Recenzja rozprawy doktorskiej Pana mgr Rafała Filipa pt. "

Transkrypt

1 Wrocław Recenzja rozprawy doktorskiej Pana mgr Rafała Filipa pt. " Analiza teoretyczna białek wirusów grypy typu A z uwzględnieniem rejonów istotnych strukturalnie i funkcjonalnie, kierunków filogenezy i ich implikacji w strukturze białek." Wirusowa choroba układu oddechowego, czyli grypa, związana jest z człowiekiem, co najmniej od starożytności, ponieważ została opisano przez Hipokratesa już w 412 roku p.n.e. W późniejszych wiekach odnotowywano coraz częściej występujące pandemie i epidemie, w tym słynną hiszpankę z lat , która dotknęła 3-5% ówczesnej populacji człowieka. Mimo opracowywania sezonowych szczepionek, liczba zachorowań wciąż wzrasta z powodu zwiększania się zagęszczenia ludności, intensywnego przemieszczania się osób oraz tworzenia się nowych szczepów w wyniku reasortacji, czyli mieszania się materiału genetycznego, z wirusami pochodzącymi od zwierząt. Ponieważ dotychczasowe sposoby leczenia oraz tworzone szczepionki nie zawsze są skuteczne z powodu wzrostu oporności wirusa i powstawania jego nowych szczepów, konieczne są dalsze badania nad tym wirusem i mechanizmami jego infekcji. Dlatego bardzo słusznie przedmiotem pracy doktorskiej Pana mgr Rafała Filipa stała się szczegółowa analiza bioinformatyczna trzech kluczowych białek wirusa grypy typu A: hemaglutyniny, neuraminidazy i białka kanałowego M2. 1

2 Doktorant zastosował trzy podejścia do zbadania tych białek. Przeprowadził analizy filogenetyczne, aby określić relacje ewolucyjne między poszczególnymi szczepami wirusa. Określił poziom zmienności białek na poziomie aminokwasowym, aby zidentyfikować miejsca konserwatywne i najczęściej podlegające substytucjom. Dzięki temu mógł wskazać reszty aminokwasowe istotne z punktu widzenia funkcji i struktury białka. Ponadto poszukiwał mutacji sprzężonych, tj. takich, które zdarzają się jednocześnie w różnych miejscach sekwencji białka. Te analizy również pozwoliły wskazać grupy miejsc jednocześnie powiązanych funkcjonalnie i strukturalnie w białku. Miejsca te mogą mieć znaczenie w maskowaniu się wirusa przed działaniem przeciwciał układu odpornościowego, wytwarzaniu oporności na inhibitory oraz zmianę powinowactwa tych białek do docelowych cząsteczek. Recenzowana praca ma typowy układ i obejmuje: streszczenie i abstrakt w języku angielskim, wstęp, cele badawcze i zakres pracy, materiały i metody wykorzystane w pracy, wyniki i dyskusję, podsumowanie, literaturę oraz aneks. Streszczenie zawiera najbardziej istotne informacje związane z rozprawą i jest dobrym opisem najważniejszych zagadnień przedstawionych w pracy. Wstęp jest przejrzysty i bardzo dobrze wprowadza czytelnika do omawianych zagadnień oraz uzasadnia tezy pracy doktorskiej. Przedstawiono w nim ogólne informacje związane z wirusami ze szczególnym uwzględnieniem wirusa grypy typu A. Bardzo przystępnie i wyczerpująco przedstawiono budowę wirusa oraz jego cykl replikacyjny wykorzystując poglądowe rysunki. Najwięcej miejsca poświęcono trzem białkom będącym tematem rozprawy: hemaglutuninie, neuramidazie i białku M2. Opisano szczegółowo ich budowę i funkcję poszczególnych części oraz reszt aminokwasowych, a także niektóre aspekty ewolucyjne. Uwzględniono najnowsze dane literaturowe. Krótko scharakteryzowano zjawisko skoku antygenowego oraz leki skierowane na neuramidazę i białko M2. Opisano także hemaglutuninę jako cel dla przeciwciał i potencjalnych szczepionek. Jednakże mam kilka uwag do tej części. Pod Ryc. 1 przydałoby się wyjaśnienie skrótów białek. Tuż po stwierdzeniu, że dwie podjednostki HA1 oraz HA2 pełnią odmienną funkcję w cyklu replikacyjnym wirusa przydałoby się wyjaśnić te różnice. Podano, że białko M2 zbudowane jest z 97 reszt, co wskazuje, że powinno być nazywane peptydem, jeśli założymy granicę 100 reszt, ale oczywiście jest to sprawa umowna. Prosiłbym również doktoranta o wyjaśnienie, jaki jest mechanizm rozróżniania nici RNA o różnej polarności (plus i minus) prowadzący do tego, że tylko RNA o polarności ujemnej wędruje do błony i pakowany jest do nowych wirionów, a nie dotyczy to RNA o polarności dodatniej. 2

