ukry proste i złożone Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych - α-naftol T - etanol 96% F - kwas siarkowy - benzydyna T, N, R/M1 - kwas octowy - kwas solny - odczynniki Fehlinga I N - odczynniki Fehlinga II - odczynnik Nylandera - rezorcyna Xn, N - odczynnik Benedicta Xn - kwas siarkowy - kwas solny ukry proste (monosacharydy, jednocukry) to najprostsze węglowodany. Są one syntetyzowane w organizmach samożywnych w procesie fotosyntezy i chemosyntezy. Ich nazewnictwo chemiczne opiera się na ilości atomów węgla w cząsteczce, których może być od 3 do 7. Stąd mówimy o triozach posiadających 3 atomy węgla i konsekwentnie o tetrozach, pentozach (zwyczajowe nazwy: arabinoza, ksyloza, ryboza), heksozach (zwyczajowo: glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza) i heptozach, które mają odpowiednio 4, 5, 6 i 7 atomów węgla. gólny, sumaryczny wzór cząsteczki monosacharydu to n 2n n. Ze względu na klasyfikacje chemiczną monocukry należą do polihydroksyketonów lub polihydroksyaldehydów, w zależności od występującej w cząsteczce grupy ketonowej lub aldehydowej. harakterystyczna jest także obecność w cząsteczce cukru asymetrycznych atomów węgla, które połączone z 4 rożnymi podstawnikami, tworzą tzw. centra chiralności. Efektem tego jest występowanie cząsteczek cukrów w formach stereoizomerów. harakterystyka fizykochemiczna: monosacharydy są substancjami krystalicznymi, bez zapachu, o słodkim smaku. Dobrze rozpuszczają się w wodzie a słabo w alkoholu etylowym. Dają reakcje właściwe aldehydom i ketonom, np. redukują odczynniki Tollensa i Fehlinga, utleniając się do kwasów aldonowych (D-glukoza do kwasu D-glukonowego), redukowane tworzą alditole (np. D-glukoza sorbitol), z alkoholami lub fenolami tworzą glikozydy, a z innymi cząsteczkami sacharydów di-, oligo- lub polisacharydy; monosacharydy ulegają także reakcjom właściwym alkoholom tworzą estry z kwasami (np. glukozo-6- fosforan), utleniają się do kwasu uronowego (np. kwas glukuronowy). Wchodzą także w skład glikolipidów, glikoprotein oraz kwasów nukleinowych. ząsteczki cukrów złożonych są budowane z 2 lub więcej cząsteczek monosacharydów połączonych wiązaniami glikozydowymi. W zależności od ilości budujących je jednostek cukrowych mówi się o: oligosacharydach zbudowane z 2-10 monosacharydów (pośród nich wyróżnia się disacharydy zbudowane z dwóch monosacharydów) oraz polisacharydach zbudowane z ponad 10 monosacharydów. ząsteczki polisacharydów mogą być proste lub rozgałęzione. Poszczególne jednostki cukrowe połączone są w łańcuchu głównym wiązaniami typu α(1-4)- lub β(1-4)-glikozydowego a rozgałęzienia powstają przez tworzenie wiązań α(1-6)-glikozydowych. Podczas hydrolizy wielocukry rozpadają się na prostsze jednostki cukrowe np. dekstryny (rozpad skrobi) lub celobiozę (hydroliza celulozy) a ostatecznie na cukry proste. Skrobia jest powszechnym materiałem zapasowym w komórkach roślinnych i dobrym źródłem energii dla organizmów zwierzęcych. Jest polisacharydem nie rozpuszczalnym w wodzie. Skrobia zawieszona w wodzie po podgrzaniu pęcznieje a jej ziarna ulegają rozpadowi na rozpuszczalną w wodzie amylozę i nierozpuszczalną amylopektynę, która w tych