Oznaczanie herbicydów z grupy triazyn z zastosowaniem techniki HPLC

Instrukcja ćwiczeń laboratoryjnych analityka zanieczyszczeń środowiska Oznaczanie herbicydów z grupy triazyn z zastosowaniem techniki HPLC WSTĘP Herbicydy - środki chwastobójcze, stosowane do selektywnego lub całkowitego hamowania rozwoju albo niszczenia roślin. Herbicydy można klasyfikować ze względu na: 1) budowę chemiczną 2) działanie na rośliny 3) sposób stosowania. Jako herbicydy stosuje się głównie związki organiczne należące do różnych klas, m.in. związki mocznikowe, związki triazynowe, karbaminiany, pochodne kwasu fenoksyoctowego. Działanie chwastobójcze (fitotoksyczne) herbicydów polega głównie na zaburzaniu procesów fotosyntezy oraz przemian enzymatycznych u roślin, a także hamowaniu podziału komórek (kiełkowania, rozrostu pędów, kłączy), degradacji chlorofilu bądź wzroście transpiracji. Zawartość herbicydów w wodzie można oznaczyć z wykorzystaniem metody HPLC w układzie faz odwróconych. CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z głównymi technikami przygotowania próbek do analizy chromatograficznej oraz z zakresem zastosowań chromatografii cieczowej. Podczas zajęć laboratoryjnych zostanie wykonany eksperyment polegający na izolacji i ilościowym oznaczeniu symazyny, atrazyny i propazyny z próbki wody. WARUNKI ANALIZY CHROMATOGRAFICZNEJ Kolumna: Lichrospher 100 RP-18e 5 um (125x4 mm i.d.) Faza ruchoma: MeOH:H2O 60:40, 1.0 ml/min, Detekcja: UV długość fali: 220 450 nm WYKONANIE ĆWICZENIA 1.Kalibracja Przygotować roztwory kalibracyjne SYMAZYNY, ATRAZYNY, PROPAZYNY o stężeniu 10, 5, 2.5, 1, 0.5 ug/ml w fazie ruchomej poprzez rozcieńczenie roztworów podstawowych o stężeniu 1000 ug/ml (stosować kolbki miarowe o pojemności max 10 ml i mikrostrzykawki o pojemności 100 ul, 50 ul i 10 ul). Ustawić stałą prędkość przepływu eluentu (patrz: warunki rozdzielania) Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa) Po ustaleniu warunków wstrzyknąć do kolumny kolejne roztwory kalibracyjne symazyny, atrazyny i propazyny począwszy od najniższego stężenia Zarejestrować chromatogramy i wyznaczyć powierzchnie pików poszczególnych składników roztworów kalibracyjnych

Rys. 1 Przykład chromatogramu przedstawiający rozdzielenie herbicydów z grupy triazyn znajdowanych w glebie 1 symazyna Kolumna: Lichrospher 100 RP-18e 5 um (125x4 mm i.d.) 2 - atrazyna Faza ruchoma: MeOH:H2O 60:40, 1.0 ml/min, 3 - propazyna Detekcja: UV długość fali: 270 nm 2. Przygotowanie próbek gleby do analizy chromatograficznej - ekstrakcja. 6 g próbki gleby ekstrahować 2-krotnie 10 ml rozpuszczalnika (n-heksan, n-heptan, chloroform, eter metylowo-tertbutylowy) grupa laboratoryjna zostanie podzielona na 4 podgrupy; każda z podgrup ekstrahuje przy użyciu jednego z wymienionych rozpuszczalników. Uzyskuje się około 20 ml ekstraktu, który należy przesączyć przez sączek karbowany. Należy też wykonać ślepe próby z zastosowaniem poszczególnych ekstrahentów. Uzyskany ekstrakt odparować prawie do sucha w próżniowej wyparce obrotowej, a następnie, po ilościowym przeniesieniu do sucha w strumieniu azotu. Pozostałość rozpuścić w 1 ml fazy ruchomej. 3. Wykonanie oznaczenia Nanieść na kolumnę chromatograficzną określoną objętość przygotowanej próbki Zarejestrować chromatogramy, zidentyfikować piki symazyny, atrazyny i propazyny Odczytać powierzchnie pików symazyny, atrazyny i propazyny OPRACOWANIE WYNIKÓW 1. Wykonać oznaczenie zawartości SYMAZYNY, ATRAZYNY, PROPAZYNY w próbce gleby dostarczonej przez prowadzącego OBOWIĄZUJĄCY ZAKRES MATERIAŁU 1. Pojęcia: układ chromatograficzny - faza stacjonarna, faza ruchoma, substancje rozdzielane 2. Układ faz normalnych i odwróconych podstawowe pojęcia

