(12) OPIS PATENTOWY (19)PL

RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (21) Numer zgłoszenia: 298509 (22) Data zgłoszenia: 20.09.1991 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 20.09.1991, PCT/FR91/00741 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 02.04.1992, W O92/05251, PCT Gazette nr 08/92 (11)168666 (13)B1 (51) IntCl6: A01H 1/00 C12N 15/05 C12Q 1/68 (54) Sposób otrzymywania roślin hybrydowych (30) Pierwszeństwo: 21.09.1990,FR,9011670 (73) Uprawniony z patentu: Institut National de la Recherche Agronomique, Paryż, FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: 07.03.1994 BUP 05/94 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.03.1996 WUP 03/96 (72) Twórcy wynalazku: Sandrine Bonhomme, Paryż, FR Francoise Budar, Limours, FR Dominique Lancelin, Buc, FR Georges Pelletier, Bures/Yvette, FR (74) Pełnomocnik: PHZ POLSERVICE (57) 1. Sposób otrzymywania roślin hybrydowych, znamienny tym, że krzyżuje się roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej i zawierającą sekwencję DNA sterylności Ogury, która a) jest przenoszona przez sekwencję DNA ograniczoną przez nukleotydy o numerach 926 i 1569, na fig. 1, lub b) wykazuje co najmniej 50% homologii z wyżej wymienioną sekwencją, wspomnianą w punkcie a) i gdy występuje w genomie mitochondrialnym lub jądrowym rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską, z rośliną tego samego gatunku, mającą ewentualnie gen restaurator płodności Rfl. PL 168666 B1

Sposób otrzymywania roślin hybrydowych Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania roślin hybrydowych, znamienny tym, że krzyżuje się roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej i zawierającą sekwencję DNA sterylności Ogury, która a) jest przenoszona przez sekwencję DNA ograniczoną przez nukleotydy o numerach 926 i 1569, na fig. 1, lub b) wykazuje co najmniej 50% homologii z wyżej wymienioną sekwencją, wspomnianą w punkcie a) i gdy występuje w genomie mitochondrialnym lub jądrowym rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską, z rośliną tego samego gatunku, mającą ewentualnie gen restaurator płodności Rfl. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że krzyżuje się roślinę należącą do gatunku Brassica, zawierającą chloroplasty rodzaju Brassica zgodne z genomem jądrowym wymienionej rośliny i mitochondriami zawierającymi sekwencję DNA sterylności Ogury, która a) jest przenoszona przez sekwencję DNA ograniczoną przez nukleotydy o numerach 928 i 1569 na fig. 1 lub b) wykazuje co najmniej 50% homologii z wyżej wymienioną sekwencją wspomnianą w punkcie a), i gdy występuje w genomie mitochondrialnym lub jądrowym rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską z rośliną tego samego gatunku, mającą ewentualnie gen restaurator płodności Rfl. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej i należącą do rodzaju Brassica, której genom jądrowy zawiera sekwencję DNA sterylności Ogury, która a) jest przenoszona przez sekwencję DNA ograniczoną przez nukleotydy o numerach 928 i 1569 na fig. 1, lub b) wykazuje co najmniej 50% homologii z wyżej wymienioną sekwencję wspomnianą w punkcie a), i gdy występuje w genomie mitochondrialnym lub jądrowym rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską i presekwencję, umożliwiającą wprowadzenie do mitochondriów produktu translacji wymienionej sekwencji, jak również elementy zapewniające jego ekspresję oraz transport produktu translacji do mitochondrium. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica napus. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica oleracea. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica campestris. 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica juncea. 8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica nigra. 9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica hirta. 10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku Brassica carinata. 11. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę z gatunku B. napus, B. oleracea, B. campestris, B. nigra, B. juncea, B. hirta lub B. carinata. 12. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3 albo 11, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę otrzymaną przez fuzję protoplastów. 13. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3 albo 11, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę otrzymaną przez reprodukcję płciową.

168 666 3 14. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 11, znamienny tym, że jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę otrzymaną przez transfer genu do mitochondriów. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania roślin hybrydowych. Materiał biologiczny, posiadający cechę sterylności męskiej przydatny jest do opracowywania odmian hybrydowych gatunków mających znaczenie w agronomii. Szczególnie zaś jako materiał biologiczny przydatna jest roślina należąca do rodziny krzyżowych, której cytoplazma w komórkach zawiera organella posiadające sekwencje nukleotydowe, powodujące sterylność męską i korzystne cechy agronomiczne. Opracowanie odmian hybrydowych można ułatwić bądź umożliwić przez wykorzystanie układu cytoplazmicznej sterylności męskiej. Hybrydy otrzymuje się przez krzyżowe zapłodnienie pomiędzy dwiema populacjami form rodzicielskich, z których jedna odrywa rolę męską, zaś druga - żeńską. Jednym z wymogów spotykanych przy otrzymywaniu odmian hybrydowych o jednolitej jakości przez krzyżowanie płciowe wykonywane na gatunkach autogamicznych jest zdolność rośliny do samozapylania się. Układy sterylności męskiej pozwalają na otrzymanie roślin żeńskich niezdolnych do samozapładniania, z których po zapyleniu można - bez uciekania się do żmudnych technik, takich jak kastrowanie kwiatów - bezpośrednio zbierać nasiona, które wszystkie są hybrydami. Pośród genetycznych determinant sterylności męskiej są takie, których nośnikiem jest cytoplazma. W każdym pokoleniu płciowym są one przekazywane wyłącznie przez formę żeńską. Otrzymuje się zatem 100% form męskosterylnych w każdym pokoleniu wraz z układem cytoplazmicznej sterylności męskiej (CMS). Te determinanty genetyczne przenosi genom mitochondrialny. System cytoplazmicznej sterylności męskiej właściwy dla rodziny krzyżowych jest określony przez poniższe cechy: 1) sterylność męska winna być całkowita, tzn. jakiekolwiek są warunki hodowli jakakolwiek jest linia, którą chcemy wykorzystać jako formę rodzicielską żeńską, nie powinna występować tam produkcja pyłku. W przeciwnym razie nasiona zebrane z tych roślin żeńskich pochodziłyby częściowo z samozapłodnienia, a zatem nie byłyby typem hybrydy Fl. 2) Wytwarzanie tych roślin należy wykonać przy wykorzystaniu naturalnych wektorów pyłka, tzn. w przypadku tych gatunków: błonkoskrzydłych, dwuskrzydłych oraz wiatru. Pyłek powinien być przeniesiony z roślin zapylających na rośliny męskosterylne (żeńskie). W praktyce, jedynie owady mogą zapewnić przeniesienie pyłku na odległość. Rośliny żeńskie winny zatem być wystarczająco przyciągające dla owadów przylatujących w poszukiwaniu nektaru. Morfologia kwiatów powinna zmusić owada do tego poszukiwania poprzez wierzchołek kwiatu, który umożliwia zasadniczo kontakt z przetchlinką. W praktyce następuje to w ten sposób, że podstawa kielicha powinna utworzyć rodzaj rurki wokół podstawy słupka. 3) Morfologia organów żeńskich (słupek) powinna być identyczna jak w przypadku rośliny płodnej. W szczególności powinien występować pojedynczy słupek w kwiecie i mieć on postać prostoliniową. W istocie zdarza się często, że sterylne formy męskie wyrażają się także poprzez feminizację pylników, które zmieniają się w pseudosłupki, a nawet przez przekształcenie nektarów w pełnych kwiatach. Zdarza się także, że tam, gdzie zdeformowane są słupki, dotyczy to także produktów. Wszystkie te odchylenia nie pozwalają na prawidłową produkcję nasion i w tym przypadku można mówić o pewnej sterylności żeńskiej. 4) Do wytwarzania odmian hybrydowych Fl u gatunków, gdzie zbiera się nasiona, takich jak rzepa lub gorczyce, warunkiem niezbędnym jest, aby forma rodzicielska męska hybrydy całkowicie zlikwidował efekt sterylnej cytoplazmy męskiej tak, aby rośliny hybrydowe mogły być łatwo zapylone.