warunkach pęcznieje, co decyduje o kleistej konsystencji roztworu. Skrobia ulega hydrolizie pod wpływem stężonych kwasów natomiast w organizmach żywych za rozpad ten prowadzą amylazy enzymy z klasy hydrolaz. Rozróżnia się 2 typy amylaz: endo- i egzoamylazy. Do endoamylaz należy α-amylaza (4-glukohydrolaza α1,4-glukanu), która rozcina cząsteczkę skrobi wewnątrz łańcucha tworząc cząsteczki o krótszych łańcuchach, tzw. dekstryny. Jedną z egzoamylaz jest β-amylaza, odcinająca od nieredukującego końca łańcucha skrobi cząsteczki maltozy. Literatura: Biochemia J. Berg, J. Tymoczko, L. Stryer, PWN, 2005 Biochemia arpera R.K. Murray i in., Wydanictwo Lekarskie PZWL, 2006 Analiza jakościowa monosacharydów 1. Reakcje kondensacji Pod wpływem stężonych kwasów nieorganicznych cukry ulegają dehydratacji z utworzeniem pochodnych furfuralowych, przy czym heksozy tworzą 5-hydroksymetylenofurfural, a pentozy furfural. Powstałe związki kondensują z fenolami, chinonami czy aminami aromatycznymi tworząc połączenia 1
triarylometanowe o charakterystycznym zabarwieniu. Reakcje te są wykorzystywane do identyfikacji, różnicowania i oznaczeń ilościowych cukrów. Dehydratacja (lub 2 ) (lub 2 ) - 3 2 pentoza (lub heksoza) furfural (lub 5-hydroksymetylenofurfural) 1.1 Reakcja Molischa (kondensacja z fenolem) Jest to najbardziej ogólna reakcja wykrywająca cukry i to zarówno te wolne jak i związane. Jest jednak mało specyficzna, gdyż jej dodatni wynik może również świadczyć o obecności aldehydów i ketonów. odczynniki: 1% glukoza, 20% α-naftol w 95% etanolu (przechowywać w ciemności w temp. pokojowej), stęż. 2 S 4 sprzęt: 1 probówka szklana długa, pipeta szklana, pipety automatyczne, worteks wykonanie: do 1 ml roztworu glukozy dodać 0,5 ml świeżo przygotowanego roztworu α-naftolu i wymieszać. Następnie podwarstwić 1 ml stężonego 2 S 4, nie mieszać (do pipetowania stężonego 2 S 4 używać szklanej pipety Pasteur a). Na granicy faz pojawia się fiołkowomalinowe zabarwienie. 1.2 Reakcja Taubera (kondensacja z benzydyną aminą aromatyczną) odczynniki: 0,5% arabinoza, 1% glukoza, 4% benzydyna w lodowatym kwasie octowym sprzęt: 2 probówki szklane długie, pipety automatyczne, worteks wykonanie: do dwóch probówek odpipetować po 0,5 ml roztworu benzydyny. Do jednej probówki dodać 1 ml roztworu arabinozy, a do drugiej 1 ml roztworu glukozy, wymieszać i ogrzewać do wrzenia. Pentozy w tych warunkach dają zabarwienie czerwone, a heksozy żółte lub brunatne. 1.3 Reakcja Seliwanowa (kondensacja z rezorcyną fenodiol) Pozwala na odróżnienie aldoz od ketoz. Ważne jest zachowanie odpowiednich warunków reakcji, tzn.: stężenie użytego kwasu solnego powinno wynosić 12% a czas ogrzewania - 30 sekund. W tych warunkach ketozy przechodzą w hydroksymetylenofurfural, natomiast aldozy pozostają niezmienione. Jeżeli użyje się bardziej stężonego kwasu lub wydłuży czas ogrzewania, to wówczas aldozy również ulegają dehydratacji i dają odczyn dodatni pojawia się czerwono-wiśniowe zabarwienie. odczynniki: 0,5% fruktoza, 1% glukoza, stężony l, rezorcyna kryst sprzęt: 3 probówki szklane długie, pipety automatyczne, łaźnia wodna, szpatułka, stoper, worteks wykonanie: do pierwszej