3. Zjawiska decydujące o rozdzielaniu substancji metodą chromatografii cieczowej. 4. Mechanizmy rozdzielania substancji w chromatografii 5. Podstawowe parametry układu chromatograficznego czas retencji, czas martwy kolumny, objętość retencji, objętość martwa, współczynnik rozdzielenia, wysokość półki teoretycznej, liczba półek teoretycznych 6. Pojęcie selektywności, sprawności i rozdzielczości układu chromatograficznego 7. Metody przygotowania próbek do analizy chromatograficznej: ekstrakcja ciecz-ciecz, ekstrakcja ciecz-ciało stałe, ekstrakcja ciecz-gaz, ekstrakcja nadkrytyczna LITERATURA 1. M. Kamiński (ed.), Chromatografia cieczowa, CEEAM, Gdańsk, 2004., 2. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, Wydawnictwo Naukowo Techniczne, Warszawa, 2004

OZNACZANIE WIELOPIERŚCIENIOWYCH WĘGLOWODORÓW AROMATYCZNYCH (WWA) W PRÓBKACH WODY METODĄ HPLC Z DETEKCJĄ FLUORESCENCYJNĄ PO EKSTRAKCJI CIECZ CIECZ WSTĘP Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) występują prawie we wszystkich rodzajach wód. Związki te są zaadsorbowane na cząstkach stałych (osady, zawiesiny) a także są rozpuszczone w fazie wodnej. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne mają właściwości rakotwórcze lub są o nie podejrzewane. CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest poznanie w praktyce zasad postępowania analitycznego w celu oznaczenia śladowych zawartości nisko polarnych i wysoce hydrofobowych substancji z zastosowaniem ekstrakcji ciecz ciecz, jako techniki przygotowania próbki oraz techniki wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układach faz odwróconych (RP-HPLC) z elucją gradientową i detekcją UV-DAD oraz fluorescencyjną dla rozdzielenia, identyfikacji i ilościowego oznaczenia substancji stanowiących zanieczyszczenia środowiska na przykładzie oznaczania zawartości wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w próbkach wody. ZASADA METODY Zasada postępowania analitycznego w czasie ćwiczenia oparta jest na metodyce opisanej w normie PN-EN ISO 17993 Oznaczanie 15 wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) w wodzie metodą HPLC z detekcją fluorescencyjną po ekstrakcji ciecz-ciecz. Oznaczane składniki analitu (WWA) są ekstrahowane z wody za pomocą n-heksanu. Ekstrakt jest zatężany przez odparowanie n-heksanu a pozostałość rozpuszczana w rozpuszczalniku odpowiednim do wykonania analizy chromatograficznej w warunkach chromatografii w układach faz odwróconych. WWA są rozdzielane z zastosowaniem techniki elucji gradientowej. Identyfikacja i oznaczenie ilościowe są wykonywane za pomocą detekcji UV-VIS/DAD, w przypadku oznaczania szczególnie wysokich zawartości WWA, albo szczególnie wysokiego stopnia wzbogacenia i fluorescencyjnej, w przypadku oznaczania zawartości śladowych. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Do 1000 ml zhomogenizowanej próbki wody dodać 25 ml heksanu i dokładnie wstrząsnąć, mieszać badaną próbkę przez ok. 60 min. Przenieść badaną próbkę do lejka rozdzielczego i odczekać co najmniej 5 min. Na rozdzielenie faz. Warstwę heksanową przenieść do kolby stożkowej i ekstrakt suszyć przez co najmniej 30 min za pomocą bezwodnego siarczanu sodu. Osuszony ekstrakt zdekantować, kolbę przepłukać dwukrotnie porcjami po 5 ml heksanu i dodać je do ekstraktu. Osuszony ekstrakt heksanowy odparować za pomocą wyparki próżniowej na łaźni wodnej o temp. 30 C do momentu gdy ekstrakt pozostanie tylko w zwężonej końcówce naczynia redukcyjnego W celu oczyszczenia ekstraktu dodać 250 ul N, N dimetyloformamidu i zhomogenizować mieszaninę za pomocą 500 ul acetonu

