Biotechnika rozrodu ryb jesiotrowatych Dr inż. Dorota Fopp-Bayat Katedra Ichtiologii UW-M w Olsztynie
Stanowisko systematyczne (Nelson 1994) gromada: ACTINOPTERYGII RYBY PROMIENIOPŁETWE podgromada: CHONDROSTEI GANOIDY CHRZĘSTNE rząd: ACIPENSERIFORMES JESIOTROKSZTAŁTNE rodzina: Acipenseridae jesiotrowate rodzaj: Huso Bieługi rodzaj: Acipenser Jesiotry rodzaj: Scaphirhynchus - Łopatonosy rodzaj: Pseudoscaphirhynchus Pseudołopatonosy rodzina: Polyodontidae wiosłonosowate rodzaj: Polyodon rodzaj: Psephurus
Przedstawiciele ryb jesiotrokształtnych jesiotr zachodni (Acipenser sturio) sterlet (Acipenser ruthenus) wiosłonos (Polyodon spathula)
Import ryb jesiotrowatych do Polski
Lp Gatunek / mieszaniec Różnorodność gatunków i hybrydów ryb jesiotrowatych hodowanych w Polsce Nazwa łacińska 1 jesiotr syberyjski Acipenser baerii SB 2 jesiotr rosyjski Acipenser gueldenstaedti R 3 sterlet Acipenser ruthenus S 4 siewruga Acipenser stellatus SW Symbol 5 jesiotr syberyjski x jesiotr rosyjski 6 bester (bieługa x sterlet) Acipenser baerii x Acipenser gueldenstaedti Huso huso x Acipenser ruthenus 7 bieługa x bester (Huso huso) x (Huso huso x Acipenser ruthenus) SB x R BS B. BS 8 jesiotr syberyjski x jesiotr zielony Acipenser stenorrhynchus x Acipenser medirostris 9 wiosłonos Polyodon spathula W SB x Z
Dojrzewanie płciowe jesiotrów W warunkach naturalnych ryby jesiotrowate osiągają dojrzałość płciową w wieku 12 24 lat, przy czym samce dojrzewają o 2-3 lata wcześniej. Wyjątek stanowią sterlety, które dojrzałość płciową osiągają już po 5-8 latach. Po osiągnięciu dojrzałości płciowej większość gatunków ryb jesiotrowatych przystępuje do tarła co 3-5 lat. Jedynie sterlety mogą odbywać tarło corocznie.
Stadium dojrzałości płciowej samców Fot. Paweł Woźnicki
Stadium dojrzałości płciowej samic Fot. Paweł Woźnicki
Do owulacji u samic i spermiacji u samców niezbędna jest stymulacja środowiskowa i hormonalna
Stymulacja środowiskowa temperatura wody od 12 do 16 o C wzrost intensywności przepływu wody Fot. Dorota Fopp-Bayat
Stymulacja hormonalna Iniekcje z wyciągu odwodnionej w acetonie przysadki mózgowej dojrzałych jesiotrów lub ryb karpiowatych w ilości od 2 do 8 mg/kg masy ciała samicy (w zależności od stadium dojrzałości gonad i aktywności przysadki (Barannikova i in. 1983, 1993) Ovopel 1 granulka na 1 kg masy ciała samca Syntetyczne analogi LH-RH i GnRH w dawkach od 0,1 do 0,25 μg/kg masy ciała (Doroshov i Lutes 1984)
Efektywność stymulacji hormonalnej ESH jest uzależniona od stadium dojrzałości oocytów, który ocenia się na podstawie stopnia polaryzacji jąder komórkowych oocytów pobranych przyżyciowo z gonady samicy
Fot. Paweł Woźnicki
Osobnik jesiotra syberyjskiego gotowy do tarła Fot. Dorota Fopp-Bayat
Anestezja przed pobieraniem produktów płciowych Fot. Dorota Fopp-Bayat
Uśpiony samiec przygotowany do pobrania mlecza Fot. Dorota Fopp-Bayat
Uśpiona samica przygotowana do pobrania ikry Fot. Dorota Fopp-Bayat
Pobieranie mlecza od sterleta Fot. Dorota Fopp-Bayat
Pobieranie mlecza od jesiotra syberyjskiego Fot. Dorota Fopp-Bayat
Nacinanie jajowodów w celu pozyskania ikry Fot. Dorota Fopp-Bayat
Pobieranie ikry od jesiotra syberyjskiego Fot. Dorota Fopp-Bayat
Pobieranie ikry od sterleta Fot. Dorota Fopp-Bayat
Pobrana ikra przygotowana do zaplemnienia Fot. Dorota Fopp-Bayat
Odklejanie ikry Roztwór mleka Roztwór taniny dwukrotne przepłukanie ikry za pomocą roztworu taniny o stężeniu 0,3 g/l. Czas trwania kąpieli wynosi ok. 30 s, po czym ikrę należy przepłukać w wodzie (Kolman i Szczepkowski 2005)
Zapłodniona i odklejona ikra przygotowana do inkubacji Fot. Dorota Fopp-Bayat
Odpijanie tarlaków Fot. Dorota Fopp-Bayat
Inkubacja ikry w typowych aparatach Weissa Fot. Dorota Fopp-Bayat
Inkubacja ikry Fot. Dorota Fopp-Bayat
Pierwsze podziały komórkowe Fot. Dorota Fopp-Bayat
Informacje na temat rozrodu ryb jesiotrowatych opracowano w oparciu o Poradnik hodowcy JESIOTRY chów i hodowla. Ryszard Kolman 2006.