probówki odpipetowć 1 ml roztworu fruktozy, a do drugiej i trzeciej probówki po 1 ml roztworu glukozy. Do wszystkich probówek dodać po 0,5 ml stężonego l (otrzymuje się roztwór o stężeniu 12%), ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej, a następnie probówki pierwszą i drugą utrzymywać we wrzeniu przez 30 sekund, natomiast probówkę trzecią utrzymywać we wrzeniu przez 3 min. Mieszaniny ostudzić, dodać kilka kryształków rezorcyny i ogrzać do wrzenia w łaźni wodnej. Porównać wyniki dla obu roztworów cukrów. 2 rezorcyna lub ( 2 ) furfural lub hydroksymetylenofurfural lub ( 2 ) czerwonowisniowy 2
2. Właściwości redukcyjne cukrów 2.1 Próba Trommera W próbie Trommera, w środowisku alkalizowanym Na i w obecności us 4 glukoza ulega utlenieniu do kwasu glukonowego, a jony miedzi ulegają redukcji z u 2 do u i powstaje brunatno zabarwiony osad tlenku miedzi. odczynniki: 1% glukoza, 0,5% fruktoza, 2M Na, 0,25M us 4 sprzęt: 2 długie probówki, łaźnia wodna, pipety automatyczne wykonanie: do jednej probówki odmierzyć 1 ml 1% roztworu glukozy a do drugiej - 1 ml 0,5% roztworu fruktozy. Do obu probówek dodać po 1 ml 2M Na, a następnie kroplami dodawać 0,25M us 4 jednocześnie ostrożnie mieszając zawartość obu probówek. Zakończyć dodawanie us 4 w momencie pojawienia się osadu w probówce. bie probówki ogrzewać do wrzenia. Zaobserwować powstający na dnie probówki brunatnoczerwony osad. 2.2 dczyn Fehlinga W odczynie Fehlinga redukcji ulegają jony miedzi z u 2 do u. Używa się odczynnika Fehlinga I, który zawiera us 4 oraz odczynnika Fehlinga II, który zawiera Na i winian sodowo-potasowy. Winian sodowo-potasowy zapobiega wytrącaniu się osadu u() 2, co może mieć miejsce przy małym stężeniu cukru. Sól ta wiąże jony u 2 tworząc kompleksową sól kwasu winowego. odczynniki: 1% glukoza, 0,5% fruktoza, odczynnik Fehlinga I i II sprzęt: 2 długie probówki, palnik, worteks, pipety automatyczne wykonanie: w jednej probówce zmieszać 1 ml odczynnika Fehlinga I i 1 ml odczynnika Fehlinga II. Do drugiej i trzeciej probówki dodać po 1 ml roztworu glukozy i fruktozy. Zawartość wszystkich probówek ogrzewać do wrzenia. Do obu probówek zawierających cukier dodać po 1 ml odczynnika Fehlinga. Występuje zabarwienie lub brunatnoczerwony osad wydzielonego u 2. us 4 2Na u() 2 Na 2 S 4 N a N a u u 2 2 K K N a N a K u R 2 R K u 2 c z e rw o n y o s a d 2.3 dczyn Nylandera dczynnik Nylandera zawiera zasadowy azotan bizmutu, K i winian sodowo-potasowy, który spełnia tu tę samą rolę, co w odczynie Felinga i co cytrynian w odczynie Benedicta. Pod wpływem cukrów redukcji ulega Bi 3 do Bi 0. odczynniki: 1% glukoza, odczynnik Nylandera sprzęt: probówka szklana długa, łaźnia wodna, worteks, pipety automatyczne wykonanie: do 1 ml 1% roztworu glukozy dodać kilka kropel odczynnika Nylandera, wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Wytrąca się czarny osad metalicznego bizmutu Bi() 2 N 3 K Bi() 3 KN 3 Bi() 3 Bi 3 3-3
