie, że struktura drugorzędowa motywów M121 oraz M198 określona w formie wyizolowanej pozostaje aktualna również w kontekście struktury całego segmentu 5 RNA(+) wirusa grypy. Wyniki uzyskane w tej części rozprawy doprowadziły do ważnego przypuszczenia, że ukazana zachowawczość struktury drugorzędowej może wskazywać na jej istotne znaczenie, na różnych etapach cyklu replikacyjnego wirusa grypy. Na podstawie uzyskanych danych na temat struktury drugorzędowej RNA(+) segmentu 5 oraz jej zachowawczości, zaprojektowano oligonukleotydy antysensowne, jednak tym razem były one komplementarne do innych fragmentów segmentu 5, niż motywy M121 i M198. Okazało się, że jeden z tych oligonukleotydów hamował namnażanie wirusa aż ośmio-krotnie a kilka innych w mniejszym stopniu. Istotnym osiągnięciem tej części rozprawy był brak efektu cytotoksycznego. 2
Rozprawę przeczytałam z dużym zainteresowaniem. Wnosi nowe interesujące dane do zagadnienia dotyczącego relacji pomiędzy strukturą różnych zakonserwowanych motywów strukturalnych w RNA wirusa grypy a jego funkcją. Jest ciekawa nie tylko z punktu widzenia naukowego ale również potencjalnego zastosowania praktycznego w przyszłości. Moje uwagi krytyczne są następujące: 1. Siedmiostronicowy tekst Streszczenia rozprawy jest stanowczo zbyt długi. Ta część nie powinna przekraczać jednej strony. Skrócenie tekstu Streszczenia do jednej strony byłoby z pewnością możliwe, pod warunkiem dokonania dogłębnej syntezy uzyskanych wyników. 2. Cel pracy mógłby być lepiej sformułowany. Wydaje się, że głównym celem było badanie struktury drugorzędowej segmentu 5 RNA(+) wirusa grypy, szczególnie pod kątem zakonserwowanych motywów strukturalnych. Natomiast zamieszczona w tym paragrafie siedmio-punktowa lista nie opisuje celu głównego a raczej cele szczegółowe. 3. Opis metodologii nie jest jasny, szczególnie dotyczący metod mapowania, co utrudniło mi podążanie za wywodem Doktorantki. Jednym z niedociągnięć w tej materii jest np. brak opisu metody SHAPE. To samo dotyczy innych fragmentów Materiałów i Metod, w których zabrakło choćby jednozdaniowego wyjaśnienia zasady działania stosowanych technik lub innych ważnych informacji. Np., w opisie metod na stronie 162 brak wyjaśnienia jakiego typu modyfikacje powstawały w wyniku inkubacji z DMS, CMCT ketoksalu i NMIA. To wyjaśnienie pojawia się dopiero w opisie Rysunku 15 Wstępu. Zamieszczenie tego typu wyjaśnień stanowiłoby potwierdzenie, że Doktorantka rozumie zasadę działania technik oraz metod, które zastosowała. 4. Kwestia przyjętych kryteriów oceny stopnia zachowawczości poszczególnych motywów fragmentu 5, stanowiąca sprawę kluczową tej rozprawy została przedstawiona dopiero na końcu rozprawy, w Materiałach i Metodach. Opis owych kryteriów powinien znaleźć się przed opisem wyników. 5. Dyskusyjna jest kolejność poszczególnych części rozprawy. Np., znacznie lepszym rozwiązaniem byłoby zamieszczenie na początku monografii Wstępu, który wprowadzałby cel pracy i pozwoliłby lepiej docenić nowatorskość oraz ważność podjętych badań. Potem powinny nastąpić Materiały i Metody ponieważ zapoznanie się z warsztatem było ważne dla podążania za wynikami. Ponadto, rozczłonkowanie dyskusji na poszczególne działy, nie sprzyjał uzyskaniu syntetycznego obrazu dokonań Doktorantki. Zamieszczenie na końcu rozprawy np. zestawienia celów z wnioskami byłoby bardzo cenne. 6. W końcowym podsumowaniu rozprawy brakuje odniesienia do Rycin. 3
7. opis rybozymu HDV w podrozdziale 4.5 na stronie 35 nie jest jasny. 8. Tekst monografii jest niestaranny i usiany literówkami które utrudniały zapoznanie się z tekstem, niejednokrotnie zmieniając znaczenie poszczególnych słów. Np. 2 -O-getylo-RNA, oligonukleotydy zostały syntetyzowane metodą aminofosforyną, korkiem zamiast krokiem, itd. 9. Doktorantka nie ustrzegła się przed stosowaniem żargonu laboratoryjnego, np. dnazowanie 10. Test zawiera ponadto sporo niezręczności językowych jak suszono na wirówce próżniowej, rozdzielano na żelu, ekran skanowano na aparacie, Jądrowa RNA helikaza, itd. 11. Stosowanie skrótów myślowych utrudniło podążanie za tekstem, np. podczas gdy podjednostki PB2 oraz PA/P3 są odpowiedzialne odpowiednio za wiązanie kapu oraz jego odcięcie od mrna gospodarza.,także: jedno cykliczny wirus grypy 12. Słowo konserwatywność zostało użyte w tekście około 130 razy, w tym w tytule rozprawy. Chodziło prawdopodobnie o zakonserwowanie, zachowawczość. Choć pojęcia zakonserwowanie i konserwatywność są prawie identyczne w brzmieniu i przez to często mylone, ich znaczenie różni się. Pojęcia te opowiadają angielskim conservative i conserved. Pojęcie konserwatywny conservative odnosi się wyłącznie do substytucji aminokwasowych w białku, przy czym konserwatywną jest substytucja zamieniająca aminokwas na inny lecz o podobnych właściwościach. Natomiast nie konserwatywna (przez to często sprawcza w kontekście chorób) oznacza, że doszło do zamiany na aminokwas o właściwościach odmiennych. Znaczenie zakonserwowany czyli conserved oznacza ewolucyjną zachowawczość i chyba o to znaczenie chodziło Doktorantce. Moje drobniejsze uwagi są następujące: 1. Wyniki hybrydyzacji do macierzy izoenergetycznych są słabo czytelne. 3. W Tabeli 9 dzielenie wyrazu w nagłówkach komplementarne nie jest prawidłowe. 4. Chyba Gibco a nie Gibko? 5. Triton X, czy chodziło o Triton X-100? 6. Co to jest grupa MMT? 7. Podrozdział 2.14 zawiera tylko dwa zdania. Brakuje informacji jak oczyszczano transkrypt. 8. Czy nie jest bardziej prawidłowy zapis: [Co(NH3)6]Cl3 zamiast Co(NH3)6Cl3? 9. Rysunek 1 zamieszczony we Wstępie rozprawy jest bardzo istotny i dlatego szkoda, że jego opis jest zbyt skrótowy. Na Rysunku zamieszczone są przeróżne znaki i symbole, których znaczenie nie zostało opisane. 4
10. W opisie Rysunku 11 brak odniesienia do 25-nukletydowego fragmentu. Podsumowanie Pomimo sporej liczby uwag krytycznych nie mam wątpliwości, że przedstawiona monografia jest niezwykle interesująca i bardzo wartościowa pod względem naukowym. Zawiera nowe dane, które mogą zostać wykorzystane w przyszłości w medycynie i z pewnością spełnia wymogi stawiane rozprawom doktorskim. Dlatego wnioskuję o dopuszczenie Pani mgr Marty Soszyńskiej-Jóźwiak do następnych etapów przewodu doktorskiego. 5