Katedra i Zakład Mikrobiologii i Wirusologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Mikrobiologia ogólna Biotechnologia medyczna II rok / I o Instrukcja do ćwiczeń Temat: Powietrze jako środowisko życia mikroorganizmów. Mikrobiologiczne badanie powietrza i powierzchni płaskich Cz.1/Cz.2. I. Część teoretyczna 1.1. Bioaerozol Wszystkie mikroorganizmy obecne w powietrzu występują w postaci bioaerozoli. Bioaerozol jest to układ dwu- lub trójfazowy składający się z fazy rozpraszającej (powietrze) oraz rozproszonej (stałej lub ciekłej), zawierającej drobnoustroje. Faza rozproszona bioaerozolu składa się z drobnych cząsteczek wody, substancji organicznych pochodzących od człowieka i zwierząt oraz cząstek stałych - nasion, pyłków roślin, kurzu, komórek wegetatywnych i przetrwalników bakterii, fragmentów strzępek grzybów i zarodników, komórek drożdży i wirusów. Zawiera również endotoksyny oraz produkty metabolizmu grzybów - cząsteczki mikotoksyn, związane z komórkami lub innymi stałymi elementami bioaerozolu. Bioaerozole rozprzestrzeniają się w środowisku różnymi sposobami: - poprzez, tzw. drogę inhalacyjną, w momencie kaszlu, kichania, mówienia, w ten sposób rozprzestrzenia się głównie mikroflora patogenna człowieka, - przez przenoszenie cząstek aerozolu za pomocą prądów konwekcyjnych powietrza, ta droga jest charakterystyczna dla drobnoustrojów powietrza atmosferycznego oraz w pomieszczeniach, w których panuje wymuszony ruch powietrza (korytarze, budynki użyteczności publicznej), - poprzez system wentylacyjno-klimatyzacyjny pomieszczeń, przykładem może być rozprzestrzenianie się bakterii patogennych Legionella pneumophila w wilgotnych urządzeniach klimatyzacyjnych. Czas przeżycia mikroorganizmów w powietrzu zależy od wielu czynników, przede wszystkim od genetycznie uwarunkowanych cech gatunkowych, a nawet szczepowych, stanu fizjologicznego, wielkości oraz składu cząstek bioaerozolu, liczby mikroorganizmów obecnych w bioaerozolu oraz od warunków klimatycznych, głównie wilgotności i temperatury powietrza. Drobnoustroje w bioaerozolach mogą przetrwać znacznie dłużej niż pojedyncze komórki. Najdłużej pozostają przy życiu, oporne na niekorzystne wpływy warunków atmosfery, spory grzybów, przetrwalniki bakterii, szczególnie tolerujące niską wilgotność. Ze względu na skład jakościowy aerozole biologiczne można podzielić na: saprofityczne i zakaźne, a także mieszane, czyli składające się z dwóch wymienionych. Bioaerozole saprofityczne są odpowiedzialne za pogorszenie stanu higienicznego powietrza, co wiąże się przede wszystkim z wywoływaniem alergii u ludzi, a także z psuciem się produktów spożywczych, środków leczniczych, surowców dla wielu gałęzi przemysłu, materiałów budowlanych i innych. Bioaerozole zakaźne wywołują wiele chorób roślin, zwierząt i ludzi. Należą do nich: błonica, gruźlica płuc, grypa, katar, krztusiec, odra, ospa wietrzna, płonica, różyczka, grzybice oraz alergie. Ze względu na miejsce występowania bioaerozole dzielimy na zewnętrzne (powietrze atmosferyczne) i wewnętrzne (powietrze wewnątrz pomieszczeń). Podział ten wynika z różnego składu ilościowego mikroorganizmów w tych środowiskach oraz innych czynników kształtujących ten skład. Skład jakościowy mikroorganizmów jest zbliżony w bioaerozolach zewnętrznych i wewnątrz pomieszczeń. 