3 R glukoza 2 Bi() 3 winian 3 2 Bi 0 3 2 Na-K R czarny osad kwas glukonowy znaczanie ilościowe monocukrów Metoda antronowa Jest to kolorymetryczna metoda oznaczania zawartości cukru w roztworze wykorzystująca powstawanie kompleksów pomiędzy furfuralowymi i hydroksymetylenofurfuralowymi pochodnymi cukrów a antronem. Powstający kompleks o barwie niebiesko-zielonej ma maksimum absorpcji przy długości fali 600 nm. Jest to metoda niestechiometryczna więc wymaga sporządzenia krzywej kalibracyjnej. 2 lu b ( 2 ) an tro n fu rfu ra l lu b h yd roksym etyleno furfu ra l zielon o n iebieski lu b ( 2 ) Di- i polisacharydy - analiza jakościowa 1. dczyn Benedicta W odczynie Benedicta redukcji ulegają jony miedzi z u 2 do u. dczynnik Benedicta zawiera us 4, cytrynian trisodowy i Na 2 3. ytrynian zapobiega wytrącaniu się osadu u() 2, co może mieć miejsce przy małym stężeniu cukru. Zalkalizowanie za pomocą Na 2 3, a nie za pomocą Na powoduje, że reakcja przebiega w p nieco niższym niż w próbie Fehlinga, w związku z tym jony u 2 nie są w tych warunkach redukowane przez szereg związków dających dodatni odczyn Fehlinga (kreatynina, kwas moczowy). Reakcja Benedicta jest więc bardziej specyficzna dla cukrów niż odczyn Fehlinga. odczynniki: 0,5% glukoza, 0,5% maltoza, 0,5% laktoza, 0,5% sacharoza, odczynnik Benedicta. sprzęt: 4 probówki szklane długie, łaźnia wodna, worteks, stoper, pipety automatyczne wykonanie: do czterech probówek odpipetować po 0,25 ml odczynnika Benedicta. Do każdej z nich dodać po kilka kropli odpowiedniego roztworu cukru, wymieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 3-5 min. Po oziębieniu wytrąca się pomarańczowoczerwony osad u 2. 2. ydroliza sacharozy Sacharoza jest disacharydem składa się z cząsteczki α-glukopiranozy i cząsteczki β-fruktofuranozy. Pod wpływem kationów i podwyższonej temperatury sacharoza rozpada się na monosacharydy (glukozę i fruktozę) odczynniki: 0,5% sacharoza, 2 M l, 2 M Na sprzęt: 3 probówki szklane, łaźnia wodna, worteks, stoper, pipety automatyczne wykonanie: w probówce umieścić 1,5 ml roztworu sacharozy, dodać 0,45 ml 2M roztworu l, wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 10 min. Po ochłodzeniu zobojętnić dodając 0,6 ml 2 M roztworu Na. Na zobojętnionym hydrolizacie przeprowadzić reakcje Benedicta i Seliwanowa. 4
3. Analiza jakościowa polisacharydów (reakcja z jodem) Skrobia składa się z dwóch wielocukrów: amylozy i amylopektyny, które są zbudowane z połączonych reszt α-d-glukopiranozy. Amyloza tworzy łańcuchy proste, w których cząsteczki glukozy połączone są ze sobą wiązaniem α(1-4)-glikozydowym. Natomiast amylopektyna charakteryzuje się budową rozgałęzioną; oprócz wiązania α(1-4) co 25-30 reszt glukozowych w głównym lańcuchu występują wiązania α(1-6), tworzące punkty rozgałęzienia. W tych miejscach formują się łańcuchy boczne zbudowane z 30-50 reszt glukozowych. Z budowy wynikają odmienne właściwości fizyczne obu wielocukrów. Amyloza barwi się jodem na kolor niebieski, a amylopektyna na fioletowy. Amyloza o konfiguracji liniowej nie jest zdolna do tworzenia kompleksów z jodem. Aby cząsteczki jodu mogły się wiązać z cząsteczką wielocukru musi ona przyjąć konfigurację helisy, w której cząsteczki jodu regularnie się rozłożą. Jedna cząsteczka jodu przypada wówczas na sześć reszt glukozowych, czyli na jeden skręt helisy. Glikogen podobnie jak skrobia zbudowany jest z α-d-glukopiranozy. W