4 168 666 W przypadku rodziny krzyżowych pierwszy przypadek męskiej cytoplazmy sterylnej, gdzie CMS został opisany przez Ogurę (1968), dotyczył rzodkwi, Raphanus sativus. Bannerot (1974, 1977) przeniósł cytoplazmę Ogury na rodzaj Brassicae, otrzymując w ten sposób rośliny wykazujące cytoplazmiczną sterylność męską. Rośliny te nie posiadały zadowalających cech agronomicznych (chloroza w czasie obniżenia temperatury, zła płodność żeńska) i ich zła wydajność czyniła je nieodpowiednimi do wykorzystania handlowego. Dla uniknięcia chlorozy u roślin z rodziny krzyżowych użyteczne jest połączenie w tej samej komórce genomów jądrowych oraz chloroplastowych tego samego rodzaju. Stąd też rośliny rodzaju Brassicea posiadające jeden z genomów chloroplastycznych nie wykazują już chlorozy. W przypadku, gdy posiadają całość genomu mitochondrialnego Ogury, charakteryzują się pełną cytoplazmiczną sterylnością męską, lecz równocześnie morfologia kwiatów będzie wykazywać odchylenia, co sprawi, że ich zapylenie przez wektory naturalne będzie niemożliwe. Poza tym w przypadku gatunków, których nasiona mają znaczenie, użyteczne jest przywrócenie płodności męskiej odmian hybrydowych za pomocą genów jądrowych, zwanych restauratorami. Przywrócenie płodności męskiej w przypadku roślin posiadających całość genomu mitochondrialnego Ogury jest rzeczą trudną, ponieważ należałoby równocześnie wprowadzić do działania szerego genów-restauratorów. Celem wynalazku było opracowanie sposobu otrzymywania roślin hybrydowych z odpowiednim układem sterylności męskiej przy wyeliminowaniu genów odpowiedzialnych za cechy niepożądane w cytoplazmie Ogury i utrzymując efektywną i łatwą do przywrócenia sterylność męską. Sposób otrzymywania roślin hybrydowych według wynalazku polega na tym, że krzyżuje się roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej i zawierającą sekwencję DNA sterylności Ogury, która jest przenoszona przez sekwencję DNA ograniczoną przez nukleotydy o numerach 928 i 1569, jak przedstawiono na fig. 1, lub wykazuje co najmniej 50% homologii z wyżej wymienioną sekwencją, i gdy występuje w genomie mitochondrialnym lub jądrowym rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską, z rośliną tego samego gatunku, mającą ewentualnie gen restaurator płodności Rfl. Korzystnie w sposobie według wynalazku krzyżuje się roślinę należącą do gatunku Brassica, zawierającą chloroplasty rodzaju Brassica zgodne z genomem jądrowym wymienionej rośliny i mitochondriami zawierającymi sekwencję DNA sterylności Ogury, która jest przenoszona przez sekwencję DNA ograniczoną przez nukleotydy o numerach 928 i 1569 na fig. 1 lub wykazuje co najmniej 50% homologii z wyżej wymienioną sekwencją i, gdy występuje w genomie mitochondrialnym lub jądrowym rośliny, nadaje wymienionej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską z rośliną tego samego gatunku, mającą ewentualnie gen restaurator płodności Rfl. Korzystnie także w sposobie według wynalazku genom jądrowy zawiera presekwencję umożliwiającą wprowadzenie do mitochondriów produktu translacji wymienionej sekwencji, jak również elementy zapewniające jego ekspresję oraz transport produktu translacji do mitochondrium. Jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej w sposobie według wynalazku stosuje się roślinę z gatunku Brassica napus lub Brassica oleracea, lub Brassica campestris, lub Brassica juncea, lub Brassica nigra, lub Brassica hirta, lub Brassica carinata. Korzystnie, w sposobie według wynalazku, jako roślinę wykazującą cechę cytoplazmicznej sterylności męskiej stosuje się roślinę otrzymaną przez fuzję protoplastów lub roślinę otrzymaną przez reprodukcję płciową lub też przez transfer genu do mitochondriów. Określenie "sterylność Ogury" oznacza sekwencję DNA wykazującą następujące właściwości: a) nośnikiem jej jest sekwencja DNA ograniczona przez nukleotydy 928 i 2273 jak przedstawiono na fig. 1 lub b) wykazuje ona co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie a) i w przypadku obecności w genomie mitochondrialnym bądź jądrowym rośliny zapewnia u wspomnianej rośliny cytoplazmiczną sterylność męską.

