COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS

COBAS TaqMan HBV Test For Use With The High Pure System DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS 48 Tests P/N: 03500756 190 High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Tests P/N: 03502295 001 PRZEZNACZENIE Test COBAS TaqMan HBV, przeznaczony do u ytkowania ³¹cznie z zestawem High Pure System (HPS), jest testem in vitro opartym na amplifikacji kwasu nukleinowego w celu iloœciowej oceny stê enia DNA wirusa zapalenia w¹troby typu B (HBV) w ludzkiej surowicy lub osoczu, z wykorzystaniem zestawu High Pure System Viral Nucleic Acid Kit do rêcznego przygotowywania próbek oraz analizatora COBAS TaqMan 48 do automatycznej amplifikacji i detekcji. Test COBAS TaqMan HBV nie jest przeznaczony do przesiewowego badania krwi lub produktów krwiopochodnych na obecnoœæ HBV, ani w roli testu diagnostycznego potwierdzaj¹cego obecnoœæ zaka enia wirusem HBV. PODSUMOWANIE ORAZ OBJAŒNIENIE TESTU Wirus zapalenia w¹troby typu B (HBV) jest jednym z szeregu wirusów o znanej zdolnoœci wywo³ywania wirusowego zapalenia w¹troby. Przesz³o 2 miliardy ludzi na ca³ym œwiecie uleg³o zaka eniu wirusem HBV, zaœ spoœród nich ponad 350 milionów osób to przewlekle zaka eni nosiciele 1. Przewlekli nosiciele wykazuj¹ podwy szone ryzyko powik³añ odleg³ych zaka enia, w tym przewlek³ego zapalenia, marskoœci oraz pierwotnego raka w¹trobowokomórkowego 2,3,4. Markery serologiczne s¹ powszechnie stosowane w roli diagnostycznych i/lub prognostycznych wskaÿników ostrego lub przewlek³ego zaka enia wirusem HBV. Najczêœciej stosowanym markerem zaka enia HBV jest obecnoœæ jego antygenu powierzchniowego (HBsAg). Chocia u nosicieli mo e dochodziæ do eliminacji antygenu HBsAg oraz do wytwarzania przeciwcia³ skierowanych przeciwko niemu, to jednak HBsAg nadal okazuje siê byæ czynnikiem ryzyka rozwoju w póÿniejszym okresie ycia powa nych powik³añ dotycz¹cych w¹troby 5,6. Antygen e wirusa HBV (HBeAg) jest generalnie wykorzystywany jako wtórny marker, wskazuj¹cy na czynn¹ replikacjê wirusa HBV zwi¹zan¹ z postêpuj¹cym schorzeniem w¹troby. Okazuje siê, e niezdolnoœæ do eliminacji antygenu HBeAg zwiêksza ryzyko wyst¹pienia krañcowych stadiów rozwoju choroby w¹troby 7,8. Ró ne szczepy wirusa HBV mog¹ albo wytwarzaæ antygen HBeAg niemo liwy do wykrycia w surowicy, albo traciæ zdolnoœæ produkcji HBeAg nawet wówczas, gdy obecna jest czynna infekcja 9. Zatem wykorzystywanie tego markera do monitorowania postêpu choroby mo e mieæ ograniczon¹ u ytecznoœæ 10. Wed³ug doniesieñ mo liwoœæ wykrycia DNA wirusa HBV w surowicy posiada wartoœæ prognostyczn¹, umo liwiaj¹c¹ rokowanie co do wyników ostrych i przewlek³ych zaka eñ wirusem HBV 11,12,13,14. Metoda ta mo e umo liwiæ wykrywanie DNA wirusa HBV po eliminacji antygenu HBsAg 15 lub wykrywanie HBV ubogiego w markery serologiczne 16. Jednak e nie ustalono dot¹d zwi¹zku pomiêdzy markerami serologicznymi a poziomami DNA wirusa HBV. Skutecznoœæ leczenia antywirusowego, stosowanego u pacjentów zaka onych HBV, równie mo na oceniaæ na podstawie badania markerów serologicznych lub pomiarów aktywnoœci enzymów w¹trobowych. Jednak za najbardziej bezpoœredni i rzetelny sposób pomiaru replikacji wirusa uwa a siê iloœciow¹ ocenê stê enia DNA HBV w surowicy lub osoczu 13,17,18,19. Wykazano, e szybki i trwa³y spadek poziomów DNA wirusa HBV u pacjentów otrzymuj¹cych alfa-interferon, lamiwudynê lub gancyklowir jest czynnikiem predykcyjnym korzystnego wyniku leczenia 10,20,21,22,23,24. Monitorowanie poziomów DNA HBV pozwala przewidzieæ rozwój opornoœci na lamiwudynê 25. Zatem iloœciowy test s³u ¹cy do pomiaru stê enia DNA wirusa HBV jest cennym narzêdziem, które mo na wykorzystywaæ w po³¹czeniu z badaniami innych markerów serologicznych podczas leczenia zaka enia HBV. ZASADY PROCEDURY Test COBAS TaqMan HBV oparty jest na dwóch g³ównych procesach: (1) manualnej obróbce próbki w celu uzyskania DNA wirusa HBV; (2) zautomatyzowanej amplifikacji PCR docelowego DNA z u yciem swoistych dla HBV komplementarnych primerów oraz detekcji rozszczepionych, znakowanych podwójnym barwnikiem fluorescencyjnym detekcyjnych sond oligonukleotydowych, które umo liwiaj¹ iloœciow¹ ocenê amplifikowanego docelowego produktu HBV (amplikonu) oraz HBV Quantitation Standard DNA, preparatu, który obrabia siê, amplifikuje i poddaje detekcji równoczeœnie z próbk¹. Odczynnik Master Mix zawiera pary primerów i sondy swoiste zarówno dla DNA HBV, jak i standardowego DNA preparatu HBV Quantitation Standard DNA. Odczynnik Master Mix opracowano w celu zapewnienia równowa nego oznaczenia iloœciowego genotypów HBV od A do G. Detekcji amplifikowanego DNA dokonuje siê przy u yciu 1