Za pomocą strumienia azotu usunąć całkowicie heksan i aceton, tak aby objętość ekstraktu zmniejszyła się i wynosiła między 200 a 250 ul Rozcieńczyć ekstrakt do znanej objętości (np. 500 ul) za pomocą acetonitrylu. Do kolejnego oczyszczania ekstraktu użyć kolumienek zawierających co najmniej 0,5 g żelu krzemionkowego Żel krzemionkowy w kolumience przemyć mieszaniną dichlorometan/heksan (1:1) o objętości pięciokrotnie wyższej niż objętość złoża, następnie kondycjonować kolumienkę taką samą objętością heksanu. Za pomocą pipety Pasteura przenieść ekstrakt heksanowy na szczyt kolumienki i pozwolić mu prawie całkowicie wniknąć w złoże żelu. Frakcję zawierającą WWA eluować z kolumny za pomocą mieszaniny dichlorometan : heksan (1:1) (co najmniej 3 ml) Do eluatu dodać 250 ul N, N dimetyloformamidu, zhomogenizować przez wytrząsanie i zatężyć do objętości między 200 a 250ul (do ok. 2 ml za pomocą wyparki próżniowej a następnie w strumieniu azotu) Rozcieńczyć ekstrakt do ok. 2 ml za pomocą acetonitrylu Tak przygotowaną próbkę poddać analizie chromatograficznej WYKONANIE OZNACZENIE 1. Warunki analizy chromatograficznej Natężenie przepływu fazy ruchomej ok. 0,5 ml / min Temperatura pokojowa Kolumna: wypełnienie: LiChrospher 100 C18 5 um, wymiary: 250 x 4 mm Eluent: A: acetonitryl, B: woda; Program elucji gradientowej: Czas [min.] 0 35 45 Program elucji: 60:40(A:B v/v) do 100 B (liniowo) 100 B (izokratycznie) Detektor UV-VIS typu DAD (z tablicą elementów fotoczułych) i szeregowo przyłączony detektor fluorescencyjny: długość fali wzbudzenia: 270 nm; długość fali emisji: 400 nm 2. Wzorcowanie Sporządzić roztwory standardów wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w acetonitrylu (stężenie roztworu powinno wynosić ok. 10 ug/ml każdego składnika) Tak przygotowany roztwór rozcieńczyć 10 -, 30 -, 50 krotnie. Po ustaleniu warunków oznaczania dozować do kolumny kolejno roztwory wzorcowe WWA o wzrastającym stężeniu wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych; Zarejestrować chromatogramy z zastosowaniem obu detektorów i odczytać wartości czasu retencji oraz powierzchnię piku każdego wzorca.

Rys. 1 Przykład chromatogramu przedstawiający rozdzielenie WWA znajdowanych w wodzie do spożycia, detektor fluorescencyjny dług. fali wzb. 270 nm, długość fali emisji 400nm. 3. Wykonanie oznaczenia Po ustabilizowaniu warunków oznaczania, identycznych jak te, które stosowano podczas wzorcowania, dozować do kolumny roztwór przygotowanej wcześniej próbki OPRACOWANIE WYNIKÓW Zidentyfikować poszczególne substancje i odpowiadające im piki chromatogramu na podstawie widm w świetle UV w zakresie 200 do 400 nm Sporządzić wykres zależności stężenia substancji w próbce dozowanej do kolumny od powierzchni piku dla każdego wzorca wielopierścieniowych węglowodoru aromatycznych Na postawie uzyskanych krzywych kalibracyjnych wyznaczyć zawartość poszczególnych WWA w próbkach wody wyrażoną w ug/ml OBOWIĄZUJACY ZAKRES MATERIAŁU TEORETYCZNEGO 8. Pojęcia układu chromatograficznego: faza stacjonarna, faza ruchoma, substancje rozdzielane, retencja, selektywność, sprawność, rozdzielczość pików; 9. Konkurencja oddziaływań sorpcyjnych / zróżnicowanie potencjałów termodynamicznych / zróżnicowanie szybkości dyfuzji jako mechanizmy rozdzielania chromatograficznego;