168 666 5 W szczególnych przypadkach zaś sekwencja DNA "sterylności Ogury" posiada dodatkowe właściwości, takie jak to, że c) nośnikiem jej jest sekwencja ograniczona przez nukleotydy 928 i 1569 jak przedstawiono na fig. 1 lub d) wykazuje ona co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją wymienioną w punkcie c) oraz że jest transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin męskosterylnych. Wynalazek zilustrowano na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA mitochondrialnego z rzodkwi Ogury, noszącą cechę CMS; fig. 2 przedstawia mapę restrykcyjną fragmentu DNA mitochondrialnego opisanego w fig. 1; fig. 3 przedstawia elektroforezę DNA mitochondrialnego po trawieniu przez BgII (3a) i NruI (3b). Wykryte pasma odpowiadają hybrydyzacji z sondą CoxI. (Hiesel et al. 1987); fig. 4 przedstawia elektroforezę mitochondrialnego DNA po trawieniu przez SA1I. Wykryte pasma odpowiadają hybrydyzacji z sondą ograniczoną przez nukleotydy 389 i 1199 sekwencji opisanej na fig. 1; fig. 5 przestawia owoce wytworzone przez kapusty noszące różne genomy cytoplazmiczne; fig. 6 przedstawia elektroforezę RNA mitochondrialnego. Wykryte pasma odpowiadają hybrydyzacji z sondą, fragment EcoRI-BAM HI, włączającej część sekwencji nazywanej ORF B. Sekwencja DNA "sterylność Ogury" jest określona przez odniesienie do sekwencji ograniczonej numerami 1 i 2428 na fig. 1. Nośnikiem jej jest transkrybowana sekwencja, której skrajne punkty 3' i 5' są na fig. 2 połączone linią kropkowaną i którą obserwuje się wyłącznie u roślin męskosterylnych. ORF B odpowiada obszarowi rozpoczętego odczytu. Określenie to nadano wskutek zaobserwowanej homologii z sekwencją opisaną przez Brennicka. Na fig. 2 przedstawiono obszarem zakreskowanym sekwencję odpowiadającą jednemu z dwóch genów RNA, przenoszącego formylometioninę. Sekwencja DNA ograniczona przez nukleotydy oznaczone numerami 928 oraz 2273 na fig. 1 odpowiada transkryptowi, który może być uwidoczniony przez hybrydyzację molekularną (1,4), jak przedstawiono na fig. 6. Na fig. 6 każda "studnia" odpowiada roślinie płodnej (F)bądź męskosterylnej (S). Jedynie rośliny męskosterylne syntetyzują transkrypt około 1400 zasad. Ten transkrypt rozpoczyna się w pozycji 928 (10 zasad) z fig. 1 i kończy się w pozycji 2273 (5) (rozpoczęcie oraz zatrzymanie transkrypcji może się dokonać w różnych położeniach w mitochondriach roślinnych). Cytoplazma zawierająca sekwencję DNA wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną przez nukleotydy 928 oraz 2273 z fig. 1, zapewniającą cechę CMS lub cytoplazma zawierająca sekwencję DNA wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną przez nukleotydy 928 oraz 1569 z fig. 1 i transkrybowaną na RNA, nadającą cechę CMS obejmuje: - chloroplasty tego samego rodzaju co genom jądrowy bądź innego rodzaju lecz zgodne z tym genomem jądrowym, - nie obejmuje całości ani też części jednego bądź drugiego (bądź obydwu) fragmentu genomu mitochondrialnego Ogury który: - jest nośnikiem jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę, służącego do zapoczątkowania translacji, lub -jest nośnikiem genu CoxI, kodującego podjednostkę nr 1 oksydazy cytochromowej. Nieobecność tych fragmentów zwanych "sekwencjami niepożądanymi" jest niezbędna do otrzymania genomów mitochondrialnych o dobrej jakościowo sterylności męskiej, zgodnej z 4 cechami wymienionymi poprzednio. Zrekombinowany genom roślinny jądrowy bądź mitochondrialny charakteryzuje się tym, że obejmuje sekwencję DNA "sterylności Ogury" która jest przenoszona przez sekwencję DNA zawartą pomiędzy nukleotydami 928 oraz 2273 sekwencji przedstawionej na fig. 1. bądź która wykazuje co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją która w przypadku jej obecności w cytoplazmie rośliny - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską. W szczególnym przypadku zrekombinowany genom roślinny jądrowy lub mitochondrialny obejmuje sekwencję DNA "sterylności Ogury", która jest przenoszona przez sekwencję ograniczoną nukleotydami o numerach 928 oraz 1569 na fig. 1 lub która wykazuje co najmniej 50% homologii ze wspomnianą sekwencją oraz która - w przypadku obecności w cytoplazmie rośliny i transkrypcji na RNA - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską.

6 168 666 Genom jądrowy lub mitochondrialny można scharakteryzować przez to, że wspomniany genom zrekombinowany pozbawiony jest całości lub części fragmentów genomu Ogury, będącego nośnikiem jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę, służącego do zapoczątkowania translacji i będącego nośnikiem genu CoxI, kodującego podjednostkę nr 1 oksydazy cytochromowej, bądź też w którym wspomniane fragmenty są nieaktywne. Dokładniej, zrekombinowany genom jądrowy lub mitochondrialny może być pozbawiony całości lub części fragmentu około 10,7 kb po trawieniu przez BgII fragmentu około 11 kb po trawieniu przez NruI, nośników genu CoxI. Jest to uwidocznione w szczególności na fig. 3 przez hybrydyzację molekularną z sondą, która jest nośnikiem sekwencji CoxI. Może być on również pozbawiony całości lub części fragmentu 5,1 kb po trawieniu przez SalI lub fragmentu około 15 kb po trawieniu przez NruI fragmentu o około 18,5 kb po trawieniu przez BgII, nośników jednego z dwóch genów RNA przenoszącego formylometioninę. Uwidoczniono to w szczególności na fig. 4, przez hybrydyzację molekularną z sondą ograniczoną przez nukleotydy o numerach 389 oraz 1199 sekwencji opisanej przez fig. 1. Na fig. 3 oraz 4 genotypy oznaczone cyframi odpowiadają roślinom, w których występuje odpowiedni układ cytoplazmicznej sterylności męskiej. GENOTYPY CHLOROPLASTY MITOCHONDRIA B.n. B. napus B. napus 27 B. napus B. napus/ogura OGU R. sativus (OGU) R. sativus (OGU) 9,17,21,24,27c B. oleracea B. oleracea/ogura B.o. B. oleracea B. oleracea Ponadto istnienie dobrej jakościowo cechy CMS wymaga obecności sekwencji DNA, którą można oznaczać przez hybrydyzację DNA/DNA na produktach trawienia. Zatem sekwencja DNA, która mogła być określona charakteryzuje się tym, że zawiera sekwencję, która po trawieniu przez NcoI daje fragment o 2,5 kb, po trawieniu przez NruI daje fragment o 6,8 kb, zaś po trawieniu przez SalI daje fragment 0 4,4 kb. Sekwencję tę można również oznaczyć przez hybrydyzację całkowitego RNA roślina męskosterylnych. Uwidoczniono istnienie transkryptu o około 1400 parach zasad. Jest on nieobecny u roślin powracających do płodności. Określenie "niepożądanych" oraz "niezbędnych" z punktu widzenia "sterylności Ogury" - za pomocą technik hybrydyzacji DNA znanych specjalistom - materiału roślinnego o dobrej jakości, która jest nośnikiem chloroplastów zgodnych z genomem jądrowym oraz nośnikiem mitochondriów, bez konieczności oczekiwania na roślinę dojrzałą i pojawienie się kwiatów i owoców. Jest to zatem narzędzie bardzo skuteczne dla wyselekcjonowania roślin posiadających męskosterylną cytoplazmę, o korzystnych cechach agronomicznych. Jak wynika z przeprowadzonych badań mitochondrium w roślinach wykazujących cechę CMS zawiera sekwencję nukleotydową odpowiadającą DNA i wykazującą co najmniej 50% homologii z sekwencją ograniczoną zasadami o numerach 928 i 2273 na fig. 1 oraz kodującą cytoplazmiczną męską "sterylność Ogury". Ponadto w materiale roślinnym wykazującym tę cechę mitochondrium zawiera sekwencję DNA, której nośnikiem jest sekwencja ograniczona przez nukleotydy 928 i 1569 z fig. 1, bądź wykazująca 50% homologii z tą sekwencją i która jest transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin męskosterylnych. Wspomniane DNA może poza tym wykazywać cechy określone powyżej, w szczególności nieobecność sekwencji niepożądanych.