swoistych dla sekwencji docelowych oraz swoistych dla preparatu Quantitation Standard, podwójnie znakowanych sond oligonukleotydowych, pozwalaj¹cych na niezale n¹ identyfikacjê amplikonu HBV i amplikonu HBV Quantitation Standard. Oznaczanie iloœciowe DNA wirusa HBV przeprowadza siê za pomoc¹ preparatu HBV Quantitation Standard. HBV Quantitation Standard to niezakaÿny, linearyzowany plazmid zawieraj¹cy miejsca wi¹zania primerów identyczne z posiadanymi przez docelowy DNA HBV, a tak e charakterystyczne miejsce wi¹zania sondy, które umo liwia odró nienie amplikonu HBV Quantitation Standard od docelowego amplikonu HBV. HBV Quantitation Standard wchodzi w sk³ad ka dej próbki i kontroli ze znan¹ liczb¹ kopii; wraz z docelowym materia³em HBV jest poddawany etapom: przygotowania próbki, amplifikacji PCR oraz detekcji. Analizator COBAS TaqMan 48 oblicza miano DNA HBV w badanej próbce na podstawie porównania sygna³u HBV z sygna³em HBV Quantitation Standard w ka dej próbce oraz kontroli. HBV Quantitation Standard rekompensuje wp³yw hamowania oraz kontroluje proces przygotowywania i amplifikacji, pozwalaj¹c uzyskaæ dok³adne oznaczenie iloœciowe DNA HBV w ka dej próbce. Przygotowanie próbki Test COBAS TaqMan HBV polega na obróbce próbek osocza i surowicy oraz izolacji DNA wirusa HBV w drodze podstawowego przygotowania wykonywanego rêcznie, opartego na wi¹zaniu kwasu nukleinowego przez w³ókna szklane. Cz¹stki wirusa HBV zostaj¹ poddane lizie poprzez ich inkubacjê w podwy szonej temperaturze z proteaz¹ oraz chaotropowym buforem lizuj¹cym/wi¹ ¹cym, który powoduje uwolnienie kwasów nukleinowych i ochronê uwolnionego DNA HBV przed znajduj¹cymi siê w osoczu i surowicy cz¹steczkami DNazy. Znana liczba cz¹steczek DNA preparatu HBV Quantitation Standard DNA jest wprowadzana do ka dej próbki wraz z odczynnikiem lizuj¹cym. W dalszej kolejnoœci do mieszaniny, w której dokonano lizy, dodaje siê izopropanol, po czym mieszaninê wiruje siê i przepuszcza przez kolumnê z wk³adem filtruj¹cym, zawieraj¹cym w³ókna szklane. W trakcie wirowania cz¹steczki DNA wirusa HBV i preparatu HBV Quantitation Standard ulegaj¹ zwi¹zaniu na powierzchni w³ókien szklanych filtra. Substancje niezwi¹zane, takie jak sole, bia³ka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostaj¹ usuniête w wyniku wirowania. Zaadsorbowany kwas nukleinowy jest wymywany i poddany elucji roztworem wodnym. Materia³y jednorazowego u ytku umo liwiaj¹ równoleg³¹ obróbkê 12 próbek lub wielokrotnoœci tej liczby. Poddawana obróbce próbka, zawieraj¹ca DNA wirusa HBV oraz preparatu HBV Quantitation Standard, jest nastêpnie dodawana do mieszaniny do amplifikacji/detekcji. Nastêpnie docelowy DNA wirusa HBV oraz preparatu HBV Quantitation Standard zostaj¹ poddane amplifikacji i detekcji przy pomocy aparatu COBAS TaqMan 48 oraz odczynników do amplifikacji i detekcji, dostarczanych wraz z zestawem testowym. Amplifikacja PCR Wybór sekwencji docelowej Wybór docelowej sekwencji DNA dla HBV zale y od identyfikacji regionów w obrêbie genomu HBV, które wykazuj¹ najwiêkszy konserwatyzm sekwencji poœród wszystkich genotypów. Zgodnie z tym, w³aœciwy wybór odcinków primerowych oraz sondy ma kluczowe znaczenie dla zdolnoœci testu do detekcji istotnych klinicznie genotypów HBV. Wykazano, e maksymalnym konserwatyzmem sekwencji DNA poœród genotypów odznacza siê kolisty, czêœciowo jednoniciowy obszar genomu HBV. Test COBAS TaqMan HBV wykorzystuje podczas amplifikacji PCR primery definiuj¹ce sekwencjê w obrêbie wysoce konserwatywnego, przedrdzeniowego/rdzeniowego obszaru genomu HBV. Amplifikacja sekwencji docelowej Poddane obróbce próbki dodaje siê do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (K-tubes), gdzie zachodzi amplifikacja PCR. Zainstalowany w aparacie COBAS TaqMan 48 termocykler podgrzewa mieszaninê w celu denaturacji dwuniciowego DNA i ods³oniêcia sekwencji docelowych swoistych dla primerów w obrêbie DNA kolistego fragmentu genomu HBV oraz preparatu HBV Quantitation Standard DNA. Podczas sch³adzania mieszaniny primery wtapiaj¹ siê w DNA docelowe. Termostabilna polimeraza DNA Thermus specie Z05 (Z05), w obecnoœci jonów Mn 2+ oraz nadmiaru trójfosforanów dezoksynukleotydów (dntp), w tym dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny i dezoksyurydyny (zamiast tymidyny), przed³u a przy³¹czone primery wzd³u docelowej matrycy, tworz¹c dwuniciow¹ cz¹steczkê DNA zwan¹ amplikonem. Analizator COBAS TaqMan 48 automatycznie powtarza powy szy proces przez okreœlon¹ liczbê cykli, w ka dym z nich zmierzaj¹c do podwojenia iloœci amplikonu DNA. Wymagana liczba cykli jest zaprogramowana w analizatorze COBAS TaqMan 48. Amplifikacja zachodzi wy³¹cznie w regionie genomu wirusa HBV znajduj¹cym siê pomiêdzy primerami; ca³y genom HBV nie ulega zwielokrotnieniu. Amplifikacja wybiórcza Amplifikacjê wybiórcz¹ badanego kwasu nukleinowego z próbki klinicznej przy u yciu testu COBAS TaqMan HBV uzyskuje siê dziêki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawieraj¹cych dezoksyurydynê 26, lecz nie DNA zawieraj¹cego dezoksytymidynê. W DNA wystêpuj¹cym w naturze nie stwierdza siê dezoksyurydyny, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie, ze wzglêdu na stosowanie trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego spoœród trójfosforanów dezoksynukleotydu w odczynniku Master Mix; dlatego te dezoksyurydynê zawiera wy³¹cznie amplikon. Dezoksyurydyna powoduje wra liwoœæ zanieczyszczaj¹cego amplikonu na rozk³ad przez enzym AmpErase przed amplifikacj¹ docelowego DNA. Tak e jakiekolwiek nieswoiste produkty reakcji, powsta³e po wstêpnej aktywacji odczynnika Master Mix przez jony manganu, pod dzia³aniem enzymu AmpErase ulegaj¹ zniszczeniu, co powoduje poprawê czu³oœci i swoistoœci testu. Enzym AmpErase, zawarty w odczynniku Master Mix, katalizuje rozk³ad DNA zawieraj¹cego dezoksyurydynê w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pierœcienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym ³añcuch amplikonu DNA pêka w miejscu, 2

w którym znajduje siê dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczaj¹c dalsz¹ amplifikacjê DNA. Enzym AmpErase jest nieczynny w temperaturach powy ej 55 C, tj. w czasie trwania ca³ego cyklu termicznego, dlatego te nie niszczy on amplikonu docelowego, powsta³ego podczas amplifikacji. Detekcja produktów reakcji PCR w teœcie COBAS TaqMan Test COBAS TaqMan HBV wykorzystuje technologiê reakcji PCR czasu rzeczywistego 27,28. Zastosowanie sond podwójnie znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym zapewnia ci¹g³¹ detekcjê gromadzenia siê produktu reakcji PCR na podstawie monitorowania intensywnoœci emisji fluorescencyjnych barwników reporterowych, uwalnianych w trakcie procesu amplifikacji. Sondy sk³adaj¹ siê z oligonukleotydów, swoistych dla HBV i HBV Quantitation Standard, znakowanych barwnikiem reporterowym i wygaszaczem. W teœcie COBAS TaqMan HBV sondy dla HBV i HBV Quantitation Standard s¹ oznakowane ró nymi fluorescencyjnymi barwnikami reporterowymi. Gdy podwójnie oznakowane barwnikami fluorescencyjnymi cz¹steczki sond s¹ nienaruszone, fluorescencja reportera jest przyt³umiona bliskoœci¹ wygaszacza, na zasadzie efektu przenoszenia energii typu Förstera. Podczas reakcji PCR sonda ulega hybrydyzacji z sekwencj¹ docelow¹, a nastêpnie rozszczepieniu pod wp³ywem posiadanej przez termostabiln¹ polimerazê DNA Z05 aktywnoœci 5' 3' nukleazy. Z chwil¹ uwolnienia i rozdzielenia reportera i wygaszacza nie zachodzi d³u ej zjawisko wygaszania i aktywnoœæ fluorescencyjna barwnika reporterowego nasila siê. Amplifikacjê DNA HBV oraz DNA HBV Quantitation Standard mierzy siê niezale nie od siebie, wykorzystuj¹c ró ne d³ugoœci fal. Proces ten powtarza siê zgodnie z wyznaczon¹ iloœci¹ cykli, zaœ w ka dym cyklu nastêpuje efektywne zwiêkszenie intensywnoœci emisji poszczególnych barwników reporterowych, umo liwiaj¹c niezale n¹ identyfikacjê DNA HBV oraz preparatu HBV Quantitation Standard DNA. Intensywnoœæ sygna³ów odnosi siê do iloœci materia³u wyjœciowego na pocz¹tku reakcji PCR. Podstawy oceny iloœciowej w teœcie COBAS TaqMan HBV Test COBAS TaqMan HBV zapewnia dok³adne wyniki iloœciowe w bardzo szerokim przedziale dynamiki, poniewa monitorowanie amplikonu przeprowadza siê w trakcie fazy wyk³adniczej amplifikacji. Im wy sze jest miano HBV w badanej próbce, tym wczeœniej fluorescencja barwnika reporterowego sondy HBV wzrasta powy ej wyjœciowego poziomu fluorescencji (patrz Rysunek 1). Poniewa iloœæ DNA preparatu HBV Quantitation Standard (QS) jest sta³a we wszystkich próbkach, fluorescencja barwnika reporterowego sondy HBV QS powinna pojawiaæ siê w ka dej próbce w tym samym cyklu (patrz Rysunek 2). W przypadku, gdy na amplifikacjê i detekcjê QS wp³ynie obecnoœæ inhibitorów lub niska wartoœæ próbki, pojawienie siê fluorescencji ulegnie opóÿnieniu, pozwalaj¹c tym samym na odpowiedni¹ modyfikacjê obliczonej wartoœci miana docelowego DNA wirusa HBV. Pojawienie siê swoistego sygna³u fluorescencyjnego jest rejestrowane jako krytyczna wartoœæ progowa (Ct). Wartoœæ Ct definiuje siê jako liczbê cykli cz¹stkowych, po której fluorescencja barwnika reporterowego przekracza ustalon¹ wczeœniej wartoœæ progow¹ (ustalony poziom fluorescencji) i zapocz¹tkowuje fazê wyk³adniczego wzrostu si³y sygna³u (patrz Rysunek 3). Wiêksza wartoœæ Ct wskazuje na wy sze miano pocz¹tkowe docelowego DNA wirusa HBV. 2-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem wartoœci Ct docelowego DNA HBV o 1, zaœ 10-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem Ct o 3,3. Rysunek 1 przedstawia krzywe wzrostu docelowego dla serii rozcieñczeñ próbek wirusa, obejmuj¹cej przedzia³ 5-krotnej wartoœci log 10. W miarê wzrostu stê enia wirusów krzywe wzrostu przesuwaj¹ siê w kierunku wczeœniejszych cykli. Zatem krzywa wzrostu le ¹ca najdalej na lewo odzwierciedla najwy szy poziom miana wirusa, zaœ krzywa wzrostu le ¹ca najdalej na prawo oznacza najni szy poziom miana wirusa. 9,00 8,00 7,00 Rysunek 1 Normalizowana fluorescencja 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Miano najwyższe Miano najniższe -1,00 0 10 20 30 40 50 60 Liczba cykli 3