3 Cele pracy są dobrze uzasadnione i jasno opisane, chociaż nie sformułowano ich w formie punktów. Wszystkie zostały właściwie zrealizowane. Generalnie nie mam zastrzeżeń do przeprowadzonych analiz z punktu widzenia metodycznego. Jednakże prosiłbym o wyjaśnienie na czym polegało losowe dobieranie sekwencji i dlaczego je zastosowano (str. 30). W pracy podano, że zastosowano pięć programów do przyrównywania wielu sekwencji: ClustalX wersja 2.1, Kalign, T-Coffee, Multalin oraz GEISHA. Jednak nie podano jak duże różnice lub podobieństwa zaobserwowano w uzyskanych przyrównaniach. W przypadku analiz filogenetycznych dobrze byłoby zastosować metodę bootstrap do określania istotności poszczególnych gałęzi na drzewie. To pomogłoby w identyfikacji istotnie zgrupowanych sekwencji na drzewach. Można byłoby szerzej opisać oryginalne oprogramowanie do grupowania sekwencji SSSSg, tworzenia sekwencji konsensusowych Consensus Constructor oraz poszukiwania i analizy mutacji sprzężonych Corm. Rozdział z wynikami i dyskusją jest opisany w sposób logiczny i wyczerpujący. Doktorant szczegółowo opisał i przedyskutował uzyskane drzewa filogenetyczne, zmienność mutacyjną oraz mutacje sprzężone dla hemaglutuniny, neuramidazy i białka M2. Osobno przeprowadzono analizy w obrębie 18 znanych podtypów wirusa grypy oraz w przypadku podtypu H1 reprezentowanego przez największą liczbę sekwencji. Dodatkowe analizy poświęcono epitopom występującym na hemaglutuninie. W większości przypadków drzewa filogenetyczne uzyskane w programie SSSSg odbiegały od tych uzyskanych przez inne programy (tj. metodę przyłączania sąsiada i największej wiarygodności), które dawały topologie drzewa bardziej zgodne względem siebie. Doktorant interpretował, że wyniki tego pierwszego podejścia dla hemaglutuniny są mniej wiarygodne. Jednakże wynika to z faktu, że ten program poza identycznością reszt bierze pod uwagę również inne parametry, jak długość sekwencji i dystrybucję pozycji aminokwasowych, a zatem grupuje sekwencje na nieco na innych zasadach. Dlatego uzyskane drzewo nie musi odpowiadać innym. Taką właściwą interpretację doktorant podał w opisie drzew dla neuramidazy pochodzącej od różnych podtypów wirusa. W wielu miejscach w tekście doktorant opisywał, że uzyskane drzewa ogólnie różnią się między sobą, jednak obracając niektóre gałęzią można uzyskać zgodne topologie. Sądzę, że dobrze byłoby dokonać taki poprawek graficznych (chociaż jest to żmudne) i wtedy łatwiej by się porównywało te drzewa. Interesujący wynik dotyczy stwierdzenia, że sekwencje szczepów uzyskane w danym roku i pochodzące z odległych rejonów świata są pogrupowane razem na drzewie. Świadczy to swobodnym przemieszczaniu się ludności i szybkim rozprzestrzenianiu się 3