168 666 7 Cytoplazma rodziny roślin krzyżowych, charakteryzująca się tym, że zawiera sekwencję DNA "sterylność Ogury" obecną w genomie mitochondrialnym; cytoplazma ta zawiera poza tym chloroplasty tego samego rodzaju lub też innego rodzaju, lecz zgodnie z genomem jądrowym. Sekwencja "sterylność Ogury" charakteryzuje się tym, że: a) jest przenoszona przez sekwencję DNA złożoną z 2428 par zasad, jak przedstawiono na fig. 1, b) jest ograniczona przez nukleotydy 928 i 2273 z fig. 1 i odpowiada transkryptowi wskazanemu przez linie kropkowane na fig. 2 i uwidocznionemu przez hybrydyzację molekularną (1, 4) na fig. 6, c) wykazuje co najmniej 50% homologii z wymienioną sekwencją wspomnianą w punkcie b) i - w przypadku obecności w genomie mitochondrialnym rośliny - nadaje tej roślinie cytoplazmiczną sterylność męską, lub d) jest przenoszona przez sekwencję ograniczona przez nukleotydy 928 i 1569 z fig. 1 i transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin sterylnych, lub e) wykazuje co najmniej 50% homologii z sekwencją opisaną w punkcie d) i jest transkrybowana na RNA w mitochondriach roślin sterylnych. A zatem, w sposobie według wynalazku stosuje się rośliny z rodziny krzyżowych, zawierające chloroplasty i jądro tego samego rodzaju lub zgodne, oraz mitochondria będące nośnikiem genomu nadającego cechę CMS, taką jak określona powyżej. Dokładniej, stosowane w sposobie według wynalazku rośliny należące do rodzaju Brassica, zawierają chloroplasty i jądro Brassica oraz mitochondria będące nośnikiem genomu nadającego cechę CMS, taką jak określono powyżej. Ten genom mitochondrialny winien również być nośnikiem pewnej liczby genów rozpatrywanego gatunku Brassica. Uzyskuje się to przez rekombinację między genomem Ogury i genomem Brassica. W szczególnym przypadku stosuje się rośliny należące do gatunku Brassica napus, zawierające jądro Brassica i, których cytoplazma mieści w sobie chloroplasty Brassica oraz mitochondria męskosterylne będące nośnikiem DNA. Mitochondria te mogą również być nośnikiem większości genów mitochondrialnych Brassica napus (186, Atp9, Atp6, CoxII, ndh1, cob). Brassica napus odpowiada rzepakowi, bądź roślinom Canola i Rutabaga. W wyniku rekombinacji można również otrzymać rośliny gatunku Brassica oleracea, charakteryzujące się tym, że zawierają jądro Brassica oraz tym, że cytoplazma mieści w sobie chloroplasty Brassica i mitochondria zawierające sekwencję DNA, kodującą cechę CMS. Brassica oleracea obejmuje różne typy kapusty: kapusty głowiaste, kapustę brukselską, kalarepy, brokuły, kapusty pastewne i kalafiory. Analogicznie, w sposobie według wynalazku można również stosować rośliny gatunku Brassica campestris zawierające jądro Brassica i których cytoplazma mieści w sobie chloroplasty Brassica zgodne z genomem jądrowym oraz mitochondriami zawierającymi sekwencję DNA kodującą cechę CMS, taką jak określono. Brassica campestris odpowiada rzepakowi, brukwi, kapuście chińskiej, pekińskiej i japońskiej. Podobnie jak opisano powyżej można stosować rośliny wybrane z grupy zawierającej: B. juncea, B. nigra, B. hirta, B. carinata, zawierające jądro Brassica i których cytoplazma, mieści w sobie chloroplasty Brassica zgodne z genomem jądrowym oraz mitochondria zawierające sekwencję DNA kodującą cechę CMS, taką jak określono. Korzystnie stosuje się roślinę należącą do rodzaju Brassica, której genom jądrowy zawiera sekwencję "sterylność Ogury", taką jak określono powyżej, jak również elementy zapewniające jego ekspresję oraz transport produktu translacji do mitochondrium. Roślina ta może w szczególności należeć do jednego z następujących gatunków: B. napus, B. oleracea, B. campestris, B. nigra, B. juncea, B. hirta i B. carinata. Obecność "sekwencji sterylności Ogury" jest konieczna i wystarczająca dla indukowania całkowitej nieobecności pyłku przy nieobecności genów-restauratorów. Zapylenie tych roślin jest zapewnione normalnie dzięki prawidłowej produkcji nektaru.

8 168 666 Morfologia organów żeńskich jest normalna i dojrzałe owoce (łuszczyny) zawierają prawidłową liczbę nasion. Figura 5 ilustruje morfologię zaobserwowaną u rośliny normalnej - świadka (z), rośliny o morfologii odchylającej się od normy, posiadającej cały genom Ogury [z(6)] i chloroplasty Brassica oleracea, kapusty, będącej nośnikiem chloroplastów Brassica napus i mitochondriów męskosterylnych, posiadających geny Brassica oleracea i zrekombinowanych mitochondriów, nie zawierających już niepożądanych sekwencji [z(9) i z(17)]. Rośliny te mają następujące cechy: GENOTYPY CHLOROPLASTY MITOCHONDRIA z B. oleracea B. oleracea z (A) B. napus B. napus/ogura 2 (6) B. oleracea Ogura z(9) B. oleracea B. oleracea/ogura z (17) B. oleracea B. oleracea/ogura Genotypy z(a) i z(6) nie wykazują odpowiedniego układu cytoplazmicznej sterylności męskiej. Takie rośliny otrzymuje się przy użyciu technik, które zapewniają prawidłową rekombinację między genomem mitochondrialnym rozpatrywanego gatunku a genomem mitochondrialnym Ogury. U takich roślin płodność jest restaurowana przez pojedynczy gen-restaurator, zwany Rfl, pochodzący z rzodkwi, co nie zachodzi w przypadku roślin, które są nośnikiem całości nieodpowiedniego genomu mitochondrialnego. Takie rośliny można również otrzymać przez naturalną lub sztuczną reprodukcję płciową. Rośliny mające genom mitochondrialny można również otrzymać przez transfer genu do mitochondrium. We wszystkich przypadkach rośliny te mają właściwy układ CMS, a mianowicie: - całkowitą sterylność męską, - morfologię pozwalającą na prawidłowe zapylenie i prawidłową produkcję nasion, jak to zilustrowano w tabeli 1 oraz tabeli 2. Uogólniając, najlepsze cechy agronomiczne otrzymuje się dla roślin męskosterylnych posiadających chloroplasty tego samego gatunku co jądro i mitochondria wykazujące odpowiedni układ sterylności męskiej. Tabela 1 przedstawia wydajność linii kapusty na różnych cytoplazmach, (odpowiednie są genotypy z9 lub zl7). Tabela 2 przedstawia wydajność linii rzepaku na różnych cytoplazmach (odpowiednie są genotypy Fu 27, Fu 58 i Fu 85). Wynalazek ilustrują bliżej następujące przykłady. Przykład I. Wykrycie sekwencji DNA odpowiedzialnej za cytoplazmiczną sterylność męską Ogury 1. Roślina Przez "cybrydę" określa się formy otrzymane przez fuzję izolowanych protoplastów, po której następuje regeneracja całej rośliny. Taki sposób otrzymywania pozwala na połączenie w komórce informacji cytoplazmicznych pochodzących od obydwu form rodzicielskich. Cybrydę nr 13 otrzymano pośród 820 roślin regenerowanych przez fuzję protoplastów między cybrydą B. napus odporną na triazynę, cms Ogury (potomstwo cybrydy 77 opisanej w Pelletier et al., 1983 oraz Chetrit et al., 1985) oraz odmianę pochodzącą od Brutor, wrażliwą na triazynę oraz płodną. Próba odporności na triazynę (Ducruet i Gasąuez, 1978) wykonana na próbę liścia każdego regeneranta pozwoliła na ustalenie typu chloroplastu (chloroplasty odporne na triazynę pochodzące od formy rodzicielskiej 77 lub chloroplasty wrażliwe na triazynę pochodzące z linii Butor). Wyhodowano rośliny i obserwowano stadium kwitnienia. Rośliny będące kombinacjami nierodzicielskimi (bądź czułe /męskosterylne bądź odporne/ męskie płodne) wyselekcjonowano

