ROZPRAWA HABILITACYJNA

ISBN 978-83-924535-8-1 Instytut Fizjologii i Żywienia Zwierząt im. Jana Kielanowskiego, Polskiej Akademii Nauk w Jabłonnie ROZPRAWA HABILITACYJNA Jarosław Woliński Wpływ egzogennej obestatyny na przewód pokarmowy nowo narodzonych prosiąt The influence of exogenous obestatin on the gastrointestinal tract in newborn piglets Jabłonna 2012

SPIS TREŚCI 1. WSTĘP.. 1 1.1. Budowa jelita cienkiego. 2 1.2. Rozwój jelita cienkiego w okresie postnatalnym... 3 1.3. Rozwój i znaczenie bariery jelitowej... 3 1.4. Przebudowa nabłonka błony śluzowej jelita cienkiego 5 1.5. Motoryka jelita cienkiego - rozwój i regulacja. 6 1.6. Czynniki wpływające na rozwój jelita cienkiego... 7 1.6.1. Biologicznie aktywne składniki siary i mleka... 8 1.7. Obestatyna 9 1.7.1. Struktura obestatyny.. 9 1.7.2. Receptor..... 10 1.7.3. Występowanie... 11 1.7.4. Obestatyna a regulacja gospodarki energetycznej.... 12 1.7.4.1. Obestatyna, a metabolizm glukozy. 13 1.7.5. Wpływ obestatyny na fizjologię przewodu pokarmowego.... 13 1.7.6. Obestatyna jako czynnik wzrostu... 14 1.7.7. Obestatyna a rozwój noworodka..... 14 2. CEL PRACY..... 15 3. MATERIAŁY I METODY... 17 3.1. Zwierzęta doświadczalne........ 17 3.1.1. Pochodzenie zwierząt....... 17 3.1.2. Utrzymywanie zwierząt w laboratorium...... 17 3.1.2.1. Karmienie zwierząt.......... 18 3.1.3. Liczba zwierząt i podział na grupy..... 19

3.1.3.1. Podawanie dożołądkowe obestatyny........ 19 3.1.3.2. Podawanie dożylne obestatyny........ 19 3.1.4. Ważenie prosiąt........ 20 3.1.5. Eutanazja zwierząt........ 20 3.2. Badania organometryczne........ 20 3.3. Pobieranie i utrwalanie materiału do oceny histologicznej oraz immunohistochemicznej........... 20 3.4. Barwienie preparatów... 21 3.4.1. Analiza histometryczna... 21 3.4.2. Metody immunohistochemiczne... 21 3.4.2.1. Indeks mitotyczny komórek macierzystych krypt jelitowych... 22 3.4.2.2. Indeks apoptotycznego komórek nabłonka jelita cienkiego... 22 3.5. Badanie błony śluzowej jelita cienkiego...... 23 3.5.1. Pobieranie błony śluzowej...... 23 3.5.2. Oznaczanie aktywności enzymów amylolitycznych...... 23 3.5.3. Oznaczanie aktywności enzymów proteolitycznych...... 24 3.5.4. Oznaczanie zawartości białka całkowitego...... 24 3.6. Ocena aktywności skurczowej mięśniówki gładkiej jelita cienkiego in vitro........... 25 3.7. Analiza statystyczna wyników...... 25 3.8. Pobieranie i utrwalenie materiału do analiz profilu transkryptomicznego komórek przewodu pokarmowego przy użyciu mikromacierzy DNA.. 26 3.8.1. Mikromacierze.......... 26 3.8.2. Aparatura..... 26 3.8.3. Izolacja RNA........ 27 3.8.4. Oczyszczanie RNA...... 27 3.8.5. Znakowanie RNA....... 27 3.8.6. Skanowanie mikromacierzy..... 27 3.8.7. Analiza statystyczna wyników uzyskanych z badań profilu transkryptomicznego......... 27

3.8.8. Procedura analizy danych......... 28 3.8.9. Wstępne przetworzenie danych...... 28 3.8.9.1. Układ eksperymentu...... 28 3.8.9.2. Eliminacja......... 28 3.8.9.3. Analiza za pomocą pakietu limma (Bioconductor for Microarray Analysis, Fred Hutchinsam Cancer Research Center, USA)... 29 3.8.9.3.1. Wykrywanie genów o najbardziej zróżnicowanej ekspresji pomiędzy grupami........ 29 3.9. Identyfikacja procesów biologicznych i szlaków sygnałowych.... 29 4.0. Zezwolenie na przeprowadzenie badań. 29 4. WYNIKI........ 31 4.1. Wpływ obestatyny na masę ciała i narządy układu pokarmowego... 31 4.1.1. Masa ciała....... 31 4.1.1.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny..... 31 4.1.1.2. Dożylne podawanie obestatyny...... 32 4.1.2. Względna masa żołądka......... 33 4.1.2.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny..... 33 4.1.2.2. Dożylne podawanie obestatyny..... 33 4.1.3. Względna masa trzustki.......... 34 4.1.3.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny..... 34 4.1.3.2. Dożylne podawanie obestatyny...... 34 4.1.4. Względna masa wątroby......... 35 4.1.4.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny..... 35 4.1.4.2. Dożylne podawanie obestatyny...... 35 4.1.5. Podsumowanie............ 36 4.2. Wpływ obestatyny na długość poszczególnych odcinków jelita cienkiego 36 4.2.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny...... 36 4.2.2. Dożylne podawanie obestatyny...... 37 4.2.3. Podsumowanie............ 37