Rysunek 2 przedstawia krzywe wzrostu preparatu Quantitation Standard dla próbek z seri¹ rozcieñczeñ wirusa, obejmuj¹c¹ przedzia³ 5-krotnej wartoœci log 10. Iloœæ preparatu Quantitation Standard dodanego do ka dej próbki jest sta³a dla ka dej reakcji. Wartoœæ Ct dla preparatu Quantitation Standard jest podobna niezale nie od miana wirusa. Rysunek 2 35,00 30,00 Miano najniższe Normalizowana fluorescencja 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 Miano najwyższe 0,00-5,00 0 10 20 30 40 50 60 Liczba cykli Rysunek 3 przedstawia na przyk³adzie, w jaki sposób wartoœci fluorescencji w ka dym cyklu s¹ normalizowane dla ka dej krzywej wzrostu. Liczbê cykli cz¹stkowych (Ct) oblicza siê w chwili, gdy sygna³ fluorescencyjny przekracza ustalony poziom fluorescencji. Rysunek 3 1 0,9 Normalizowana fluorescencja 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 Ustalony poziom fluorescencji Wartość Ct = 27,1 0,1 0-0,1 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Liczba cykli Ocena iloœciowa stê enia DNA HBV Test COBAS TaqMan HBV iloœciowo oznacza DNA wirusa HBV, wykorzystuj¹c drug¹ sekwencjê docelow¹ (HBV Quantitation Standard), któr¹ w znanym stê eniu dodaje siê do ka dej próbki testowej. Preparat HBV Quantitation Standard jest niezakaÿnym, linearyzowanym, plazmidowym konstruktem DNA, zawieraj¹cym fragmenty sekwencji HBV z obszarami wi¹zania primerów, które s¹ identyczne z obszarami wi¹zania na docelowej sekwencji HBV. Preparat HBV Quantitation Standard wytwarza równie produkt amplifikacji o tej samej d³ugoœci ³añcucha i sk³adzie zasad, co docelowy DNA wirusa HBV. Le ¹cy w obrêbie sondy detekcyjnej obszar wi¹zania HBV Quantitation Standard zosta³ zmodyfikowany w celu ró nicowania amplikonu HBV Quantitation Standard i amplikonu docelowego HBV. Podczas fazy wtapiania reakcji PCR w analizatorze COBAS TaqMan 48, próbki zostaj¹ oœwietlone przefiltrowanym œwiat³em i wzbudzone, po czym rejestruje siê wyniki emisji przefiltrowanej fluorescencji ka dej próbki. Odczyty wyniku ka dej próbki poddaje siê korekcji w celu wyeliminowania zmiennoœci wywo³anej dzia³aniem instrumentów. Aparat wprowadza odczyty fluorescencji do programu AMPLILINK i zapisuje w bazie danych. Stosuje siê metodê odczytów wstêpnych dla okreœlenia, czy DNA HBV oraz DNA HBV Quantitation Standard reprezentuj¹ zestawy, które mo na uznaæ 4

za wa ne; w sytuacji, gdy dane nie mieszcz¹ siê w ustalonych granicach, aparat opatruje je odpowiednimi oznaczeniami. Po ukoñczeniu i pomyœlnej ocenie odczytów wstêpnych odczyty fluorescencji s¹ nastêpnie przetwarzane w celu obliczenia wartoœci Ct dla DNA HBV i dla DNA preparatu HBV Quantitation Standard. Tablica sta³ych, swoistych dla danej serii wartoœci kalibracji, do³¹czona do testu COBAS TaqMan HBV, jest wykorzystywana do obliczania wartoœci miana próbek i kontroli na podstawie wartoœci Ct DNA HBV oraz DNA preparatu HBV Quantitation Standard. Test COBAS TaqMan HBV jest wystandaryzowany wed³ug standardu WHO HBV International Standard for NAT Testing 97/746 29, zaœ wyniki mian przedstawiane s¹ w jednostkach miêdzynarodowych (IU/ml). ODCZYNNIKI High Pure System Viral Nucleic Acid Kit Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 testów (P/N: 03502295 001) LYS 2 x 25 ml (Bufor do lizy/wi¹ ¹cy) Tris 52% chlorowodorek guanidyny < 1% mocznik 20% Triton X-100 Xn 52% (udzia³ wagowy) chlorowodorek guanidyny + Produkt szkodliwy CAR (RNA, liofilizowany) PK (Proteinaza K, liofilizowana) + 99% proteinaza K, liofilizowana Xn 99% proteinaza K, liofilizowana 2 x 2 mg 2 x 100 mg Produkt szkodliwy IRB (Bufor usuwaj¹cy inhibitor) Tris 65% chlorowodorek guanidyny (dodaæ 20 ml etanolu) Xn 65% (udzia³ wagowy) chlorowodorek guanidyny + 1 x 33 ml Produkt szkodliwy WASH (Bufor do wymywania) Tris NaCl (dodaæ 80 ml etanolu) ELB (Bufor do elucji) RS (zestaw statywów High Pure System Viral Nucleic Acid Rack Set) Statyw do przeprowadzania lizy Statyw z rurkami filtracyjnymi z mocowanym statywem na odpady Statyw do elucji Statyw z pokrywkami Chwytaki WR (Statyw na odpady High Pure System Viral Nucleic Acid Waste Rack) 1 x 20 ml 1 x 30 ml 4 x ka dy 8 x ka dy 5

COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS 48 testów (P/N: 03500756 190) Odczynniki do przygotowywania próbki i odczynniki kontrolne HBV QS 2 x 1,0 ml (COBAS TaqMan Standard oznaczania HBV) Bufor Tris-HCl EDTA < 0,001% linearyzowany, dwuniciowy, plazmidowy DNA, zawieraj¹cy wstawkê. Wstawka DNA zawiera sekwencje HBV wi¹ ¹ce primery oraz swoisty obszar wi¹ ¹cy sondê. Barwnik amarantowy < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) 0,05% azydek sodu HBV H(+)C 2 x 1,0 ml [Kontrola HBV silnie (+)] < 0,001% linearyzowany, dwuniciowy, plazmidowy DNA, zawieraj¹cy sekwencje HBV. Osocze ludzkie daj¹ce wynik ujemny, niereaktywne w testach licencjonowanych przez US FDA w zakresie przeciwcia³ przeciwko HCV, przeciwcia³ przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA oraz HBV DNA niewykrywalnych przy u yciu metod PCR 0,1% ProClin 300 HBV L(+)C 2 x 1,0 ml [Kontrola HBV s³abo (+)] < 0,001% linearyzowany, dwuniciowy, plazmidowy DNA, zawieraj¹cy sekwencje HBV. Osocze ludzkie daj¹ce wynik ujemny, niereaktywne w testach licencjonowanych przez US FDA w zakresie przeciwcia³ przeciwko HCV, przeciwcia³ przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA oraz HBV DNA niewykrywalnych przy u yciu metod PCR 0,1% ProClin 300 CTM ( ) C 4 x 1,0 ml [COBAS TaqMan kontrola ujemna (osocze ludzkie)] Osocze ludzkie daj¹ce wynik ujemny, niereaktywne w testach licencjonowanych przez US FDA w zakresie przeciwcia³ przeciwko HCV, przeciwcia³ przeciwko HIV-1/2, antygenu HIV p24 oraz antygenu HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA oraz HBV DNA niewykrywalnych przy u yciu metod PCR 0,1% ProClin 300 Odczynniki do amplifikacji i detekcji HBV MMX 2 x 24 testy (Odczynnik COBAS TaqMan HBV Master Mix) 2 x 1,4 ml Bufor Tricine Wodorotlenek potasu Octan potasu Glicerol < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% preparat primerów sensownych i antysensownych przedrdzeniowych/rdzeniowych obszarów HBV < 0,001% preparat znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi sond oligonukleotydowych, swoistych dla HBV oraz HBV Quantitation Standard < 0,001% aptamer oligonukleotydowy < 0,05% polimeraza DNA Z05 (bakteryjna) < 0,1% enzym AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) (bakteryjny) 0,09% azydek sodu CTM Mn 2+ 2 x 24 testy (COBAS TaqMan roztwór manganu) 2 x 1,0 ml < 1,2% octan manganu Kwas octowy lodowaty 0,09% azydek sodu OSTRZE ENIA I ŒRODKI OSTRO NOŒCI A. DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. B. Test ten przeznaczony jest do stosowania z osoczem ludzkim pobranym na antykoagulant EDTA oraz z ludzk¹ surowic¹. 6