168 666 9 Chloroplasty B. oleracea B. napua B. napus B. oleracea Ogura B. oleracea Tabela 1 Wydajność linii z (kapusta do kwaszenia) przy różnych cytoplazmach Cytoplazma Genotypy Mitochondria B. oleracea Ogura Ogura/napus Ogura Ogura Ogura/oleracea (z) (zc) (za) (z6 ) (zo) (z9 lub z17) Zbiór nasion gram/rośl ina 53, 1 0 2 2,7 9,3 2 0,1 91,8

10 168 666 DARMOR Fu 27 Fu 58 Fu 77 Fu 85 Fu 118 BIENVENU JET NEUF Tabela 2 Wydajność linii DARMOR (rzepak zimowy) przy różnych cytoplazmach Wydajność Rzepak zimowy DARMOR: męski płodny i męskosterylny Wydajność (% DARMOR ) Chloroplasty 100 ( 35 q ) 118 120 96 1 4 103 108 89 B. napus B. napua B. napua B. campeatria B. napua B. napua Mitochondria B. napus B. napua/ogura B. napua/ogura Ogura B. napua/ogura B. napua/ogura

168 666 11 Tabela 2 (dokończenie) Składniki wydajności (Clermont-Ferrand) NS PIS NGPS NG PIG DARMOR BIENVENU JET NEUF 7183 7334 7977 81,9 80,7 87, 7 9,9 11,2 8,6 70028 81841 67291 4,31 3,88 4,98 Fu 27 DARMOR Fu 38 DARMOR Fu 118 DARMOR * 9292 8617 8389 82,8 76,3 84,6 11,6 11.7 11,0 106188 99947 92428 4,09 3,63 4,11 NS: Liczba łuszczyn/m2 - PIS : ciężar łuszczyny (mg) - NGPS: liczba nasion na łuszczynę NG : liczba nasion/m - PIG : ciężar nasiona (mg) - MST : Substancja sucha ogółem (g/m) H I" Wskaźnik zbiorów (%) - RDT : Wydajność (q/ha) - HT : Wysokość (cm) ) Rośliny te wykazują często zdeformowane owoce (łuszczyny) MST 1077 1064 1176 1337 1228 12 4 3 HI 0,256 0,269 0,262 0,293 0,270 0,276 RDT 31,6 30,7 33,3 42,2 36,0 38,1 HT 120 109 113 122 131 132

12 168 666 jako cybrydy. Cybryda nr 13 była typu wrażliwa/męskosterylna. Cybryda 1 była typu odporna/męska płodna. 2. Wyodrębnienie kwasów nukleinowych Całkowity DNA wyodrębniono przy użyciu liści pochodzących z czterotygodniowych roślin według metody opisanej przez Dellaporta (1983). DNA mitochondrialny wyekstrahowano z liści ośmiotygodniowych roślin tak jak opisali to Vedel i Mathieu, 1982, z następującymi wariantami: mitochondria nie zostały oczyszczone w gradiencie sacharozy po lizie i lizę wykonano w sarcosylu 4% z proteinazą K 0,5 mg/ml (Boehringer Manheim GmbH), w Tris ph 8, 50 mm, EDTA 20 mm. Po wytrąceniu, DNA mitochondrialny oczyszczono przez odwirowanie w gradiencie bromku etydyny - chlorku cezu (metoda 1- Vedel i Mathieu 1982) w probówkach do odwirowania w poliallomerze. Całkowite RNA wyodrębniono przy użyciu liści lub pączków kwiatowych według pracy Logemanna et al., 1987. RNA mitochondrialne wyekstrahowano z ośmiotygodniowych kalafiorów według techniki Sterna i Newtona, 1986. 3. Analizy przez restrykcję DNA mitochondrialnego oraz elektroforezę w żelu agarozowym Analizy wykonano tak jak opisali Pelletier et al., 1983. Całkowite lub mitochondrialne RNA umieszczono na żelach elektroforetycznych zawierających formaldehyd tak, jak to opisali Sambrook et al., 1989. 4. Hybrydyzacja Przeniesienie DNA bądź RNA na filtry nylonowe (Hybond-N, Amersham) wykonano przez absorpcję kapilarną przy użyciu, odpowiednio, 6xSSC bądź 10xSSPE według instrukcji producenta. Prehybrydyzację i hybrydyzację przeprowadzono według Amershama wykorzystując sondy znaczone przez wieloinicjujący układ znaczenia DNA (Amersham) po oczyszczeniu na kolumnach Sephadex 650 (Sambrook et al., 1989). 5. Klonowanie DNA mitochondrialnego Dwa banki genomowe linii cybrydy męskosterylnej (13-7) oraz rewertanta (13-6) utworzono w wektorze fagu lambda EMBL3 i hodowano na szczepie restryktywnym E.coli Nm539 (Frischauf et al., 1983). Otrzymano około 2,5x104 klonów na mg DNA mitochondrialnego. Banki DNA mitochondrialnego mianowano i rozwinięto w celu wyodrębnienia warstewek, które przeniesiono na filtry nylonowe, tak jak opisali Sambrook et al., 1989. Sondę hybrydacyjną wykorzystywaną do skrinowania dwóch banków DNA mitochondrialnego przygotowano następująco: fragment DNA mitochondrialnego specyficzny dla CMS wymyto wykorzystując procedurę Gene cleantm (BIO 101 INC.) przy użyciu produktu trawienia DNA mitochondrialnego umieszczonego na preparatywnym żelu agarozowym. Wymyty DNA następnie znaczono tak jak to zostało opisane. Ekstrakcja DNA Lambda, podklonowanie fragmentu Ncool 2,5 w miejscu NcoI ptrc99a (Amann et al., 1988) oraz ekstrakcje DNA plazmidowego wykonano według protokołów Sambrooka et al., 1988. Plazmidu rekobinujące wprowadzono na szczep E.coli NM522 (Gough i Murray, 1983). 6. Badanie genetyczne cybrydy 13 i jej potomstwa W pierwszym pokoleniu potomstwa otrzymanego przez zapylenie cybrydy 13 przez Brutor, złożonym z 13 roślin pięć jest całkowicie męskosterylnych (włączając w to rośliny 13-2 i 13-7), jedna męska płodna (numer 13-6) i siedem praktycznie całkowicie sterylnych z kilkoma kwiatami męskimi płodnymi. Roślina płodna 13-6 została samozapylona oraz skrzyżowana z Brutorem. W dwóch przypadkach otrzymuje się wyłącznie rośliny płodne (odpowiednio 43 i 42). W przypadku krzyżowania rośliny męskosterylnej numer 13-7 oraz Brutora 24 potomków jest całkowicie sterylnych, zaś 6 ma kilka płodnych; jest to wynik podobny do otrzymanego przy użyciu samej cybrydy. Roślinę 13-2 skrzyżowano z linią restaurującą RF, która jest heterozygotą