Szacowanie zmienności genetycznej ryb jesiotrowatych przy zastosowaniu markerów genetycznych Dr inż. Dorota Fopp-Bayat Katedra Ichtiologii UW-M w Olsztynie
Zachowanie zmienności genetycznej stad rozrodczych jest kluczowym działaniem w pracach hodowlanych
Zastosowania technik molekularnych w badaniach ichtiologicznych mają stosunkowo krótką historię. lata 70-te rozwinięcie technik elektroforetycznego badania białek lata 80-te rozkwit bezpośrednich badań genomu (mitochondrialny DNA, mt DNA) lata 90-te analizy jądrowego DNA (ndna)
Łańcuchowa Reakcja Polimerazy (Polimerase Chain Reaction) PCR W połowie lat 80 opracowano technikę, służącą do amplifikacji (powielania) dowolnej sekwencji DNA z użyciem pary oligonukleotydowych starterów oraz termostabilnej polimerazy DNA.
Łańcuchowa Reakcja Polimerazy (Polimerase Chain Reaction) PCR Denaturacja nici DNA w temp. 95oC Przyłączanie starterów reakcji PCR do matrycy w 55oC Polimeryzacja nici DNA w temp. 72oC
Analiza mikrosatelitarnego DNA 5 ATGGTGTAGCTAAAC ATTAT TATTATT (ATT) 25 ACCTTGATCCTT 3 Sekwencje starterów reakcji PCR Sekwencja powtarzająca się
Metody wizualizacji fragmentów mikrosatelitarnego DNA: Elektroforeza agarozowa i wybarwianie bromkiem etydyny. Elektroforeza poliakrylamidowa i wybarwianie azotanem srebra lub przy pomocy radioizotopów. Elektroforeza kapilarna i wybarwianie fluorescencyjne.
Sprzęt podstawowy 1. Aparat do elektroforezy 2. Obudowa 3. Przewody elektryczne 4. Forma do żelu 5. Grzebień 6. Zasilacz pipety, probówki eppendorf, mikrofalówka Elektroforeza agarozowa Odczynniki 1. Agaroza 2. Bufor TBE lub TAE 3. Bromek etydyny 4. Marker (wzorzec molekularny)
Przygotowanie żelu agarozowego Dodanie bromku etydyny i umieszczenie żelu w formie z grzebieniem Nakładanie prób i wzorca masowego Elektroforeza
Bromek etydyny Wizualizacja żelu w świetle UV
0 Schemat postępowania podczas analizy mikrosatelitarnego DNA Pobieranie prób Izolacja DNA PCR 0,7 0,6 Analiza danych 0,7 0,6 Elektroforeza i wizualizacja w żelu poliakrylamidowym Określenie zmienności genetycznej frekwencja alleli frekwencja alleli 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 długość allelu (pz) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 długość allelu (pz) frekwencja alleli frekwencja alleli 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 długość allelu (pz) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 długość allelu (pz)
Analiza mikrosatelitarnych loci wybranych gatunków i hybrydów ryb jesiotrowatych Prążki DNA zidentyfikowane jako allele w locus ls-68: M - marker Øx174, jesiotr syberyjski (SB.L) ścieżki 9 18, 21, 26, jesiotr syberyjski x jesiotr rosyjski (SB. L x R) ścieżki 1-7, 20, jesiotr rosyjski (R) - ścieżka 24, bester (BS) - ścieżka 8, bieługa x bester (BBS) - ścieżki 19, 23, 25, 27, jesiotr syberyjski x jesiotr zielony (SB.L x Z) - ścieżka 22.
Frekwencja alleli w locus ls-68 0,7 0,7 0,6 0,6 frekwencja alleli 0,5 0,4 0,3 0,2 frekwencja alleli 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,1 0 0 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 długość allelu (pz) długość allelu (pz) jesiotr rosyjski jesiotr syberyjski 0,7 0,7 0,6 0,6 frekwencja alleli 0,5 0,4 0,3 0,2 frekwencja alleli 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,1 0 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 0 110 130 150 170 190 210 230 250 270 290 310 330 długość allelu (pz) długość allelu (pz) sterlet wiosłonos
Obliczanie hetrozygotyczności obserwowanej i oczekiwanej Population Sample size Number of alleleles Volga 31 4.25 Observed heterozygosity (H o ) Expected heterozygosity (H e ) 0,66 0,69 Kama 32 6.50 0,68 0,80 Dnieper 8 4.00 0,63 0,72 Dniester 5 4,50 Danube 12 6.00 0,67 0,65 0,70 0,75
Analiza wariancji Locus F IS F IT F ST Afu- 68 Afu- 19 Afu- 39 Aox- 45 0.022 (0.110) -0.164 (0.052) -0.297 (0.101) -0.046 (0.033) 0.116 (0.133) -0.169 (0.063) -0.251 (0.134) 0.055 (0.090) 0.092 (0.041) -0.005 (0.013) 0.033 (0.040) 0.095 (0.057)
Analiza pokrewieństw filogenetycznych
Zastosowanie analiz genetycznych do identyfikacji osobników ryb jesiotrowatych po manipulacjach genomowych określenie ploidalności w grupach doświadczalnych metoda cytogenetyczna, identyfikacja matczynego genomu u potomstwa przy zastosowaniu analizy polimorfizmu mikrosatelitarnego DNA.
Prążki mikrosatelitarnego DNA w locus Afu-68 u gynogenetycznego potomstwa jesiotra syberyjskiego (Acipenser baeri); (Fopp-Bayat i inni 2006).
Prążki mikrosatelitarnego DNA w locus Afu-68 u diploidalnego i triploidalnego potomstwa jesiotra syberyjskiego (Acipenser baeri); Fopp-Bayat i inni 2006.
Dziękuje za uwagę.