1.2. Powietrze atmosferyczne Dominującą mikroflorą są grzyby strzępkowe, które stanowią około 70% wszystkich mikroorganizmów. Reprezentowane są głównie przez Cladosporium, Alternaria, Aureobasidium, Penicillium, Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Acremonium, Absidia, Botrytis, Fusarium, Geotrichum, Paecilomyces, Scopulariopsis, Trichoderma, Ulocladium. Ponadto obserwuje się sezonową dominację określonych rodzajów grzybów strzępkowych. Maksymalne stężenie popularnych aeroalergenów z rodzaju Cladosporium i Altemaria stwierdza się w lipcu i sierpniu; spory tych grzybów stanowią wtedy ponad 90% wszystkich spor obecnych w powietrzu atmosferycznym. Udział ilościowy bakterii waha się od 18 do 20%. Najczęściej spotykane są bakterie saprofityczne z rodzaju Micrococcus, Achromobacter i Bacillus. Bakterie z rodzaju Micrococcus stanowią od 30 do 70% wszystkich bakterii obecnych w powietrzu. Drugą liczną grupą są bakterie przetrwalnikujące z rodzaju Bacillus, ich udział wynosi od 20 do 60%. Zwykle około 5% bakterii wyizolowanych z powietrza stanowią promieniowce, pochodzące głównie z gleby. Drożdże są najczęściej reprezentowane przez rodzaje Torulopsis, Rhodotorula, Candida, Saccharomyces, lecz stanowią zaledwie 5% ogólnej liczby mikroorganizmów obecnych w powietrzu atmosferycznym. 1
1.3. Powietrze pomieszczeń zamkniętych Wśród mikroflory zanieczyszczającej powietrze pomieszczeń zamkniętych przeważa mikroflora saprofityczna. Najczęściej występują bakterie należące do rodzajów Micrococcus (ponad 42% izolatów), Staphylococcus (38,8%), Bacillus (10%), stanowiące w tym środowisku 68-80% wszystkich mikroorganizmów. Występować mogą również bakterie z rodzajów: Aeromonas, Mycobacterium, Pseudomonas, Xantomonas, Ochrobactrum, Pasteurella, Sphingomonas. W powietrzu o wysokiej wilgotności względnej (powyżej 70%) mogą być obecne promieniowce w ilości od 7 do 5,3x10 4 jtk/m 3 powietrza. Najczęściej występują gatunki należące do rodzajów: Streptomyces i Nocardia. Promieniowce mogą stanowić nawet 25-40% ogólnej liczby bakterii w powietrzu. Drobnoustroje te wydzielają do powietrza silne aromatyczne związki lotne, które mogą być przyczyną powstania objawów "Zespołu Chorego Budynku" (ang..sick Building Syndrome" - SBS). Występowanie spor grzybów strzępkowych w powietrzu pomieszczeń zamkniętych wynika z możliwości doskonałej adaptacji grzybów do warunków tam panujących. W powietrzu pomieszczeń zagrzybionych najczęściej występują pleśnie wywołujące alergię, z rodzajów Penicillium (częstotliwość izolacji w zależności od rodzaju pomieszczeń 45-90%), Cladosporium (22-73%), Aspergillus (17-52%), Altemaria (3-5%) i inne. Niepokojąca jest również obecność w tych pomieszczeniach grzybów toksynotwórczych, takich jak Aspergillus versicolor, A. flavus, A. ochraceus, Stachybotrys atra. II. Część praktyczna 2.1. Analiza mikrobiologiczna powietrza Schemat I oznaczanie liczby bakterii wg. PN-89/Z-04111/02 (Ochrona czystości powietrza. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie liczby bakterii w powietrzu atmosferycznym (imisja) przy pobieraniu próbek metodą aspiracyjną i sedymentacyjną). Przygotować podłoża Ogólna liczebność Promieniowce Pseudomonas Gronkowce Gronkowce bakterii fluorescens hemolizujące * mannitolododatnie i mannitoloujemne ** Agar odżywczy Podłoże Pochona Podłoże Kinga B Agar na bulionie Podłoże Chapmana z krwią baranią otworzyć płytki na określony czas (5, 10, 15 min) (w pomieszczeniu zamkniętym i na zewnątrz budynku) inkubacja temp 37 o C, 24-48 h temp 26 o C, 5 dni temp 26 o C, 5 dni 4 płytki w temp. 37 o C temp 37 o C, 24-48 h temp 4 o C, 7 dni (2 pł. przez 18-24 h 