168 666 13 dla specyficznych genów-restauratorów męskiej "sterylności Ogury" (Chetrit et al., 1985). Potomstwo tej krzyżówki składa się z 53 roślin męskosterylnych, 37 roślin męskich płodnych oraz 9 roślin praktycznie całkowicie sterylnych, jednakże zawierających kilka kwiatów płodnych. Wyniki te sugerują, że rośliny męskosterylne z rodziny cybrydy 13 zawierają determinantę CMS Ogury, podobnie jak inne cybrydy badane poprzednio o prostszym profilu restauracji (Chetrit et al., 1985). W tym stadium badań można było wziąć pod uwagę dwie możliwości: albo - cybryda 13 zawiera mieszaninę genomów mitochondrialnych męskich płodnych oraz męskosterylnych i można je bardziej wyselekcjonować w celu oczyszczenia dwóch fenotypów lub też - cybryda 13 zawiera zrekombinowany genom mitochondrialny o niestabilnej strukturze, który wraca do bardziej stabilnej konfiguracji "płodnej" i będzie niemożliwe utrzymanie jednorodnego fenotypu męskosterylnego w następnych pokoleniach. Sterylne rośliny męskie, otrzymane przy użyciu potomstwa sterylnej rośliny męskiej numer 13-7, uzyskano równocześnie przez rozsadę i przez krzyżowanie płciowe z Brutorem. Po zmiennej liczbie pokoleń (1-5) za pomocą obydwu metod wszystkie rodziny dały rośliny płodne. Inaczej jest w przypadku otrzymanych w ten sposób roślin całkowicie płodnych, które nie dają nigdy ponownie roślin sterylnych. W świetle tych wyników można wziąć pod uwagę, że drugie wyjaśnienie zaproponowane powyżej czyli, że cybryda 13 zawiera niestabilny genom mitochondrialny, który traci determinantę CMS Ogury podczas procesu prowadzącego do konfiguracji "płodnej" bez możliwości powrotu do fenotypu sterylnego jest wyjaśnieniem poprawnym. 7. Porównanie mitochondrialnego DNA w przypadku roślin męskosterylnych oraz płodnych rewertantów. Wyodrębnienie specyficznego fragmentu roślin męskosterylnych. DNA mitochondrialny wyekstrahowano z liści męskosterylnego potomstwa 13-7 oraz płodnych rewertantów (potomstwo 13-6 lub 13-7) i trawiono licznymi enzymami restrykcyjnymi w celu porównania jego profilu restrykcyjnego. Genomy mitochondrialne dwóch typów są bardzo podobne, gdyż nie można zaobserwować żadnej różnicy między profilami restrykcyjnymi mitochondriów męskosterylnych i płodnych rewertantów uzyskanymi przy użyciu rozmaitych enzymów. Jednak fragment restrykcyjny o 6,8 kb wykryto w profilu restrykcyjnym DNA mitochondrialnego roślin męskosterylnych trawionych przy użyciu NruI, zaś nigdy nie zaobserwowano w profilach odpowiednich płodnych rewertantów. Fragment (zwany N6,8) wymyto z żelu agarozowego, znaczono i wykorzystano jako sondę na profilach restrykcyjnych DNA mitochondrialnego otrzymanych przy użyciu NruI: ważny sygnał przy 6,8 kb zaobserwowano u całego męskosterylnego potomstwa cybrydy 13, podczas gdy żaden fragment tej wielkości nie uległ hybrydyzacji z sondą w genomach mitochondrialnych płodnych rewertantów. Poza tym, sonda N6,8 hybrydyzuje z fragmentem o 6,8 kb w mitochondrialnym DNA Ogury trawionym przy użyciu NruI; sonda nie hybrydyzuje natomiast z fragmentem pochodzącym od B. Napus cv Brutor, wskazując że fragment ten jest pochodzenia Ogury. Bank lambda zawierający ekstrakty DNA mitochondrialnego pochodzącego od roślin męskosterylnych (13-7) sprawdzono ze znaczonym wymytym fragmentem i spośród 8 klonów hybrydy żujących wyodrębniono 2 fagi rekombinując zawierające cały fragment N6,8 oraz sekwencje sąsiadujące. Otrzymano szczegółową mapę restrykcyjną tego obszaru. Hybrydyzacja profilu restrykcyjnego DNA mitochondrialnego, pochodzącego do potomków płodnych i sterylnych cybrydy 13 z N6,8 w charakterze sondy, pozwoliła ograniczyć obszar specyficzny genotypu męskosterylnego do fragmentu NcoI o 2,5 kb. Fragment NcoI o 2,5 kb znaczono i wykorzystywano jako sondę w stosunku do DNA mitochondrialnego pochodzącego od potomków 13-7 i 13-6 trawionego przy pomocy NcoI. Oprócz sygnału przy 2,5 kb specyficznego dla profilu męskosterylnego, liczne fragmenty NcoI hybrydyzują równocześnie w profilach płodnych rewertantów oraz profilach męskosterylnych; fragmenty te są przy 2,2, 10 i 14 kb. Fragment NcoI o 2,7 kb silnie hybrydyzuje w genomie mitochondrialnym płodnych potomków natomiast nie hybrydyzuje w przypadku potomków sterylnych. Analiza tego profilu hybrydyzacji prowadzi do wniosku, że fragment NcoI o 2,5 kb, chociaż specyficzny dla męskosterylnego DNA mitochondrialnego, zawiera sekwencje które