10. Układ faz normalnych / układ faz odwróconych - zjawiska i mechanizmy fiykochemiczne decydujące o retencji i selektywności: - Zjawiska decydujące o rozdzielaniu substancji w chromatografii cieczowej w układach faz odwróconych (RP), - Zjawiska decydujące o rozdzielaniu substancji w chromatografii cieczowej w układach faz normalnych (NP); 4. Pojęcie selektywności, sprawności i rozdzielczości układu chromatograficznego; 5. Podstawowe parametry układu chromatograficznego czas retencji, czas martwy, objętość retencji, objętość martwa, współczynnik retencji, współczynnik rozdzielenia, wysokość półki teoretycznej, liczba półek teoretycznych, prędkość przepływu eluentu, zredukowane parametry sprawności i prędkości przepływu; 6. Elucja gradientowa Co oznacza to pojęcie? Jaki jest cel stosowania elucji gradientowej? Podstawowe parametry programu elucji gradientowej; Wpływ parametrów programu elucji na wyniki rozdzielania; Na czym polega postępowanie w celu doboru optymalnego programu elucji; LITERATURA 3. M. Kamiński (ed.), Chromatografia cieczowa, CEEAM, Gdańsk, 2004., 4. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, Wydawnictwo Naukowo Techniczne, Warszawa 2004., 5. PN-EN ISO 17993 Oznaczanie 15 wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) w wodzie metodą HPLC z detekcją fluorescencyjną po ekstrakcji ciecz-ciecz

Instrukcja ćwiczenia laboratoryjnego Analityka zanieczyszczeń środowiska OZNACZANIE PRODUKTÓW FARMACEUTYCZNYCH W PRÓBKACH STAŁYCH Z WYKORZYSTANIEM PRZYSPIESZONEJ EKSTRAKCJI ZA POMOCĄ ROZPUSZCZALNIKA (ASE) I OZNACZENIEM KOŃCOWYM TECHNIKĄ HPLC DAD WSTĘP Postęp cywilizacyjny jest nieodłącznie związany ze wzrostem ilości chorób, które dręczą ludzkość. Stanowi to siłę napędową działań w zakresie ciągłego unowocześniania leków już dostępnych na rynku oraz projektowania i wdrażania do produkcji nowych preparatów. Jednak przemysł farmaceutyczny zajmuje się wytwarzaniem, nie tylko leków przeznaczonych dla ludzi, ale także dla zwierząt. Jedną z grupy takich leków są leki kokcydiostatyczne, stosowane jako dodatki paszowe. Kokcydiostatyki są to substancje stosowane w profilaktyce kokcydiozy, pasożytniczej choroby układu pokarmowego, występującej wśród drobiu, królików, szynszyli i innych zwierząt hodowlanych. Za zastosowaniem tej grupy związków przemawia fakt, że należą one do substancji charakteryzujących się m.in.: brakiem toksycznego wpływu na zwierzęta, szybką eliminacją z organizmu (krótki czas retencji) oraz stabilnością podczas produkcji mieszanek paszowych ich magazynowania. Stosowanie kokcydiostatyków jak i innych środków leczniczych nie pozostaje jednak bez wpływu na skład chemiczny żywności, a tym samym zdrowie człowieka, stąd też Dyrektyw Unii Europejskiej nakładają na producentów konieczność kontroli zawartości wszystkich dodatków stosowanych przy ich produkcji. Wynikiem tych działań jest opracowywanie wielu metodyk oznaczania produktów farmaceutycznych w próbkach środowiskowych. Jedną z nich jest metodyka oznaczania Robenidyny w próbkach pasz zwierzęcych, która wykonywana będzie na ćwiczeniu. H H N N N N Cl NH Cl CEL ĆWICZENIA Rys. 1 Wzór strukturalny Robenidyny Celem ćwiczenia jest poznanie zasad postępowania analitycznego w celu przygotowania próbki i wykorzystania techniki HPLC do oznaczania zawartości dodatków do pasz i żywności na przykładzie Robenidyny. ZASADA METODY Robenidyna (ROB) obecna w próbce paszy ekstrahowana jest z niej za pomocą metanolu zakwaszonego CH 3 COOH. Następnie ekstrakt jest oczyszczany z zastosowaniem techniki SPE (kolumienek Pasteura wypełnionych Al 2 O 3 ). Robeniyna wymywana jest z kolumienek za pomocą metanolu cz.d.a. Identyfikację i oznaczanie ilościowe jest wykonane z zastosowaniem Wysokosprawnej Chromatografii Cieczowej z detektorem UV typu DAD.