2 pł. po 1 h przenieść do 10 o C na 18 h) WYNIK policzyć kolonie na poszczególnych płytkach i obliczyć ilość bakterii w 1 m 3 powietrza wg wzoru * - hemolizę α liczyć na podłożu w temp. 37 o C * - hemolizę β na podłożu w temp. 10 o C ** - szczepy mannitolododatnie: kolonie duże, 1-3 mm, otoczone żółtą strefą ** - szczepy mannitoloujemne: kolonie mniejsze, białe i bez zabarwienia podłoża *,** - wykonać potwierdzenie obecności gronkowców i wykonać preparaty barwione metodą Grama (do obliczeń wybrać te kolonie z których preparaty wykazały obecność komórek kulistych, Gram dodatnich, występujących na ogół w nieregularnych skupiskach gronach. X = 5 x 10 4 x c / Πr 2 x t c średnia liczba kolonii bakterii na płytkach r promień płytki Petriego, cm t czas ekspozycji, min 5 x 10 4 współczynnik przeliczeniowy dla uzyskania liczby bakterii w 1 m 3 powietrza Wynik końcowy: Obliczyć liczbę oznaczanych bakterii i dokonać klasyfikacji zanieczyszczenia powietrza wg odpowiednich tabel. 2
Schemat II oznaczanie liczby grzybów wg. PN-89/Z-04111/03 (Ochrona czystości powietrza. Badania mikrobiologiczne. Oznaczanie liczby grzybów mikroskopowych w powietrzu atmosferycznym (imisja) przy pobieraniu próbek metodą aspiracyjną i sedymentacyjną). Przygotować podłoża 3 płytki 3 płytki z pożywką brzeczkowo-agarową z podłożem Czapek-Doxa (lub Sabourauda) otworzyć płytki w miejscu badania na okres 5, 10 i 15 minut (w pomieszczeniu zamkniętym i na zewnątrz budynku) inkubacja temp. 26 o C przez 3-5 dni (w razie słabego wzrostu czas inkubacji przedłużyć do 7 dni) policzyć wyrosłe kolonie grzybów i obliczyć liczbę grzybów w 1 m 3 powietrza wg wzoru: X = a x 10 4 / Πr 2 x 0,2 x t a średnia liczba kolonii grzybów r promień płytki Petriego, cm t czas ekspozycji, min 0,2 współczynnik przeliczeniowy Wynik końcowy: Obliczyć liczbę oznaczanych grzybów i dokonać klasyfikacji zanieczyszczenia powietrza wg odpowiednich tabel. 2.2. Ocena sanitarna otoczenia Zwilżyć sterylny tampon z waty w roztworze soli fizjologicznej (50 ml) Wykonać wymazy z powierzchni stołu i dłoni o znanych wymiarach ograniczonej sterylnym szablonem Tampon wrzucić do buteleczki z płynem fizjologicznym i dokładnie wytrząsnąć przez ok. 30 sekund (rozcieńczenie 10 0 ) Wykonać szereg dziesięciokrotnych rozcieńczeń zawiesiny wyjściowej (10-1 i 10-2 ) Z zawiesiny wyjściowej i kolejnych rozcieńczeń pobrać po 1ml i przenieść do sterylnej płytki Petriego, a następnie zalać agarem odżywczym (ok. 15 ml) i pozostawić do zestalenia Płytki odwrócić i poddać inkubacji w temp. 30 o C przez okres 72h Po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie i podać ich liczbę na 1 cm 2 wg wzoru: X = a x V / p gdzie: a liczba koloni wyrosłych na płytce z agarem odżywczym (należy uwzględnić stopień rozcieńczenia) V objętość soli fizjologicznej użytej do wypłukania tamponu z waty p powierzchnia (cm 2 ), z której pobrano wymaz 3
Tabela. Mikroorganizmy występujące w powietrzu pomieszczeń zamkniętych Tabela. Dopuszczalny stopień mikrobiologicznego zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego oraz różnych pomieszczeń (wg Krzysztofika, 1992). 4
Tabela. Zanieczyszczenie mikrobiologiczne powietrza w pomieszczeniach produkcyjnych Tabela. Stan mikrobiologiczny powietrza atmosferycznego Tabela. Klasyfikacja zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego bakteriami wg PN 89/Z-04111/02 Tabela. Klasyfikacja zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego grzybami wg PN 89/Z-04111/03 5
6