14 168 666 powtarzają się gdzie indziej w genomie mitochondrialnym (we fragmentach o 2,2, 10 i 14 kb po wytrawieniu przy użyciu NcoI) i te powtarzające się sekwencje są również obecne w DNA mitochondrialnym płodnych rewertantów poza specyficznym fragmentem o 2,7 kb. Całkowite RNA wyekstahowano z liści lub z zalążków potomków cybrydy 13 lub z męskosterylnych lub płodnych cybryd (pochodzących z innych doświadczeń polegających na fuzji) i linii Brutor. Northem blots (przemieszczenia typu Northem) wykonano i hybrydyzowano z sondą odpowiadającą wstawce (insertowi) klonu lambda zawierającego N6,8 opisanego w przykładzie 3. Wykryto główny transkrypt o 1,4 kb u wszystkich cybryd męskosterylnych także w przypadku cybrydy 13-7 podczas gdy nie zaobserwowano żadnego transkryptu tej wielkości w linii Brutor ani też w przypadku dwóch cybryd płodnych (różnych od cybrydy 13). Ponadto rośliny płodne wykazują transkrypt o 1,1 kb hybrydyzujący z sondą, nieobecny lub obecny na bardzo niskim poziomie, we wszystkich badanych cybrydach męskosterylnych. Liczne transkrypty wspólne dla wszystkich próbek hybrydyzujących słabo z sondą z powodu znacznej wielkości znaczonej wstawki (insertu). Sprawdzono, że trankskrypty mitochondrialne w próbkach całkowitego RNA można wykryć przez hybrydyzację samego DNA zawierającym sekwencję genu atpa. Ten sam specyficzny transktrypt o 1,4 kb znaleziono w mitochondrialnych RNA Ogury wyekstrahowanych z kalafiorów przy użyciu jako sondy fragmentu NcoI 2,5. Dokładne granice tego transkryptu wyznaczono przy wykorzystaniu w charakterze sondy podklonów fragmentu NcoI 2,5. 8. Badanie cybrydy 1 i jej potomstwa. Cybryda 1 była płodną formą męską. Spośród jej potomstwa roślina 1,12 była płodna zaś roślina 1,18 - sterylna. Roślina 1,12 dała jako potomstwo rośliny sterylne (S3) i rośliny płodne (RF3). Roślina 1,18 dała rośliny sterylne (S2) oraz gałąź płodną (RF2). Rośliny S2 i S3 restauruje się tym samym jądrowym genem restaurującym płodność pyłkową co w przypadku sterylnej cybrydy 13. DNA mitochondrialny roślin S2 i S3, znaczony przez hybrydyzację z fragmentem NcoI o 2,5 kb, nie daje sygnału przy 2,5 kb po trawieniu przez NcoI, ani też sygnału przy 6,8 kb po trawieniu przez Nful. Podobnie hybrydyzacja całkowitego RNA (Northem) z sondą odpowiadającą sekwencji ORFB nie daje sygnału przy 1,4 kb, jak w przypadku sterylnej cybrydy 13. Natomiast sonda odpowiadająca sekwencji między nukleotydami 928 i 1569 z fig. 1, daje sygnał w Northem przy około 1,3 kb. Sygnał ten jest nieobecny w przypadku RNA roślin RF1, RF2, RF3 lub Brutor. Podobnie możliwe jest wykorzystywanie tej sekwencji (928-1569) jako sondy przy przesunięciu punktowym (dot biot) całkowitych RNA i w tym przypadku wszystkie rośliny męskosterylne dają sygnał. Powyższe wyniki wskazują, że rośliny S2 i S3, mimo że męskosterylne, nie zachowały sekwencji nukleotydowej, opisanej na fig. 1, w swojej oryginalnej konformacji i pokazują, że część tej sekwencji zawarta między nukleotydami 928 i 1569 jest nośnikiem specyficznej determinanty "sterylności Ogury"; czyni ona rośliny męskosterylnymi, gdy ta sekwencja ulegnie transkrypcji. Sekwencja ta nie ma znaczącej homologii z sekwencjami obecnymi w bankach danych. Przykład II: Wykrycie sekwencji niepożądanych w genomie mitochondrialnym Ogury Zbiór cybryd otrzymano w ramach gatunku B. napus przez fuzję protoplazmów rzepaku będącego nośnikiem cytoplazmy Ogury i rzepaku normalnego. Pierwszy z nich jest męskosterylnych i ma deficyt chlorofilu w niskiej temperaturze, drugi zaś jest normalnie zielony i płodny. Cybrydy wyselekcjonowano spośród roślin regenerowanych i zachowano te które były męskosterylne i prawidłowo zielone. W identyczny sposób otrzymano zbiór cybryd w ramach gatunku B. oleracea przez fuzję protoplastów kapusty będącej nośnikiem cytoplazmy Ogury i kapusty normalnej. Spośród roślin regenerowanych zachowano te cybrydy, które były męskosterylne i normalnie zielone. Cybrydy te skrzyżowano z różnymi odmianami - odpowiednio - rzepaku bądź kapusty. Krzyżówki te powtarzano w każdym pokoleniu z tymi samymi odmianami tak, by otrzymać określony genotyp bliski genotypu takiego, jak w przypadku odmiany wstecznej.