4.3. Wpływ obestatyny na budowę ściany żołądka...... 38 4.3.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny..... 38 4.3.2. Dożylne podawanie obestatyny...... 38 4.3.3. Podsumowanie............ 39 4.4. Wpływ obestatyny na budowę ściany jelita cienkiego...... 39 4.4.1. Ocena histometryczna dwunastnicy... 39 4.4.1.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny.. 39 4.4.1.2. Dożylne podawanie obestatyny... 40 4.4.2. Ocena histometryczna jelita czczego... 40 4.4.2.1. Odcinek proksymalny.... 40 4.4.2.1.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny....... 40 4.4.2.1.2. Dożylne podawanie obestatyny...... 41 4.4.2.2. Odcinek środkowy. 42 4.4.2.2.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny....... 42 4.4.2.2.2. Dożylne podawanie obestatyny...... 42 4.4.2.3. Odcinek dystalny... 43 4.4.2.3.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny....... 43 4.4.2.3.2. Dożylne podawanie obestatyny...... 44 4.4.3. Ocena histometryczna jelita biodrowego.... 44 4.4.3.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny.......... 44 4.4.3.2. Dożylne podawanie obestatyny..... 45 4.4.4. Wpływ obestatyny na procent zwakuolizowanych enterocytów..... 46 4.4.4.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny.......... 46 4.4.4.2. Dożylne podawanie obestatyny..... 47 4.4.5. Podsumowanie............. 47 4.4.6. Wpływ obestatyny na indeks mitotyczny i apoptotyczny błony śluzowej jelita cienkiego..... 48 4.4.6.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny......... 48 4.4.6.2. Dożylne podawanie obestatyny.... 50 4.4.6.3. Podsumowanie............. 50

4.5. Wpływ obestatyny na zawartość białka ogólnego oraz aktywności enzymów rąbka szczoteczkowego błony śluzowej jelita czczego.... 51 4.5.1. Wpływ obestatyny na zawartość białka w błonie śluzowej jelita czczego 51 4.5.1.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny......... 51 4.5.1.2. Dożylne podawanie obestatyny.... 54 4.5.2. Wpływ obestatyny na aktywność laktazy......... 54 4.5.2.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny......... 54 4.5.2.2. Dożylne podawanie obestatyny.... 53 4.5.3. Wpływ obestatyny na aktywność maltazy......... 53 4.5.3.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny......... 54 4.5.3.2. Dożylne podawanie obestatyny.... 54 4.5.4. Wpływ obestatyny na aktywność sacharazy...... 55 4.5.4.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny......... 55 4.5.4.2. Dożylne podawanie obestatyny.... 56 4.5.5. Wpływ obestatyny na aktywność aminopeptydazy A... 56 4.5.5.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny......... 57 4.5.5.2. Dożylne podawanie obestatyny.... 57 4.5.6. Wpływ obestatyny na aktywność aminopeptydazy N...... 58 4.5.6.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny......... 58 4.5.6.2. Dożylne podawanie obestatyny.... 59 4.5.7. Wpływ obestatyny na aktywność dipeptydazy IV..... 59 4.5.7.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny......... 59 4.5.7.2. Dożylne podawanie obestatyny.... 60 4.5.8. Podsumowanie............ 60 4.6. Wpływ obestatyny na kurczliwość jelita cienkiego prosiąt in vitro... 62 4.6.1. Spontaniczna aktywność skurczowa...... 62 4.6.1.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny......... 62 4.6.1.2. Dożylne podawanie obestatyny.... 63 4.6.2. Indukowana aktywność skurczowa...... 63

4.6.2.1. Dożołądkowe podawanie obestatyny......... 63 4.6.2.2. Dożylne podawanie obestatyny...... 64 4.6.2.3. Podsumowanie............ 65 4.7. Wpływ obestatyny na profil transkryptomiczny komórek błony śluzowej jelita cienkiego...... 66 4.7.1. Analiza ekspresji genów zestawienie 3 grup....... 66 4.7.1.1. Badane grupy..... 66 4.7.1.2. Cele analizy.... 67 4.7.2. Wyniki... 67 4.7.3. Interpretacja wyników...... 68 4.7.3.1. Identyfikacja procesów biologicznych i szlaków sygnałowych... 68 4.7.4. Podsumowanie........... 76 5. DYSKUSJA... 77 5.1. Wpływ obestatyny na masę ciała.... 79 5.2. Wpływ obestatyny na przewód pokarmowy..... 81 5.2.1. Wpływ obestatyny na długość jelita, masę żołądka, wątroby i trzustki... 81 5.2.2. Wpływ obestatyny na budowę ściany jelita........ 84 5.2.3. Wpływ obestatyny na aktywność enzymów w błonie śluzowej jelita. 88 5.2.4. Wpływ obestatyny na kurczliwość dwunastnicy i jelita czczego... 89 5.2.5. Wpływ obestatyny na profil transkryptomiczny w komórkach błony śluzowej jelita cienkiego...... 93 6. WNIOSKI.. 95 7. STRESZCZENIE... 97 8. ABSTRAKT... 99 9. LITERATURA... 101 10. SPIS FOTOGRAFII, TABEL I WYKRESÓW... 117 11. ZAŁĄCZNIKI.. 123