4 wirusa we współczesnym świecie. Ciekawe jest również wykazanie przypadku skoku antygenowego wywnioskowanego z grupowania się podtypów H1 i H5 na drzewie neuraminidazy w obrębie podtypu N1. Najwięcej miejsca doktorant poświęcił opisowi i interpretacji wyników zmienności mutacyjnej i mutacjom sprężonym. Uważam, że jest to najbardziej intersująca część pracy. Doktorant skrupulatnie opisał poszczególne mutacje i miejsca w białkach wykazujące dużą zmienność lub konserwatywność oraz umiejętnie powiązał ich opis z interpretacją funkcjonalną i strukturalną białek. Opisy te zostały zilustrowane na czytelnych rysunkach struktur przestrzennych i konsensusowych sekwencjach. Wyniki te są ważne, ponieważ zidentyfikowane pozycje mogą zostać wykorzystane do zaprojektowania nowych inhibitorów tych białek oraz opracowania skuteczniejszych szczepionek. Wiele ze zidentyfikowanych pozycji nie było wcześniej raportowanych. Mogą one być celami dla leków i przeciwciał neutralizujących wirusa. Ważne jest odkrycie, że wiele mutacji sprzężonych dotyczy reszt odległych (tzw. rozproszonych klastrów). Oznacza to, że mogą istnieć nieznane dotychczas zależności i oddziaływania między odległymi miejscami w strukturze białek. Jednakże mam też kilka uwag do tej części. Po zdaniach typu: Mutacje w obrębie tego regionu mogą mieć wpływ na patogeniczność wirusów grypy typu A [87, 88]. dobrze byłoby opisać na czym polega ten wpływ. Prosiłbym o wyjaśnienie na jakiej zasadzie polega dobieranie parametrów w programie Consensus Constructor, aby zminimalizować liczbę pozycji niejednoznacznych X. Nie jest dla mnie jasny opis podanych parametrów tego programu pod rysunkami: ilość kresek, ilość identycznych, ilość typowych. Czy opis nie powinien brzmieć liczba przerw i liczba reszt identycznych. Co oznacza termin typowych? W przypadku neuramidazy podano ogólny procent konserwatywności w obrębie tego samego podtypu i pomiędzy różnymi podtypami wirusa. Takie informacje przydałoby się podać także w przypadku innych białek. Parametry programu Consensus Constructor wykorzystane przy tworzeniu sekwencji konsensusowych dla poszczególnych podtypów podane na stronie 65 dobrze byłoby przedstawić w tabelce zamiast w tekście. W podpisie do Ryc. 32 dobrze byłoby wyjaśnić, że kolory oznaczają odpowiadające sobie szczepy. Dobrze przeprowadzona dyskusja wyników i właściwie wyciągnięte wnioski świadczą o dużej dojrzałości naukowej doktoranta i umiejętności wydobywania najważniejszych informacji z uzyskanych wyników. Za każdym razem doktorant krytycznie i obiektywnie podchodził do interpretowania uzyskanych wyników. Wnioski w podsumowaniu przedstawione są zwięźle i wyczerpująco opisują najważniejsze 4