WYKONANIE ĆWICZENIA Przygotowanie krzywej kalibracyjnej Dozować kolejno roztwory wzorcowe o określonych stężeniach (0,21µg/ml, 0,51 µg/ml, 0,62 µg/ml). Wyznaczyć zależność: pole powierzchni w funkcji stężenia robenidyny w próbce. Warunki rozdzielania i detekcji robenidyny Kolumna: Purospher ODS RP-18e (125 x 3 mm i.d., 5 µm) Natężenie przepływ eluentu: 0,7 ml/min Faza ruchoma: warunki izokratyczne (70% metanol, 30% woda z dodatkiem 0,1 % v/v kwasu triflorooctowego) Detektor: DAD, 317 nm Przygotowanie próbek do ekstrakcji Paszę w postaci granulowanej zmielić na drobną frakcję (średnica cząstek 1, 0 mm). Około 8g zmielonej paszy zmieszać z ok. 8 g piasku kwarcowego, umieścić w naczyniu do przyspieszonej ekstrakcji za pomocą rozpuszczalnika (ASE) o pojemności 22 ml i przeprowadzić ekstrakcję w podwyższonej temperaturze i w podwyższonym ciśnieniu, w wybranym medium ekstrakcyjnym. Parametry ekstrakcji ASE przedstawiono w tabeli 1 Tabela 1 Warunki ekstrakcji ASE robenidyny z paszy Parametry ekstrakcji ASE Wartość zadana Czas ekstrakcji statycznej [min] 3 Temperatura [ o C] 100 Ciśnienie [psi] 1500 Ilość cykli ekstrakcyjnych 3 Objętość rozpuszczalnika do płukania [%] 100 Czas płukania azotem [s] 60 Rozpuszczalnik MeOH + 1%CH 3 COOH 1 psi = 6,8948 kpa Uzyskany ekstrakt zebrać w naczyniu, w którym było sito molekularne typu 5A, stosowane jako środek osuszający (5g). Po około 5 minutach wytrząsania pobrać z naczynia 2 ml ekstraktu i poddać go oczyszczeniu na kolumience wypełnionej 1g Al 2 O 3. Robenidynę wyeluować przy użyciu 10 ml metanolu, eluat zebrać do kolby miarowej. Tak uzyskany ekstrakt poddać analizie chromatograficznej (RP HPLC DAD). OBLICZYĆ Efektywność ekstrakcji dla próbek bez ROB z dodatkiem wzorca z paszy. Odzysk Robenidyny z próbek pasz zwierzęcych, (w których zawartość Robenidyny jest podana przez producenta). OBOWIĄZUJĄCY ZAKRES MATERIAŁU TEORETYCZNEGO Znajomość technik ekstrakcji próbek stałych, ich wad i zalet, możliwość stosowania. Chromatografia cieczowa w układzie faz odwróconych (schemat blokowy chromatografu, pojecie selektywności, sprawności i rozdzielczości układu chromatograficznego, detekcja oraz oznaczanie ilościowe w HPLC)

LITERATURA M. Kamiński, Chromatografia Cieczowa, CEEAM, Gdańsk 2004. J. Namieśnik, Z. Jamrógiewicz, M. Pilarczyk, L. Torres, Przygotowanie próbek środowiskowych do analizy, WNT, Warszawa 2002