C. Nie pipetowaæ za pomoc¹ ust. D. Nie jeœæ, nie piæ oraz nie paliæ w laboratorium, w obszarach roboczych. Przy obchodzeniu siê z próbkami i odczynnikami z zestawów stosowaæ jednorazowe rêkawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiedni¹ ochronê oczu. Dok³adnie umyæ rêce po obchodzeniu siê z próbkami i odczynnikami testowymi. E. Przy pobieraniu poszczególnych dawek odczynników z butelek, unikaæ ska enia bakteryjnego odczynników lub ich zanieczyszczenia rybonukleaz¹. F. Zaleca siê u ywanie ja³owych jednorazowych pipet oraz koñcówek pipet wolnych od DNazy. G. Nie mieszaæ odczynników pochodz¹cych z ró nych serii lub ró nych butelek tej samej serii. H. Nie mieszaæ ze sob¹ odczynników pochodz¹cych z ró nych zestawów. I. Wyrzuciæ wszystkie niezu yte odczynniki, odpady i próbki, postêpuj¹c zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. J. Nie u ywaæ zestawu po up³ywie daty przydatnoœci. K. Karty charakterystyki bezpieczeñstwa materia³u (MSDS, Material Safety Data Sheets) dostêpne s¹ na ¹danie w lokalnym przedstawicielstwie firmy Roche. L. Z próbkami nale y obchodziæ siê tak, jak z materia³em zakaÿnym, stosuj¹c laboratoryjne procedury bezpieczeñstwa, takie jak okreœlone w Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 oraz w dokumencie CLSI M29-A 31. Dok³adnie oczyœciæ i odkaziæ wszystkie powierzchnie robocze œwie o przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. UWAGA: Dostêpny w handlu p³ynny domowy wybielacz zawiera zazwyczaj podchloryn sodu w stê eniu 5,25%. Rozcieñczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 przyniesie 0,5% roztwór podchlorynu sodu. M. PRZESTROGA: Odczynniki: CTM ( ) C, HBV L(+)C oraz HBV H(+)C zawieraj¹ ludzkie osocze otrzymane z krwi ludzkiej. Materia³ Ÿród³owy badano przy u yciu testów zatwierdzonych przez US FDA i stwierdzono, e jest on niereaktywny pod wzglêdem obecnoœci antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia w¹troby typu B (HBsAg), przeciwcia³ przeciwko HIV-1/2 oraz HCV, a tak e antygenu HIV p24 Badanie ujemnego osocza ludzkiego (Negative Human Plasma) przy zastosowaniu metod PCR nie wykaza³o wykrywalnej obecnoœci RNA wirusa HIV-1, RnA wirusa HCV lub DNA wirusa HBV. Nie ma znanych metod testowych mog¹cych zapewniæ ca³kowit¹ pewnoœæ, e produkty pochodz¹ce krwi ludzkiej nie przenosz¹ czynników zakaÿnych. Dlatego te ka dy materia³ pochodzenia ludzkiego nale y traktowaæ jako potencjalnie zakaÿny. Z odczynnikami: CTM ( ) C, HBV L(+)C oraz HBV H(+)C nale y obchodziæ siê tak jak z materia³em zakaÿnym, stosuj¹c laboratoryjne procedury bezpieczeñstwa, takie jak wymienione w wytycznych Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 30 oraz w dokumencie CLSI M29-A 31. Dok³adnie oczyœciæ i odkaziæ wszystkie powierzchnie robocze œwie o przygotowanym roztworem 0,5% podchlorynu sodu w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. N. Odczynniki: HBV MMX, HBV QS oraz CTM Mn 2+ zawieraj¹ azydek sodu. Azydek sodu mo e wchodziæ w reakcje z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z o³owiu lub miedzi tworz¹c silnie wybuchowe azydki metali. Usuwaj¹c roztwory zawieraj¹ce azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, nale y sp³ukaæ je du ¹ iloœci¹ wody aby zapobiec nagromadzeniu azydków. O. Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem nale y u ywaæ os³on na oczy, fartuchów laboratoryjnych oraz jednorazowych rêkawic. Unikaæ kontaktu wymienionych materia³ów ze skór¹, oczami i b³onami œluzowymi. Je eli dojdzie do kontaktu, natychmiast sp³ukaæ du ¹ objêtoœci¹ wody. Je eli nie zostan¹ podjête odpowiednie œrodki mo e dojœæ do oparzeñ. W razie rozlania powy szych odczynników, przed wytarciem plam nale y rozcieñczyæ je wod¹. WYMAGANIA DOTYCZ CE PRZECHOWYWANIA I OBCHODZENIA SIÊ Odczynniki do przygotowywania próbki A. Po dostarczeniu przechowywaæ odczynniki z zestawu High Pure System Viral Nucleic Acid Reagents w temperaturze 15-25 C. B. Przechowywaæ bufor do elucji (ELB) oraz bufor do lizy/wi¹ ¹cy (LYS) w temperaturze 15-25 C. Po otwarciu przechowywaæ odczynniki ELB oraz LYS w temperaturze 15-25 C. Po otwarciu odczynniki ELB oraz LYS nale y zu yæ w ci¹gu 30 dni lub przed up³ywem daty przydatnoœci, zale nie od tego, która z dat jest wczeœniejsza. C. Po dodaniu buforu do elucji (ELB) w celu rozpuszczenia noœnika RNA oraz proteinazy K, przechowywaæ niezu yty noœnik RNA (CAR) oraz niezu yt¹ proteinazê K (PK) w temperaturze od -15 do -25 C. Po rozpuszczeniu noœnik RNA oraz proteinazê K nale y zu yæ w ci¹gu 30 dni lub przed up³ywem daty przydatnoœci, zale nie od tego, która z dat jest wczeœniejsza. D. Po dodaniu etanolu przechowywaæ bufor usuwaj¹cy inhibitor (IRB) oraz bufor do wymywania (WASH) w temperaturze 15-25 C. Wymienione odczynniki robocze zachowuj¹ stabilnoœæ przez 30 dni (lub do daty przydatnoœci, w zale noœci od tego, która z dat jest wczeœniejsza). 7

E. Roboczy roztwór do lizy/wi¹ ¹cy [bufor do lizy/wi¹ ¹cy w po³¹czeniu z noœnikiem RNA, proteinaz¹ K oraz HBV QS] nale y zu yæ natychmiast po jego przygotowaniu. Wszelkie jego pozosta³oœci nale y wyrzuciæ. Odczynniki do amplifikacji i detekcji A. Nie zamra aæ odczynników ani kontroli. B. Przechowywaæ odczynniki: HBV MMX, CTM ( ) C, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS oraz CTM Mn 2+ w temperaturze 2-8 C. Przed otwarciem odczynniki te zachowuj¹ stabilnoœæ do wskazanej daty przydatnoœci. Po otwarciu opakowania w celu pobrania porcji odczynnika wystarczaj¹cej na 12 próbek, przechowywaæ pozosta³¹ iloœæ odczynników: HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS oraz CTM Mn 2+ w temperaturze 2-8 C. Po otwarciu odczynniki: HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS oraz CTM Mn 2+ zachowuj¹ stabilnoœæ w temperaturze 2-8 C przez 30 dni lub do up³ywu daty przydatnoœci, zale nie od tego, która z dat jest wczeœniejsza. Po otwarciu opakowania wszelkie niezu yte partie odczynnika CTM ( ) C nale y wyrzuciæ. C. Roboczy odczynnik Master Mix (przygotowany poprzez dodanie odczynnika CTM Mn 2+ do HBV MMX) nale y przechowywaæ w temperaturze 2-8 C w zaciemnionym miejscu. Przygotowane próbki i kontrole nale y dodaæ do roboczego odczynnika Master Mix w ci¹gu 2 godzin od jego przygotowania. D. Poddane obróbce próbki i kontrole zachowuj¹ stabilnoœæ do 3 godzin w temperaturze 20-30 C, do 24 godzin w temperaturze 2-8 C lub do 1 tygodnia w stanie zamro enia do temperatury -20 C. E. Amplifikacjê nale y rozpocz¹æ w ci¹gu 3 godzin od chwili dodania przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do roboczego odczynnika Master Mix. MATERIA Y DOSTARCZONE Odczynniki do przygotowania próbki A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid Kit (P/N: 03502295 001) LYS (Bufor do lizy/wi¹ ¹cy) CAR (Noœnik RNA) PK (Proteinaza K) IRB (Bufor usuwaj¹cy inhibitor) WASH (Bufor do wymywania) ELB (Bufor do elucji) RS (Zestaw High Pure System Viral Nucleic Acid Rack Set) WR (Statyw na odpady High Pure System Viral Nucleic Acid Waste Rack) Odczynniki do amplifikacji i detekcji B. COBAS TaqMan HBV Test HBV HPS (P/N: 03500756 190) HBV QS (COBAS TaqMan Standard oznaczania HBV) HBV H(+)C [Kontrola HBV silnie (+)] HBV L(+)C [Kontrola HBV s³abo (+)] CTM ( ) C [COBAS TaqMan ujemna próba kontrolna (osocze ludzkie)] HBV MMX (Odczynnik COBAS TaqMan HBV Master Mix) CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan roztwór manganu) 8

MATERIA Y WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Przyrz¹dy i oprogramowanie Analizator COBAS TaqMan 48 Program AMPLILINK, v3.1 lub nowsza Stacja robocza dla programu AMPLILINK Instrukcja obs³ugi analizatora COBAS TaqMan 48 Urz¹dzenie do mocowania korka w probówkach K-tube (P/N: 03516539001) P³yta CD ROM z plikiem do Testu COBAS TaqMan HBV PCR (P/N: 04673182190) Materia³y jednorazowe Pud³o zawieraj¹ce probówki K-tube 12 x 96 (P/N: 03137082001) Wymagania dotycz¹ce wirówki Wirówka Sigma 4-15 C Benchtop lub odpowiadaj¹cy jej typ wirówki z p³ytk¹ mikrotitracyjn¹, umo liwiaj¹cy wirowanie z przyspieszeniem 4600 x g Wirnik horyzontalny do wirówki Sigma P/N: 11118 (zawiera 2 koszyki P/N: 13218 oraz 2 uchwyty do p³ytek P/N: 17978) b¹dÿ ich odpowiedniki INNE MATERIA Y WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZONE Izopropanol (> 99%) odpowiadaj¹cy specyfikacjom ACS lub lepszy Etanol (96-100%) - odpowiadaj¹cy specyfikacjom ACS lub lepszy Regulowane pipetory*: (pojemnoœæ 250 µl i 1000 µl) z barier¹ aerozolow¹ lub koñcówkami dodatniego wypierania wolnymi od DNazy Rêkojeœæ pomocnicza do pipety: Drummond (P/N: 4-000-100) b¹dÿ odpowiednik aÿnia wodna o temperaturze 50 C (± 2 C) Suchy blok grzejny o temperaturze 70 C (± 2 C) Ja³owe, jednorazowe pipety serologiczne: 5, 10 i 25 ml Ja³owe probówki sto kowe z polipropylenu; 15 ml i 50 ml: Corning (P/N: 430052 i P/N: 430290) b¹dÿ ich odpowiedniki Ja³owe probówki o pojemnoœci 2,0 ml do mikrowirówki: Sarstedt (P/N: 72.693.005) b¹dÿ ich odpowiedniki Mieszad³o wibracyjne Statywy do probówek Rêkawice jednorazowe bezpudrowe Kalibrowane termometry do ³aŸni wodnej i suchego bloku grzejnego * Dok³adnoœæ pipetorów musi wahaæ siê w zakresie 3% podanej objêtoœci. We wskazanych przypadkach u ywaæ nale y pozbawionych DNazy koñcówek do pipet z barier¹ dla aerozoli lub wyrzutnikiem w celu zapobie enia ska eniu krzy owemu miêdzy próbk¹ i amplikonem. POBIERANIE PRÓBEK, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE UWAGA: Ze wszystkimi próbkami i kontrolami nale y obchodziæ siê jak z materia³em zdolnym do przenoszenia czynników zakaÿnych. A. Pobieranie próbek Test COBAS TaqMan HBV jest przeznaczony wy³¹cznie do stosowania z próbkami surowicy lub osocza. Krew powinno siê pobieraæ do probówek BD SST Serum Separator Tubes lub do probówek zawieraj¹cych EDTA (korek lawendowy) jako œrodek przeciwkrzepliwy. Krew pe³n¹ przechowywaæ w temperaturze 2-25 C nie d³u ej ni przez 1 dzieñ. U ycie osocza pobranego na EDTA lub surowicy przyniesie wyniki testu, które w przybli eniu bêd¹ równowa ne. Rysunek 4 przedstawia wp³yw rodzaju macierzy na wyniki badania DNA HBV w próbkach pochodz¹cych od pacjenta. 9

Rysunek 4 Porównanie rodzajów próbek: osocze z dodatkiem EDTA i surowica 12,00 10,00 Próbki osocza Średni wynik (Log 10 IU/ml DNA HBV, n=2) 8,00 6,00 4,00 y = 1,0139x - 0,0703 R 2 = 0,9984 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Próbki surowicy Średni wynik (Log 10 IU/ml DNA HBV, n = 2) Oddzieliæ surowicê lub osocze od pe³nej krwi w ci¹gu 1 dnia od pobrania przez odwirowanie (800-1600 x g przez 20 minut) w temperaturze pokojowej. Przenieœæ surowicê lub osocze do ja³owej probówki polipropylenowej. Rysunek 5 przedstawia dane z badañ dotycz¹cych pobierania próbek. Rysunek 5 Stabilnoœæ HBV w krwi pe³nej z dodatkiem EDTA jako antykoagulantu lub w surowicy w probówkach Serum Separator Tubes przed separacj¹ na osocze lub surowicê 4,5 Średni wynik DNA HBV Log IU/ml DNA HBV n=2) 10 4,0 3,5 3,0 2,5 < 1 godzina 25-30 C 6 godzin 25-30 C 24 godzin 25-30 C 48 godzin 25-30 C 72 godzin 25-30 C < 1 godzina 2-8 C 6 godzin 2-8 C 24 godzin 2-8 C 48 godzin 2-8 C 72 godzin 2-8 C 2,0 Osocze-1 Osocze-2 Osocze-3 Osocze-4 Osocze-5 Surowica-1Surowica-2 Numer identyfikacyjny (ID) próbki B. Transport próbek Transport krwi pe³nej, surowicy lub osocza musi zachodziæ zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, pañstwowymi i lokalnymi dotycz¹cymi transportu czynników etiologicznych 32. Krew pe³n¹ nale y transportowaæ w temperaturze 2-25 C i obrabiaæ w przeci¹gu 1 dnia od pobrania. Osocze lub surowica mog¹ byæ transportowane w temp. 2-8 C lub zamro one do temperatury od -20 C do -80 C. C. Przechowywanie próbek Próbki surowicy lub osocza mo na przechowywaæ w temperaturze pokojowej do 3 dni, w temperaturze 2-8 C do 7 dni lub zamro one do temperatury od -20 C do -80 C co najmniej przez 6 tygodni. Zaleca siê przechowywanie próbek w objêtoœciach 800-900 µl w ja³owych polipropylenowych probówkach zakrêcanych o pojemnoœci 2,0 ml (takich jak Sarstedt P/N: 72.694.006). Rysunek 6 przedstawia dane z badañ dotycz¹cych przechowywania próbek. 10

Rysunek 6 Stabilnoœæ HBV w osoczu z dodatkiem EDTA lub surowicy Średni wynik DNA HBV Log IU/ml DNA HBV n=2) 10 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Osocze-1 Osocze-2 Osocze-3 Osocze-4 Osocze-5 Surowica-1 Surowica-2 Czas 0 1 dzień RT 3 dni RT 5 dni RT 7 dni RT 1 dzień 2-8 C 3 dni 2-8 C 5 dni 2-8 C 7 dni 2-8 C 6 tygodni -80 C Numer identyfikacyjny (ID) próbki Próbki surowicy i osocza mo na zamra aæ i rozmra aæ do 5 razy bez utraty DNA HBV. Rysunek 7 przedstawia dane z badañ dotycz¹cych zamra ania i rozmra ania. Rysunek 7 Wyniki badania HBV po poddaniu próbki maksymalnie 5 cyklom zamra ania-rozmra ania Średni wynik (Log IU/ml DNA HBV, n=2) 10 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 Osocze-1 Osocze-2 Osocze-3 Osocze-4 Surowica-1 Surowica-2 Próba kontrolna 1 F-T 2 F-T 3 F-T 4 F-T 5 F-T Numer identyfikacyjny (ID) próbki INSTRUKCJA U YTKOWANIA UWAGA: Szczegó³owe informacje na temat obs³ugi aparatu COBAS TaqMan 48 znajduj¹ siê w instrukcji obs³ugi urz¹dzenia. UWAGA: Wszystkie odczynniki do amplifikacji i detekcji przed u yciem musz¹ byæ ogrzane do temperatury otoczenia; nale y wyj¹æ je z miejsca przechowywania o temperaturze 2-8 C co najmniej na 30 minut przed u yciem. UWAGA: Próbki surowicy i osocza nale y przed u yciem ogrzewaæ do temperatury otoczenia przez 15-30 minut. UWAGA: Tam, gdzie jest to wskazane, u ywaæ pipetorów z koñcówkami z barier¹ aerozolow¹ lub wyrzutnikiem. Zachowaæ najdalej posuniêt¹ ostro noœæ aby unikn¹æ zanieczyszczenia. Wielkoœæ przebiegu: Ka dy zestaw zawiera odczynniki wystarczaj¹ce dla czterech przebiegów po 12 oznaczeñ ka dy, które wykonywaæ mo na oddzielnie lub równoczeœnie. W ka dy z przebiegów testowych, licz¹cych do 24 próbek i kontroli, nale y w³¹czyæ 1 powtórzenie kontroli: CTM ( ) C, HBV L(+)C oraz HBV H(+)C (patrz rozdzia³ Kontrola jakoœci). Odczynniki do amplifikacji i detekcji pakowane s¹ do butelek dwukrotnego u ytku, wystarczaj¹cych do wykonania 24 testów. Aby najwydajniej wykorzystaæ odczynniki, próbki badane i kontrolne nale y poddawaæ obróbce w seriach bêd¹cych wielokrotnoœci¹ 12. 11

Przygotowanie próbki i kontroli UWAGA: Jeœli u ywa siê zamro onych próbek surowicy lub osocza, nale y umieœciæ próbki w temperaturze pokojowej a do ich ca³kowitego rozmro enia, a nastêpnie przed u yciem wytrz¹saæ na mieszadle wibracyjnym przez 5-10 sekund. UWAGA: Przed przyst¹pieniem do wykonywania testu pozwoliæ odczynnikom na ogrzanie siê do temperatury otoczenia. Przed rozpoczêciem reakcji oczyszczania materia³u ogrzaæ suchy blok grzejny do temperatury 70 C (± 2 C) oraz ³aŸniê wodn¹ do temperatury 50 C (± 2 C). A. Przygotowanie odczynników UWAGA: Przygotowaæ roboczy roztwór do lizy/wi¹ ¹cy jedynie wówczas, gdy wszystkie próbki i kontrole ogrza³y siê ju do temperatury otoczenia w ci¹gu 15-30 minut. 1. Przygotowaæ bufor usuwaj¹cy inhibitor, przenosz¹c pipet¹ 20 ml 96-100% etanolu do odczynnika Inhibitor Removal Buffer (bufor usuwaj¹cy inhibitor) (IRB). Dok³adnie wymieszaæ zawartoœæ odwracaj¹c 5-10 razy. Przygotowany w ten sposób bufor usuwaj¹cy inhibitor stanowi zapas wystarczaj¹cy na 48 testów. 2. Przygotowaæ bufor do wymywania, przenosz¹c pipet¹ 80 ml 96-100% etanolu do odczynnika bufor do wymywania (WASH). Dok³adnie wymieszaæ zawartoœæ odwracaj¹c 5-10 razy. Przygotowany w ten sposób bufor do wymywania stanowi zapas wystarczaj¹cy na 48 testów. 3. Ogrzaæ bufor do elucji (ELB) do temperatury 70 C (± 2 C) w 2,0 ml zakrêcanej probówce do wirówki. Mo na w tym celu u ywaæ wielu probówek. Objêtoœæ elucji na jedn¹ próbkê wynosi 75 µl. Nale y ogrzaæ objêtoœæ odczynnika zamieszczon¹ w poni szej tabeli, zgodnie z liczb¹ testów. Liczba powtórzeñ testów Odczynnik 12 24 Bufor do elucji (ml) 2,0 4,0 4. Przenieœæ za pomoc¹ pipety do czystej, ja³owej probówki objêtoœæ izopropanolu okreœlon¹ w poni szej tabeli w zale noœci od iloœci testów. Liczba powtórzeñ testów Odczynnik 12 24 Izopropanol (ml) 5,0 10,0 5. Przenieœæ za pomoc¹ pipety 0,5 ml buforu do elucji (ELB) do noœnika RNA (CAR). W³o yæ z powrotem korek, odwróciæ fiolkê i wytrz¹saæ j¹ do chwili pe³nego rozpuszczenia siê noœnika RNA. Rozpuszczony noœnik RNA wystarczy do wykonania 24 testów. Niezu yte partie rozpuszczonego noœnika RNA mo na przechowywaæ w temperaturze od -15 do -25 C do 30 dni lub do zakoñczenia okresu przydatnoœci, zale nie od tego, która z dat jest wczeœniejsza. 6. Przenieœæ za pomoc¹ pipety 5,0 ml buforu do elucji (ELB) do proteinazy K (PK). W³o yæ z powrotem korek, odwróciæ fiolkê i wytrz¹saæ j¹ do chwili pe³nego rozpuszczenia siê proteinazy K. Rozpuszczona proteinaza K wystarczy do wykonania 24 testów. Niezu yte partie rozpuszczonej proteinazy K mo na przechowywaæ w temperaturze od -15 do -25 C do 30 dni lub do zakoñczenia okresu przydatnoœci, zale nie od tego, która z dat jest wczeœniejsza. 7. Przygotowaæ roboczy roztwór do lizy/wi¹ ¹cy w nastêpuj¹cy sposób przenieœæ za pomoc¹ pipety objêtoœci odczynników przedstawionych w poni szej tabeli, zgodne z liczb¹ próbek i kontroli przeznaczonych do obróbki: Liczba powtórzeñ testów Odczynniki 12 24 Bufor do lizy/wi¹ ¹cy (ml) 7,0 14,0 Noœnik RNA (µl) 140 280 HBV QS (µl) 39 78 Proteinaza K (ml) 1,4 2,8 UWAGA: Objêtoœæ preparatu HBV QS jest swoista dla testu COBAS TaqMan HBV. UWAGA: Jeœli zamierza siê u yæ zamro onego uprzednio, rozpuszczonego noœnika RNA lub proteinazy K, nale y je rozmra aæ w temperaturze pokojowej, zaœ przed u yciem kilkakrotnie wymieszaæ przez odwracanie fiolki. Dodaæ wskazan¹ objêtoœæ buforu do lizy/wi¹ ¹cego do czystej, ja³owej probówki o pojemnoœci 50 ml. Dodaæ do probówki zawieraj¹cej bufor do lizy/wi¹ ¹cy wskazan¹ objêtoœæ rozpuszczonego noœnika RNA. Wytrz¹saæ naczynie z preparatem HBV QS przez 3-5 sekund, po czym dodaæ wskazan¹ objêtoœæ HBV QS do probówki zawieraj¹cej bufor do lizy/wi¹ ¹cy oraz rozpuszczony noœnik RNA. 12

Zamkn¹æ probówkê i wymieszaæ zawartoœæ, odwracaj¹c 10-15 razy. NIE wytrz¹saæ na mieszadle - wytrz¹sanie spowoduje tworzenie siê pêcherzyków w roztworze. Dodaæ wskazan¹ objêtoœæ rozpuszczonej proteinazy K do probówki zawieraj¹cej bufor do lizy/wi¹ ¹cy. Zamkn¹æ probówkê i wymieszaæ zawartoœæ, odwracaj¹c 10-15 razy. NIE wytrz¹saæ na mieszadle - wytrz¹sanie spowoduje tworzenie siê pêcherzyków w roztworze. Rozpocz¹æ rozdzielanie roboczego roztworu do lizy/wi¹ ¹cego natychmiast po dodaniu proteinazy K do buforu do lizy/wi¹ ¹cego i wymieszaniu zawartoœci. Niezu yte partie buforu do lizy/wi¹ ¹cego (LYS) mo na przechowywaæ w temperaturze 15-25 C do 30 dni lub do zakoñczenia okresu przydatnoœci, zale nie od tego, która z dat jest wczeœniejsza. Niezu yte partie roboczego roztworu do lizy/wi¹ ¹cego nale y wyrzuciæ. B. Przygotowanie próbki i kontroli UWAGA: Do wykonania tej procedury zaleca siê stosowanie regulowanych pipetorów z koñcówkami z barier¹ aerozolow¹. UWAGA: Do wykonania czynnoœci z Etapów: 14, 16, 19 i 22 mo na u ywaæ pipety repetycyjnej z ja³owymi koñcówkami typu combi-tip odpowiedniego rozmiaru. Jednak e nale y zachowywaæ dodatkow¹ ostro noœæ, aby unikn¹æ rozpryskiwania siê odczynników i zanieczyszczenia krzy owego próbek. 1. Dodaæ pipet¹ 625 µl roboczego roztworu do lizy/wi¹ ¹cego do ka dego z do³ków statywu do przeprowadzania lizy Lysis Rack (I, przezroczysty). Zepchn¹æ pokrywki w dó³, nadaj¹c im pozycjê tak¹, by os³ania³y do³ki. 2. Otwieraj¹c pojedynczo ka dy do³ek, dodawaæ pipet¹ do odpowiednich do³ków po 500 µl próbki b¹dÿ kontroli. Po dodaniu ka dej próbki b¹dÿ kontroli zepchn¹æ pokrywkê w dó³ a do zamkniêcia siê zatrzasku, szczelnie zamykaj¹cego do³ek. 3. Po dodaniu wszystkich próbek i kontroli wymieszaæ zawartoœæ nape³nionego statywu Lysis Rack, wytrz¹saj¹c go przez oko³o 10 sekund. Potwierdziæ wzrokowo, e wszystkie do³ki ulegaj¹ wytrz¹saniu i ich zawartoœæ jest dok³adnie wymieszana. 4. Inkubowaæ statyw Lysis Rack w ³aŸni wodnej ogrzanej do temperatury 50 C (± 2 C) przez 10 minut. Zanurzyæ statyw Lysis Rack w ³aŸni wodnej nape³nionej wod¹ na g³êbokoœæ oko³o 5-7 cm. Po wyjêciu z ³aŸni wodnej osuszyæ statyw Lysis Rack. 5. Odwirowaæ statyw Lysis Rack przez 10-20 sekund z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z p³ytk¹ mikrotitracyjn¹. Wirówka mo e nie osi¹gn¹æ w tym czasie nastawionej prêdkoœci obrotów. 6. Otwieraj¹c do³ki pojedynczo, dodawaæ do ka dego do³ka po 250 µl izopropanolu. Po ka dym dodaniu odczynnika zepchn¹æ pokrywkê w dó³ a do zamkniêcia siê zatrzasku, szczelnie zamykaj¹cego do³ek. UWAGA: Objêtoœæ izopropanolu jest swoista dla ka dego testu COBAS TaqMan. 7. Wymieszaæ próbki, trzykrotnie odwracaj¹c statyw, a nastêpnie wytrz¹saæ go przez oko³o 10 sekund. Potwierdziæ wzrokowo, e wszystkie do³ki ulegaj¹ wytrz¹saniu i ich zawartoœæ jest dok³adnie wymieszana. 8. Odwirowaæ statyw Lysis Rack przez 10-20 sekund z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z p³ytk¹ mikrotitracyjn¹. Wirówka mo e nie osi¹gn¹æ w tym czasie nastawionej prêdkoœci obrotów. 9. Otwieraj¹c do³ki pojedynczo, przenieœæ 750 µl próbki lub mieszaniny kontrolnej do odpowiednich do³ków statywu z rurkami filtracyjnymi Filter Tube Rack (II, ó³ty) z przymocowanym statywem na odpady Waste Rack (bia³y). Po dodaniu ka dej próbki b¹dÿ mieszaniny kontrolnej zepchn¹æ pokrywkê w dó³ a do zamkniêcia siê zatrzasku, szczelnie zamykaj¹cego do³ek. 10. Po dodaniu wszystkich próbek lub kontroli wirowaæ zestaw zawieraj¹cy statyw Filter Tube Rack przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z p³ytk¹ mikrotitracyjn¹. 11. Otwieraj¹c do³ki pojedynczo, przenieœæ pozosta³e partie próbek i mieszanin kontrolnych do odpowiednich do³ków statywu Filter Tube Rack. Po dodaniu ka dej próbki lub mieszaniny kontrolnej mocno zamkn¹æ pokrywkê do³ka. We w³aœciwy sposób wyrzuciæ statyw Lysis Rack. 12. Wirowaæ zestaw zawieraj¹cy statyw Filter Tube Rack przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z p³ytk¹ mikrotitracyjn¹. 13. Wyj¹æ statyw Filter Tube Rack ze statywu na odpady Waste Rack, przyciskaj¹c obie spinki na górnej powierzchni statywu Filter Tube Rack. Wyrzuciæ statyw Waste Rack. Zast¹piæ zu yty statyw Waste Rack nowym i przypi¹æ statyw Filter Tube Rack do statywu Waste Rack. 14. Otworzyæ wszystkie pokrywki statywu Filter Tube Rack za pomoc¹ chwytaków (Grippers) i dodaæ pipet¹ 400 µl buforu usuwaj¹cego inhibitor (IRB), wlewaj¹c p³yn po œciance ka dego do³ka. Nie dotykaæ do œcianek do³ka. Po dodaniu buforu usuwaj¹cego inhibitor do wszystkich do³ków zamkn¹æ mocno pokrywki. 15. Wirowaæ zestaw zawieraj¹cy statyw Filter Tube Rack przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z p³ytk¹ mikrotitracyjn¹. 13

16. Za pomoc¹ chwytaków otworzyæ wszystkie pokrywki i dodaæ pipet¹ 700 µl buforu wymywaj¹cego (WASH), wlewaj¹c p³yn po œciance ka dego do³ka. Nie dotykaæ do œcianek do³ka. Po dodaniu buforu wymywaj¹cego do wszystkich do³ków zamkn¹æ mocno pokrywki. 17. Wirowaæ zestaw zawieraj¹cy statyw Filter Tube Rack przez 2 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z p³ytk¹ mikrotitracyjn¹. 18. Wyj¹æ statyw Filter Tube Rack ze statywu na odpady Waste Rack, przyciskaj¹c obie spinki na górnej powierzchni statywu Filter Tube Rack. Wyrzuciæ statyw Waste Rack. Zast¹piæ zu yty statyw Waste Rack nowym i przypi¹æ statyw Filter Tube Rack do statywu Waste Rack. 19. Za pomoc¹ chwytaków otworzyæ wszystkie pokrywki i dodaæ pipet¹ 700 µl buforu wymywaj¹cego, wlewaj¹c p³yn po œciance ka dego do³ka. Nie dotykaæ do œcianek do³ka. Po dodaniu buforu wymywaj¹cego do wszystkich do³ków zamkn¹æ mocno pokrywki. 20. Wirowaæ zestaw zawieraj¹cy statyw Filter Tube Rack przez 3 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z p³ytk¹ mikrotitracyjn¹. 21. Wyj¹æ statyw Filter Tube Rack ze statywu na odpady Waste Rack, przyciskaj¹c obie spinki na górnej powierzchni statywu Filter Tube Rack. Na³o yæ statyw Filter Tube Rack na statyw do elucji Elution Rack (IIIA, niebieski) i przypi¹æ statyw Filter Tube Rack do statywu Elution Rack. W odpowiedni sposób wyrzuciæ statyw Waste Rack. 22. Za pomoc¹ chwytaków otworzyæ wszystkie pokrywki i dodaæ pipet¹ 75 µl ogrzanego buforu do elucji (ELB) na œrodek ka dego filtra, nie dotykaj¹c samego filtra. UWAGA: Nie dodawaæ buforu do elucji przez wlewanie go po œciance do³ka. Po dodaniu buforu do elucji do wszystkich do³ków zamkn¹æ mocno pokrywki. Inkubowaæ statyw Elution Rack w temperaturze pokojowej co najmniej przez 3 minuty od dodania buforu do elucji do ostatniego do³ka. 23. Wirowaæ zestaw zawieraj¹cy statyw Filter Tube Rack przez 3 minuty z przyspieszeniem 4600 x g w wirówce z p³ytk¹ mikrotitracyjn¹. 24. Wyj¹æ statyw Filter Tube Rack ze statywu do elucji Elution Rack, przyciskaj¹c obie spinki na górnej powierzchni statywu Filter Tube Rack. We w³aœciwy sposób wyrzuciæ statyw Filter Tube Rack. 25. Na³o yæ statyw z pokrywkami Cover Rack (IIIB, niebieski) na statyw do elucji Elution Rack (IIIA, niebieski). Docisn¹æ mocno i zapi¹æ spinki na statywie Elution Rack. Zamkn¹æ wszystkie pokrywki. 26. Poddawane obróbce próbki i kontrole s¹ stosowane bezpoœrednio w reakcji PCR. Do amplifikacji nale y u yæ po 50 µl poddawanych obróbce próbek i kontroli. Dodaæ obrabiane próbki i kontrole do roboczego odczynnika Master Mix w ci¹gu 3 godzin od ukoñczenia przygotowania próbek i kontroli. Jeœli obrabianych próbek i kontroli nie mo na wykorzystaæ w ci¹gu 3 godzin od ich przygotowania, mo na je przechowywaæ w temperaturze 2-8 C do 24 godzin w zamkniêtym statywie Elution Rack, b¹dÿ zamro one do temperatury -20 C do 1 tygodnia w ja³owych, polipropylenowych, zakrêcanych probówkach o pojemnoœci 2,0 ml (takich jak Sarstedt P/N: 72.694.006). Poddaæ obrabiane próbki i kontrole amplifikacji w ci¹gu 3 godzin od ich dodania do roboczego odczynnika Master Mix. Amplifikacja i detekcja UWAGA: Zasobniki na probówki K-tube oraz uchwyt zasobnika nale y przetrzeæ tkanin¹ nieuwalniaj¹c¹ w³ókien, zwil on¹ 70% roztworem izopropanolu. C. Przygotowanie odczynnika UWAGA: Odczynniki COBAS TaqMan HBV Master Mix (HBV MMX), roboczy Master Mix (Working MMX) oraz roboczy Master Mix z dodan¹ próbk¹ lub kontrol¹ s¹ wra liwe na œwiat³o. Chroniæ wymienione odczynniki przed œwiat³em. UWAGA: Odczynniki COBAS TaqMan HBV Master Mix (HBV MMX) oraz roztwór manganu COBAS TaqMan (CTM Mn 2+ ) nale y ogrzaæ do temperatury otoczenia co najmniej na 30 minut przed przygotowaniem roboczego odczynnika Master Mix. UWAGA: Przygotowywaæ roboczy odczynnik MMX po zakoñczeniu przygotowywania próbek i kontroli. UWAGA: Roboczy odczynnik MMX nale y zu yæ w ci¹gu 2 godzin od jego przygotowania. UWAGA: Po dodaniu obrabianych próbek i kontroli do roboczego odczynnika Master Mix amplifikacja powinna rozpocz¹æ siê w ci¹gu 3 godzin. 1. Ogrzaæ jedn¹ fiolkê odczynnika HBV MMX oraz jedn¹ fiolkê odczynnika CTM Mn 2+ do temperatury otoczenia przez co najmniej 30 minut. 2. Umieœciæ zasobnik na probówki K-tube w uchwycie zasobnika. 3. W³o yæ nowe probówki K-tube do zasobnika, nie dotykaj¹c bocznych œcianek probówek. 14

UWAGA: Jeœli zamierza siê do przebiegu testowego w³¹czyæ mniej ni 24 probówki, nale y wype³niæ probówkami nastêpuj¹ce pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, aby obci¹ enie zasobnika po umieszczeniu w termocyklerze by³o równomierne. 4. Zdj¹æ korki z probówek K-tube przy pomocy urz¹dzenia do mocowania korków. Umieœciæ korki w podrêcznym uchwycie na probówki K-tube. 5. Przygotowaæ roboczy odczynnik MMX w nastêpuj¹cy sposób: W celu wykonania 24 testów dodaæ 191 µl odczynnika CTM Mn 2+ do jednej fiolki z odczynnikiem HBV MMX. Zamkn¹æ buteleczkê i dok³adnie wymieszaæ zawartoœæ, odwracaj¹c 10 razy. Nie wytrz¹saæ roboczego odczynnika MMX na mieszadle wibracyjnym. Chroniæ roboczy odczynnik MMX przed œwiat³em i zu yæ w ci¹gu 2 godzin. W celu wykonania 12 testów pobraæ 660 µl odczynnika HBV MMX i wlaæ do 2 ml probówki. Dodaæ 90 µl odczynnika CTM Mn 2+ do 2 ml probówki zawieraj¹cej HBV MMX, zamkn¹æ probówkê korkiem i dok³adnie wymieszaæ zawartoœæ, odwracaj¹c probówkê 10 razy. Chroniæ roboczy odczynnik MMX przed œwiat³em i zu yæ w ci¹gu 2 godzin. Przechowywaæ niezu yte partie odczynników: HBV MMX i CTM Mn 2+ w oryginalnych fiolkach w temperaturze 2-8 C. Po otwarciu odczynniki HBV MMX i CTM Mn 2+ zachowuj¹ stabilnoœæ w temperaturze 2-8 C przez 30 dni lub do zakoñczenia okresu przydatnoœci, zale nie od tego, która z dat jest wczeœniejsza. UWAGA: Objêtoœæ odczynnika CTM Mn 2+ jest swoista dla testu COBAS TaqMan HBV. 6. Przenieœæ pipet¹ 50 µl roboczego odczynnika MMX do ka dej probówki K-tube. UWAGA: Je eli poddane obróbce próbki i kontrole przed amplifikacj¹ przechowywano zamro one, nale y je rozmroziæ w temperaturze pokojowej przed przyst¹pieniem do Etapu 7. 7. Dodaæ 50 µl ka dej poddanej obróbce próbki i kontroli do odpowiednich probówek K-tube zawieraj¹cych roboczy odczynnik MMX, wykorzystuj¹c do tego celu mikropipetor z koñcówk¹ z barier¹ aerozolow¹ lub dodatnim wypieraniem. Ostro nie wymieszaæ ka d¹ próbkê i próbê kontroln¹, 3 razy nabieraj¹c do mikropipetora i wypuszczaj¹c ponownie, nie doprowadzaj¹c przy tym do tworzenia siê pêcherzyków. 8. Powtórzyæ czynnoœci z etapu 7 w odniesieniu do ka dej próbki i poddawanej obróbce kontroli a do przeniesienia ka dej z nich do probówki K-tube. Do ka dej próbki badanej i kontrolnej u yæ nowej koñcówki. Sprawdziæ wzrokowo probówki w poszukiwaniu pêcherzyków i usun¹æ je w razie koniecznoœci. Na³o yæ korki na probówki K-tube przy pomocy urz¹dzenia do mocowania korków. Sprawdziæ wzrokowo, czy dodano odpowiednie objêtoœci próbek. 9. Amplifikacjê nale y rozpocz¹æ w ci¹gu 3 godzin od czasu dodania przygotowanych próbek badanych i kontrolnych do probówek (K-tube) zawieraj¹cych roboczy odczynnik MMX. D. adowanie i obs³uga aparatu COBAS TaqMan 48 1. W³¹czyæ komputer na stanowisku roboczym i zalogowaæ siê do systemu Windows XP, u ywaj¹c odpowiedniej nazwy u ytkownika i has³a. 2. W³¹czyæ aparat COBAS TaqMan 48. Sprawdziæ, czy aparat uruchamia siê i przygotowuje do pracy zgodnie z opisem w Instrukcji obs³ugi analizatora COBAS TaqMan 48. Jeœli zasobniki na probówki K-tube z poprzednich przebiegów testowych znajduj¹ siê nadal w którymkolwiek z termocyklerów, wyj¹æ je przy pomocy przenoœnika zgodnie z opisem w Instrukcji obs³ugi aparatu COBAS TaqMan 48. 3. Uruchomiæ na komputerze program AMPLILINK. Zalogowaæ siê, u ywaj¹c odpowiedniej nazwy u ytkownika i has³a. 4. Aby wprowadziæ numeracjê próbek przeznaczonych do analizy w zasobniku na probówki K-tube, klikn¹æ na ikonê z napisem Orders. Wybraæ zak³adkê z napisem Sample, nastêpnie klikn¹æ na przycisk z napisem New i wprowadziæ numer porz¹dkowy dla ka dej próbki za pomoc¹ klawiatury lub czytnika kodów kreskowych. W oknie Test Definition wybraæ nazwê HBV_HPS. Powtórzyæ opisan¹ procedurê dla ka dej próbki. Klikn¹æ przycisk Save. UWAGA: Jeœli zamierza siê do przebiegu testowego w³¹czyæ mniej ni 24 probówki, nale y wype³niæ probówkami nastêpuj¹ce pozycje zasobnika: 1, 2, 5, 20, 23 i 24, aby obci¹ enie zasobnika po umieszczeniu w termocyklerze by³o równomierne. 5. Wprowadziæ dane dotycz¹ce kontroli jakoœci, wybieraj¹c zak³adkê Quality Control w oknie Orders. Klikn¹æ przycisk New i wprowadziæ dane zamieszczone na dostarczonej wraz z zestawem karcie COBAS TaqMan HBV Test Controls Value Card za pomoc¹ klawiatury lub czytnika kodów kreskowych. Wprowadziæ w odpowiednich oknach: numer serii testu COBAS TaqMan HBV, datê przydatnoœci do u ycia, zakresy wartoœci kontroli Low (+) i High (+) oraz swoiste dla ka dej serii wspó³czynniki kalibracji. Klikn¹æ przycisk OK. 6. Przypisaæ numer zasobnika na probówki K-tube przebiegowi testowemu, klikaj¹c zak³adkê K-Carrier w oknie Orders. W oknie K-Carrier klikn¹æ przycisk New. W okienku na prawo od napisu K-Carrier ID wprowadziæ numer zasobnika zamieszczony na jego kodzie kreskowym, u ywaj¹c klawiatury lub czytnika kodów kreskowych. Nale y zauwa yæ, e wymagane jest zaakceptowanie wyników poprzedniego przebiegu testowego dokonanego przy wprowadzonym tym samym numerze identyfikacyjnym (ID) zasobnika. Z panelu testów w dolnej czêœci okna wybraæ nazwê testu HBV_HPS. 15