5 osiągnięcia rozprawy. Bibliografia zawiera 108 pozycji anglojęzycznych, w tym najnowsze. Praca jest dobrze zorganizowana pod względem formalnym i należy podkreślić jej poprawne sformatowanie i ładną szatę graficzną, zwłaszcza rysunki struktur przestrzennych białek. Praca jest napisana poprawnym językiem i stylem. Warto podkreślić, że doktorant uniknął stosowania żargonu naukowego i bezpośredniego (często błędnego) tłumaczenia terminów naukowych z języka angielskiego. Jednak dostrzegłem pewne błędy przedstawione poniżej wraz z proponowanymi poprawkami: Hemaglutynina umożliwia przyłączanie się wirusa do komórki gospodarza, jest również jego głównym antygenem. -> Hemaglutynina umożliwia przyłączanie się wirusa do komórki gospodarza. Jest również głównym antygenem, na który skierowane są przeciwciała antywirusowe.; nie posiadające -> nieposiadające; przyjeły pasożytnicze podejście do replikacji -> zaczęły wykorzystywać komórki gospodarzy do swojej replikacji i propagacji; skąpo objawowo -> ze skąpymi objawami; można wyróżnić przede wszystkim dwie charakterystyczne glikoproteiny: hemaglutynina (oznaczana w skrócie jako H lub HA) oraz neuraminidaza (w skrócie N lub NA). -> można wyróżnić przede wszystkim dwie charakterystyczne glikoproteiny: hemaglutyninę (oznaczaną w skrócie jako H lub HA) oraz neuraminidazę (w skrócie N lub NA).; ilość cząsteczek -> liczba cząsteczek; przez długi okres czasu -> przez długi okres lub długo; utworzonego pora -> utworzonego poru; Łańcuch ciężki przeciwciała jest oznaczony kolorem szarym -> Łańcuch ciężki przeciwciała jest oznaczony kolorem ciemno szarym; więcej osób -> większej liczby ludzi; w danym okresie czasu -> w danym czasie lub okresie; została również dobrana sekwencja M2 z tego szczepu -> została również dobrana odpowiednia sekwencja M2 z tego szczepu.; W tej pracy -> W wynikach uzyskanych w tej pracy; zostały przybliżone fragmenty -> zostały opisane fragmenty; nie tworzące -> nietworzące; zawszę -> zawsze; Ilość sekwencji -> Liczba sekwencji; nie mającymi -> niemającymi; Substytucja wprowadzająca N-glikolizację -> Substytucja prowadząca do pojawienia się aminokwasu asparaginy ulegającego N-glikolizacji; bez kresek -> bez przerw; ilość kresek -> liczba przerw; poziom zachowania -> poziom konserwatywności; białkek -> białek; W tym badaniu znacząca liczba klastrów mutacji sprzężonych stanowią tzw. klastry -> tym badaniu, znaczącą liczbę klastrów mutacji sprzężonych stanowią tzw. klastry; Po za tym -> Poza tym. Na str. 17 niewłaściwe wydrukowało się oznaczenie jednostki angstrem. Nazwy rycina i tabela powinny być dużej litery. Zabrakło przecinków przed następującymi frazami w niektórych miejscach: z których; w których; która; który; które; na której; gdzie; co umożliwia; co zostało; co jest zgodne; iż; że; żeby; aby. 5

6 Stwierdzone przeze mnie zastrzeżenia nie rzutują jednak na bardzo pozytywną ocenę pracy, a przedstawione powyżej uwagi nie zmniejszają wartości ocenianej rozprawy. Przeprowadzone badania były bardzo zasadne, ponieważ istnieje potrzeba szczegółowego i kompleksowego przeanalizowania białek wirusa grypy. Przedstawione w pracy doktorskiej wyniki dostarczyły nowych danych na temat znaczenia poszczególnych miejsc w strukturze i funkcji trzech istotnych białka wirusa grypy. Mogą one znaleźć zastosowanie praktyczne w terapii antywirusowej i tworzeniu szczepionek. Mogą również pomóc zrozumieć mechanizmy infekcji na poziomie molekularnym. Uzyskane wyniki zostały opublikowane w trzech cytowanych pracach, jednak doktorant się nimi jawnie nie pochwalił: Żaroffe, G., Leluk, J., Żyźniewska, A., Filip, R Drug generations that combat influenza A virus infection. Bio-Algorithms and Med-Systems, 13(1): doi: /bams Filip, R., Leluk, J Phylogenetic analysis of M2 proteins from avian and swine influenza A viruses. Asian Journal of Applied Science and Engineering, 4(3): doi: /ajase.v4i3.762 Filip, R., Leluk, J., Żaroffe, G Researching correlated mutations in M2 proteins of Sswine and avian influenza a virus. Advances in Bioresearch, 6(6): doi: /abr Uważam, więc, że przedstawiona do recenzji rozprawa doktorska spełnia wszystkie wymogi Ustawy o Stopniach Naukowych. Zgłaszam, zatem wniosek do Rady Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu Zielonogórskiego o uznanie rozprawy Pana mgra Rafała Filipa za odpowiadającej wymogom stawianym rozprawom doktorskim i o dopuszczenie doktoranta do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Dr hab. Paweł Mackiewicz 6