168 666 15 Wspomniane wyżej różne odmiany przekształcone w ten sposób na cytoplazmach różnych cybryd poddano próbom agronomicznym w celu zmierzenia produkcji nasion; zależy ona od szeregu czynników: produkcji nektaru wystarczającej dla zapewnienia zapylenia przez owady, prawidłowej morfologii kwiatowej tak by zapylenie było skuteczne i by owoce się prawidłowo rozwijały. Zbiór cybryd mógł być zatem podzielony na dwie partie: - partię cybryd wykazującą sterylność męską odpowiednią dla handlowej produkcji nasion - partię cybryd nie wykazującą wszystkich cech korzystnych dla prawidłowej produkcji handlowej nasion. Do pierwszej partii przynależą np. cybrydy rzepaku nr 27, 58, 85 oraz cybrydy kapusty nr 9, 17, 21, 24 i 27c. Do drugiej partii przynależą np. cybrydy rzepaku nr 23s, 77, 118 oraz cybrydy kapusty nr 1, 6 i 14. Całkowite DNA tych cybryd poddano trawieniu przez enzymy: SalI, NcoI, NruI, BgII, Pstl, Kpnl. Otrzymane Southern blots (przeniesienią typu Southern) hybrydyzowano z różnymi sondami mitochondrialnymi Atpa, Cob, CoxI, Atp6, 26S, 18S, i dwoma fragmentami genomu Ogury: o 2,5 kb otrzymanym po trawieniu przez NcoI i o 19,4 kb otrzymanym po trawieniu przez NruI. Dwie partie cybryd różnią się następująco: a) nr, nr, 23S, 77,11S - w przypadku rzepaku- oraz 1,6,11 -w przypadku kapusty- posiadają obszar genomu Ogury, który otacza gen coxl rozpoznawalny przez fragmenty BgII o 10,7 kb lub NruI o 11 kb oraz obszar genomu Ogury, który otacza jeden z genów RNA przenoszącego formylometioninę, rozpoznawalny przez fragmenty sali o 5,1 kb i NruI o 15 kb. b) nr, nr, 27,58, 85 -w przypadku rzepaku- oraz 9, 17,21, 24 i 27c -w przypadku kapustynie posiadają obszarów odpowiadających które zostały zamienione - na skutek rekombinacji między genomami dwóch form rodzicielskich, które uległy fuzji - przez analogiczne obszary genomu mitochondrialnego rzepaku w przypadku nr, nr, 27, 58, 85 oraz kapusty w przypadku nr, nr, 9, 17, 21, 24 i 27c. Na tej podstawie wnioskuje się, że dwa rozpatrywane obszary genomu Ogury są niepożądane, jeśli chce się uzyskać układ sterylności męskiej odpowiedni dla handlowej produkcji nasion. Przykład III. Niniejszy przykład ilustruje znaczenie znajomości sekwencji męskiej "sterylność Ogury" oraz sekwencji niepożądanych dla wykonania bezpośredniego wyselekcjonowania otrzymanych cybryd bez konieczności wieloletniego krzyżowanie wstecznego oraz testów agronomicznych. Łączy się protoplasty rośliny z rodzaju Brassica będące nośnikiem cytoplazmy Ogury z protoplastami rozpatrywanego rodzaju Brassica. Uzyskane w wyniku fuzji kolonie hoduje się in vitro i powoduje regenerację w środowisku, które sprzyja tworzeniu pączków (zob. Pelletier et al., 1983). Przy użyciu 1 g świeżego materiału, co dotyczyłoby zasklepki lub fragmentu regenerowanego zarodka roślinnego, możliwe jest przy użyciu technik opisanych poprzednio wyodrębnienie całkowitego DNA. Po trawieniu przez sali, hybrydyzacja typu Southern z sondą zawartą między nukleotydami nr 389 i 1199 (zob. fig. 1) powinna dać sygnał jedynie dla 4,4 kb (nie powinna dać sygnału przy 5,1 kb). Podobni po trawieniu rzez NruI i hybrydyzacji z sondą zawierającą gen coxl powinno się otrzymać sygnał dla wielkości różnej od 11 kb. Wspomniane hybrydyzacje pozwalają przewidzieć, że dysponuje się rośliną, która będzie męskosterylne i która będzie się nadawać do handlowej produkcji nasion. Przykład IV. Niniejszy przykład jest wariantem przykładu 3, z tym że w miejsce wykonania fuzji protoplastów wykonuje się krzyżowanie płciowe między dwiema formami rodzicielskimi w warunkach szczególnych lub ze szczególnymi genotypami takiego rodzaju, który - w przeciwieństwie do procesów znanych z zapładniania u roślin - jest połączeniem (wynikiem skrzyżowania) cytoplazm oosfery i łagiewki pyłkowej lub gamety męskiej. Jeśli te sposoby byłyby opisane, można być w ten sam sposób wykonać wczesną selekcję młodych roślin

16 168 666 uzyskanych z tych sztucznych zapłodnień przy wykorzystaniu tych samych sond i tych samych kryteriów jak w przykładzie 3. Przykład V. Niniejszy przykład ilustruje korzyść wynikającą ze znajomości sekwencji "sterylności Ogury" przy manipulacji genetycznej typu już opisanego dla przypadku drożdży (Johnston et al., 1988). Przy użyciu normalnej rośliny Brassica bombarduje się merystemy bądź też komórki in vitro mikrocząstkami pokrytymi DNA, które jest nośnikiem sekwencji "sterylności Ogury". Rośliny otrzymane przez potomstwo merystem poddanych obróbce lub regenerowanych zarodków roślinnych będą cytoplazmicznie męskosterylne, jeśli DNA mógł przeniknąć do mitochondriów i zintegrować się z genomem tych organelli. Uniknie się zatem problemów wywołanych przez sekwencje niepożądane, co dotyczyłoby chloroplastów rzodkwi Ogury lub sekwencji określonych w ten sposób w genomie mitochondrialnym Ogury. Przykład VI. Niniejszy przykład ilustruje korzyść e znajomości sekwencji "sterylności Ogury" przy konstruowaniu metodami inżynierii genetycznej jądrowej sterylności męskiej w dziedziczeniu mendlowskim a nie cytoplazmicznym. Przy użyciu sekwencji DNA mitochondrialnego ograniczonego przez nukleotydy 928 i 1569 można skonstruować gen chimeryczny, który po transformacji genetycznej komórek Brassica lub innego rodzaju będzie transkrybowany do jądra komórek otrzymanych transformowanych roślin. Jeśli gen chimeryczny zawiera presekwencję, która umożliwia wprowadzenie do mitochondrium swojego produktu translacji w białko, transformanty te będą męskosterylne i cecha ta będzie funkcjonować jako dominująca cecha mendlowska. LITERATURA Amann, e, Ochs, Abel K-J (1988) Gene 69:301-315 Bannerot H, Boulidard L, Cauderon Y, Tempe J (1974) Proc Eucarpia Meeting Cruciferae 25:52-54 Bannerot H, Boulidard L, Chupeau Y (1977) Eucarpia Cruciferae Newsl: 2-16 Chetrit P, Mathieu C, Vedel F, Pelletier G, Primard C (1985) Theor Appl Genet 69:361-366 Dellaporta SL, Wood J, Hicks JB (1983) Plant Mol Biol Rep 1:19-21 Ducruet JM i Gazquez J (1978) Chemosphere 8:691-696 Frishaut AM, Lehrach H, Poustka A, Murray N (1983) J Mol Biol 170:827-842 Gough J i Murray N (1983) J Mol Biol 166:1-19 Hiesel R, Shobel W, Schuster W, Brennicke A (1987) EMBO J 6:29-34 Johnston SA, Anziano PQ, Shark K, Sanford JC, Butow RA (1988) Science 240:1538-1541 Logemann J, Schell J, Wilmitzer L (1987) Analytical Biochem 163:16-20 Ogura H (1968 Mem Fac Agric Kagoshima Univ 6:39-78 Pelletier G, Primard C, Vedel F, Chetrit P, Remy R, Rousselle P, Renard M (1983) Mol Gen Genet 191:244-250 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York Stem DB i Newton KJ (1986) Menthods Enzymol 118:488-496 Vedel F i Mathieu C (1982) Anal Biochem 127:1-8.

168 666 FIG.1

FIG.1 168 666

FIG.1 168 666

FIG.1 168 666

168 666 FIG 1

168 666 FIG.1

FIG.1 168 666

FIG.1 168 666

FIG.1 168 666

168 666 FIG. 2

168 666 FIG.3

168 666 FIG. 4

168 666

168 666 FIG.6 Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł