Ćwiczenie 1 AMINOKWASY. BUDOWA I WŁAŚCIWOŚCI Część doświadczalna obejmuje: - rozdział aminokwasów metodą chromatografii podziałowej (technika chromatografii bibułowej wstępującej) - miareczkowanie alaniny (wyznaczenie wartości pi i wartości pk a grupy karboksylowej i aminowej) - wykonanie reakcji charakterystycznych dla wybranych aminokwasów WPROWADZENIE Aminokwasy są kwasami organicznymi zawierającymi wolną grupą karboksylową oraz wolną grupą aminową, połoŝoną przy α-atomie węgla. Poza tymi dwoma grupami, kaŝdy aminokwas ma charakterystyczny dla siebie łańcuch boczny R (Ryc. 1 i 2) Ryc. 1. Schemat budowy i zróŝnicowanie funkcjonalne aminokwasów (Koolman, Röhm 2005) Aminokwasy są składnikami budulcowymi peptydów i białek (aminokwasy proteinogenne). Niektóre aminokwasy wchodzą w skład lipidów, np. seryna występuje w fosfolipidach, a glicyna w solach Ŝółciowych. Glutaminian, asparaginian oraz glicyna odgrywają rolę neuroprzekaźników. Wszystkie aminokwasy, za wyjątkiem tylko lizyny i leucyny, mogą być metabolitami pośrednimi szlaku glukoneogenezy (aminokwasy glukogenne), tzn. mogą posłuŝyć do biosyntezy glukozy. Niektóre aminokwasy (asparaginian, glutaminian) są wykorzystywane do syntezy zasad puryno- 1
wych i pirymidynowych, hemu (glicyna), amin biogennych (np. seryna, glutaminian) (Ryc. 4). Niektóre aminokwasy są donorami grup aminowych przenoszonych na ketokwasy, a inne funkcjonują w cyklu mocznikowym (ornityna, cytrulina) (Ryc. 3). Ryc. 2. Łańcuchy boczne aminokwasów proteinogennych (Koolman, Röhm 2005) Na ryc. 2 przedstawiono łańcuchy boczne dwudziestu aminokwasów budujących białka (aminokwasy proteinogenne), które ze względu na budowę chemiczną oraz polarność łańcuchów bocznych podzielono na siedem klas. Wartości podane na dole po lewej przedstawiają stopień polarności danego łańcucha bocznego (najmniejszy u Phe, Cys, Met, Ala, a największy u Arg, Lys). Przy łańcuchach bocznych zdolnych do jonizacji podane są takŝe wartości pk (czerwone liczby). Szczegól- 2
ną pozycję wśród aminokwasów zajmuje prolina (Pro). Jej łańcuch boczny wraz z węglem-α i grupą aminową przy tym węglu tworzą 5-członowy pierścień. Atom azotu w pierścieniu jest słabo zasadowy i w warunkach fizjologicznych nie jest uprotonowany. Aminokwasy, które nie mogą być syntetyzowane w organizmach ludzkich (aminokwasy egzogenne), oznaczone są czerwoną gwiazdką. Ryc. 3. Aminokwasy rzadkie (Koolman, Röhm 2005) Ryc. 4. Aminy biogenne pochodne aminokwasów (Koolman, Röhm 2005) Właściwości amfoteryczne aminokwasów. Obecność w aminokwasach grupy karboksylowej i grupy aminowej powoduje, Ŝe są one związkami amfoterycznymi. W roztworach wodnych występują głównie w formie jonów. W zaleŝności od ph środowiska jony te mogą mieć charakter kwasowy bądź zasadowy. 3
W środowisku kwasowym aminokwas przyłącza proton, staje się kationem i zachowuje jak kwas, gdyŝ występujące w cząsteczce grupa karboksylowa COOH i grupa amoniowa NH + 3 mogą być donorami protonów. W środowisku zasadowym aminokwas oddając proton staje się anionem i dlatego zachowuje się jak zasada, poniewaŝ zdysocjowana grupa karboksylowa COO - i grupa aminowa NH 2 mogą przyłączać protony. Jest taka wartość ph roztworu, w której cząsteczki aminokwasów występują w formie jonu obojnaczego, w którym liczba ładunków ujemnych jest równa liczbie ładunków dodatnich, czyli sumarycznie ładunek równy jest zeru. Taka wartość ph nosi nazwę punktu izoelektrycznego (pi). Charakter amfoteryczny aminokwasów ujmuje graficznie krzywa miareczkowania roztworów aminokwasów mocnymi kwasami lub zasadami (Ryc. 5). Krzywa przedstawia zaleŝność wartości ph miareczkowanego roztworu od liczby dodanych moli kwasu lub zasady. ZaleŜność między wartością ph a stanem dysocjacji opisano równaniem Hendersona-Hasselbalcha, gdzie K a = stała kwasowa, a pk a = ujemny logarytm stałej kwasowej Z powyŝszego równania wynika, iŝ w warunkach, gdy formy zdysocjowana i niezdysocjowana są w stęŝeniach równowagowych, to pk a = ph Ryc. 5. Krzywa miareczkowania histydyny (Karlson 1987) 4
Miareczkowanie roztworu aminokwasu połączone z jednoczesnym pomiarem ph roztworu pozwala na doświadczalne wyznaczenie krzywej dysocjacji aminokwasu, określenie jego wartości pi oraz wyznaczenie wartości pk a jego grup funkcyjnych. Rozdział aminokwasów Jedną z metod rozdziału aminokwasów pozwalającą izolować z mieszaniny pojedyncze aminokwasy jest chromatografia podziałowa. Opiera się ona na prawie podziału solutu (substancji rozpuszczonej) między dwie fazy ciekłe - ruchomą i stacjonarną. Faza stacjonarna utrzymywana jest przez porowaty nośnik słabo adsorbujący składniki solutu. Porowatym nośnikiem moŝe być bibuła lub Ŝel ułoŝony w kolumnie chromatograficznej lub wylany na płytkę. Warunkiem decydującym o rozdziale substancji są róŝnice w ich rozpuszczalności w fazie ruchomej i nieruchomej, a więc róŝnice we współczynnikach podziału między dwie nie mieszające się ze sobą fazy ciekłe. Chromatografia podziałowa opiera się więc na prawie Nernsta, które mówi, iŝ w układzie utworzonym przez dwie nie mieszające się ze sobą fazy ciekłe i wspólny dla nich solut, stosunek stęŝenia tego solutu w fazie 1 (c1) do jego stęŝenia w fazie 2 (c2) jest w stanie równowagi wielkością stałą, zaleŝną od temperatury i właściwości substancji tworzących roztwory, a niezaleŝną od ilości substancji rozpuszczonej: c 1 /c 2 = k Miarą selektywności rozdziału dwóch substancji A i B w danym układzie jest stopień rozdziału, którego wartość określa wzór: β = K A /K B gdzie K A określa stosunek podziału substancji A, K B - stosunek podziału substancji B między fazę ruchomą i nieruchomą. Technika chromatografii bibułowej. W chromatografii bibułowej nośnikiem fazy stacjonarnej, najczęściej polarnej, jest odpowiednio spreparowana bibuła filtracyjna. Bibuła jest zbudowana z włókien celulozowych ułoŝonych w porowatą, Ŝelową strukturę stanowiącą fazę nieruchomą. Cząsteczki wody zaadsorbowane na bibule łączą się z włóknami celulozy wiązaniami wodorowymi. Fazę ruchomą w chromatografii bibułowej stanowią odpowiednie rozpuszczalniki organiczne pojedyncze lub zmieszane. Rozpuszczalniki muszą się częściowo mieszać z wodą np. szeroko rozpowszechnionym układem jest mieszanina n-butanolu/kwasu octowego/wody w zmiennych proporcjach. Szybkość wędrowania danego związku w określonych warunkach jest wartością stałą. Jej miarą jest wartość R f : R f = x/y, gdzie x - odległość od linii startowej do środka plamy aminokwasu, a y - odległość od linii startowej do czoła rozpuszczalnika. W tabeli I podane są wartości R f dla większo- 5
ści aminokwasów rozdzielanych w warunkach zbliŝonych do tych, w jakich będzie wykonywane ćwiczenie. Tabela I. Wartości R f aminokwasów (jako fazy ruchomej uŝywano mieszaniny: n-butanol/kwas octowy/woda zmieszanych w stosunku 4:1:1) Lp. Nazwa aminokwasu Symbol aminokwasu Wartości R f x 100 w układzie rozpuszczalników: n-butanol/ch 3 COOH/H 2 O 1. alanina Ala A 30 2. arginina Arg R 15 3. kwas asparaginowy Asp D 22 4. asparagina Asn N 12 5. cystyna 5 6. cysteina Cys C 8 7. kwas cysteinowy CysSO 3 H 7 8. fenyloalanina Phe F 60 9. glicyna Gly G 23 10. kwas glutaminowy Glu E 28 11. glutamina Gln Q 17 12. histydyna His H 11 13. leucyna Leu L 70 14. izoleucyna Ile I 67 15. lizyna Lys K 12 16. metionina Met M 50 17. sulfonian metioniny MetSO 3 H 22 18. prolina Pro P 34 19. hydroksyprolina ProOH 22 20. seryna Ser S 22 21. treonina Thr T 26 22. tryptofan Trp W 50 23. tyrozyna Tyr Y 45 24. walina Val V 51 25. ornityna Orn 12 26. cytrulina Cytr 18 WYKONANIE Chromatografia bibułowa wstępująca Na arkusz bibuły o wymiarach 15 x 20 cm z zaznaczoną linią startową, w 2 cm odstępach nanieść po kilka µl roztworu wzorcowych aminokwasów (glicyna, alanina, tyrozyna, leucyna) oraz taką samą objętość roztworu zawierającego mieszaninę aminokwasów (próba badana). KaŜdy aminokwas wzorcowy oraz próbkę badaną nanieść na bibułę dwukrotnie w celu wyeliminowania ewentualnych artefaktów. W czasie nanoszenia próbek miejsce nanoszenia naleŝy suszyć suszarką do włosów, tak by wielkość plamek była moŝliwie jak najmniejsza. Arkusz bibuły z naniesionymi 6
próbkami zwinąć w cylinder, zszyć zszywkami i umieścić do rozwinięcia w komorze chromatograficznej. Rozdział przerwać, gdy rozpuszczalnik dotrze na wysokość około 1,5 cm od górnego brzegu bibuły. Po wyjęciu bibuły z komory, zaznaczyć ołówkiem czoło rozpuszczalnika, bibułę wysuszyć w strumieniu ciepłego powietrza (ok. 50 0 C), spryskać roztworem ninhydryny, a następnie wysuszyć w suszarce w temperaturze 80 0 C w celu zlokalizowania miejsca połoŝenia rozdzielonych aminokwasów. Pomierzyć odległości od linii startu do środka wybarwionych plamek oraz odległość do czoła rozpuszczalnika, a następnie obliczyć wartości współczynnika R f. Porównując wartości R f aminokwasów wzorcowych i aminokwasów zawartych w próbce zidentyfikować aminokwasy występujące w otrzymanej do analizy mieszaninie. NaleŜy równieŝ porównać wyliczone wartości R f z wartościami zamieszczonymi w Tabeli I. Miareczkowanie aminokwasów 15 ml 50 mm roztworu alaniny w 0,1 M HCl wlać do zlewki, dodać 15 ml 0,1 M NaOH. Ustawić na mieszadle magnetycznym i zmierzyć ph roztworu (Uwaga! Bardzo ostroŝnie opuszczać elektrodę wodorową phmetru). Dodawać ostroŝnie po 1 ml 0,1 M roztworu NaOH mierząc i zapisując cały czas wartości ph. Po zakończeniu miareczkowania wykreślić krzywą zaleŝności ph roztworu od ilości dodanego NaOH, wyznaczyć wartości pk a grupy karboksylowej i aminowej oraz wartość pi alaniny. Reakcje charakterystyczne aminokwasów A, Reakcje ogólne: Reakcja z ninhydryną Do 0,1 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 1 kroplę 0,1% roztworu ninhydryny i ogrzać do wrzenia. Pojawia się fioletowo-niebieskie zabarwienie. Aminokwasy pod wpływem ninhydryny ulegają utlenieniu do iminokwasów. Kolejne etapy przemian to deaminacja i dekarboksylacja oraz wytworzenie aldehydu skróconego o 1 atom węgla. W wyniku kondensacji utlenionej i zredukowanej w powyŝszym procesie cząsteczki ninhydryny oraz amoniaku powstaje kompleks o fioletowo-niebieskiej barwie (maksimum absorpcji przy λ = 570 nm), którego natęŝenie jest proporcjonalne do zawartości azotu aminowego aminokwasu. Reakcja z ninhydryną moŝe słuŝyć do ilościowego oznaczania aminokwasów metodą spektrofotometryczną. Dodatni odczyn ninhydrynowy dają obok aminokwasów, peptydów i białek takŝe sole amonowe, aminocukry i amoniak. 7
Reakcja z kwasem azotawym (kwasem azotowym(iii)) Do 1 ml ochłodzonego w lodzie, świeŝo przyrządzonego 10% azotanu (III) sodu (azotyn sodu) dodać taką samą objętość 2M kwasu octowego. W wyniku reakcji powstaje kwas azotawy HNO 2 Po zmieszaniu obu roztworów zaczekać do momentu zakończenia wydzielania się pęcherzyków tlenków azotu, a następnie dodać 2 ml 1% roztworu aminokwasu. Wydziela się burzliwie azot. HOOC - CH 2 - NH 2 + O = N - OH HOOC - CH 2 OH + H 2 O + N 2 Reakcja z kwasem azotawym umoŝliwia manometryczne oznaczanie azotu grup aminowych polegające na mierzeniu objętości wydzielającego się azotu (reakcja Van Slyke a). Tworzenie związków chelatowych Do 3 ml 1% roztworu aminokwasu dodać szczyptę węglanu miedzi (II). Ogrzać próby do wrzenia. Po minucie, intensywnie niebieski roztwór przesączyć na gorąco. Po ochłodzeniu przesączu wykrystalizowuje kompleks aminokwasu z miedzią w postaci delikatnych igieł. 2 H 2 N - CH 2 - COOH + CuCO 3 Cu (OOC - CH 2 - NH 2 ) 2 + CO 2 + H 2 O COO H 2 N Kompleks glicyna - miedź H 2 C Cu CH 2 NH 2 OOC 8
B, Reakcje charakterystyczne dla wybranych aminokwasów Reakcja ksantoproteinowa Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 0,25 ml stęŝonego HNO 3 i kroplę stęŝonego H 2 SO 4. Roztwór barwi się na Ŝółto. Po zalkalizowaniu 30% roztworem NaOH, zabarwienie przechodzi w pomarańczowe. Reakcja ta jest charakterystyczna dla aminokwasów aromatycznych i fenoli. W wyniku działania stęŝonego HNO 3 pierścień benzenowy ulega nitrowaniu, a powstałe Ŝółte pochodne wielonitrowe dają w roztworze zasadowym pomarańczowe aniony nitrofenolanowe. Reakcja na tyrozynę reakcja Millona Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać kilka kropel odczynnika Millona (10 g azotanu (V) rtęci (I) rozpuścić w 100 ml 3,6 M kwasu azotowego (V), uzupełnić wodą dest. do 200 ml i lekko podgrzać do 40 o C). Roztwór barwi się na kolor ceglasto-róŝowy, następnie na czerwony. Reakcja ta jest charakterystyczna dla monofenoli, a więc z aminokwasów tylko dla tyrozyny. SłuŜy ona do ilościowego oznaczania tyrozyny metodą kolorymetryczną. Reakcja na tryptofan reakcja Cole-Hopkinsa Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać kilka kropel kwasu glioksalowego. Po wymieszaniu, roztwór naleŝy ostroŝnie podwarstwić stęŝonym roztworem H 2 SO 4. Na granicy cieczy powstaje fioletowy pierścień. Jest to reakcja charakterystyczna dla tryptofanu, aminokwasu zawierającego 9
pierścień indolowy. W obecności kwasu siarkowego (VI) i aldehydu (kwas glioksalowy), dwa ugrupowania indolowe ulegają kondensacji tworząc barwny fioletowy związek. tryptofan kwas glioksalowy związek barwny Reakcja na argininę reakcja Sakaguchi Do 1 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 0,25 ml 5% roztworu NaOH, 2 krople 1% roztworu α- naftolu i jedną kroplę roztworu chloranu (I) sodu. Po wymieszaniu pojawia się powoli czerwone zabarwienie. Pochodne guanidyny, takie jak metyloguanidyna i arginina z utlenionym przez chloran (I) α-naftolem dają barwny związek i amoniak. Amoniak pod wpływem chloranu (I) utlenia się. Z jednego mola guanidyny uwalnia się 1/2 mola N 2. α - naftol arginina związek barwny + 3 NaClO 2 NH 3 N 2 + 3 H 2 O + 3 NaCl Reakcja cystynowa Do 0,5 ml 1% roztworu aminokwasu dodać 0,5 ml 10% roztworu NaOH i kilka kropel nasyconego roztworu octanu ołowiu. Z cystyny i cysteiny przy ogrzewaniu ze stęŝonym NaOH wydziela się siarkowodór, który w reakcji z Pb 2+ daje siarczek ołowiu. Po dłuŝszym gotowaniu roztwór staje się brunatny, a następnie wytrąca się osad PbS. NaOH NaOH H 2 S Pb(OOC - CH 3 ) 2 Pb(OH) 2 Pb(OH) 3 - PbS 10
Zagadnienia do przygotowania: - wzory, symbole trzy- i jednoliterowe aminokwasów proteinogennych oraz aminokwasów cyklu mocznikowego (ornityna, cytrulina) - klasyfikacja aminokwasów oparta na budowie chemicznej łańcucha bocznego oraz jego polarności - podstawowe funkcje aminokwasów (przykłady) - ogólne zasady chromatografii podziałowej; technika chromatografii bibułowej wstępującej - reakcje ogólne na aminokwasy (znajomość reakcji z ninhydryną) -wybrane reakcje charakterystyczne dla aminokwasów Piśmiennictwo: Biochemia JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005 Zarys biochemii P Karlson PWN, Warszawa, 1987 Ćwiczenia z biochemii - (pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz) PWN, Warszawa, 2005 Biochemia. Ilustrowany przewodnik J Koolman, K-H Röhm, PZWL, Warszawa 2005 11