porównaniu ze skrobią składa się on z większej liczby monomerów i tworzy bardziej rozgałęzioną helisę. Rozgałęzienia występują w łańcuchu przeciętnie, co dziesięć reszt glukozowych i zbudowane są z 10 20 monomerów glukozy. Skrobia tworzy z jodem połączenie fioletowo-niebieskie, zaś w przypadku glikogenu barwa pozostaje brunatna. odczynniki: 1% kleik skrobiowy, 1% glikogen, płyn Lugola sprzęt: 2 probówki długie, pipety automatyczne wykonanie: do jednej probówki wlać 0,5 ml roztworu skrobi, a do drugiej 0,5 ml roztworu glikogenu. Do obu probówek dodać po 1 kropli silnie rozcieńczonego roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola barwa słomkowa) 4. Wpływ temperatury na reakcję skrobi i glikogenu z jodem Barwa skrobi i glikogenu z jodem jest trwała w temperaturze pokojowej. grzewanie powoduje rozkręcenie się heliksu, adsorpcja jodu nie jest możliwa, w efekcie zabarwienie znika. Jest to zjawisko odwracane. sprzęt: łaźnia wodna wykonanie: probówki z poprzedniego ćwiczenia zawierające skrobię i glikogen, zabarwione jodem, ogrzać do wrzenia. Barwa zanika. Powraca ona po natychmiastowym oziębieniu probówek w strumieniu zimnej wody. 5. Kwaśna hydroliza skrobi Podczas hydrolizy skrobia ulega rozpadowi na prostsze cukrowce, wśród których można wyróżnić następujące stadia pośrednie: a) stadium dekstryn (polisacharydy), wśród których wyróżnia się kolejno: amylodekstryny barwiace się jodem na kolor niebiesko-fioletowy, erytrodekstryny barwiące się jodem na kolor brunatnoczerwony, achrodekstryny nie dające z jodem zabarwienia b) stadium maltozy i izomaltozy (disacharydy) c) stadium glukozy (monosacharyd) odczynniki: płyn Lugola, odczynnik Benedicta, 2 M Na, 1% kleik skrobiowy, 1 M 2 S 4, sprzęt: 20 probówek szklanych długich, statyw, erlenmayerka, cylinder miarowy, łaźnia wodna, pipety, stoper wykonanie: przygotować 20 probówek, ustawiając je w statywie w dwóch szeregach. Do jednego szeregu probówek dodać do każdej po 5 kropli rozcieńczonego roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola), a do drugiego szeregu po 0,75 ml 2 M roztworu Na. Do erlenmayerki odmierzyć 15 ml 1% roztworu kleiku skrobiowego i dodać 10 ml 1 M 2 S 4 ; wymieszać i pobrać 1 ml płynu do pierwszej probówki z płynem Lugola i 1 ml płynu do pierwszej probówki z roztworem Na. Zawartość erlenmayerki ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej; co 2 minuty pobierać po 1 ml płynu i rozlewać do uprzednio przygotowanych probówek, zawierających płyn Lugola i roztwór Na. ydrolizę prowadzić do czasu aż barwa z jodem zaniknie. Do szeregu probówek z roztworem Na dodać po 0,5 ml odczynnika Benedicta i gotować przez 2,5 min w łaźni wodnej. bserwując zmiany barwy wyróżnić stadia hydrolizy skrobi. kreślić etap, w którym pojawiają się cukry redukujące. 5
6. Badanie aktywności α-amylazy śliny α-amylaza śliny prowadzi reakcję rozpadu skrobi na dekstryny, podobnie jak ma to miejsce w przypadku kwaśnej hydrolizy. W efekcie tego w roztworze nie powstają niebiesko zabarwione kompleksy skrobi z jodem. 6.1 Wpływ temperatury odczynniki: płyn Lugola, 1% kleik skrobiowy sprzęt: 4 probówki szklane krótkie, 3 probówki wirownicze na 2 ml, statyw, zlewka, mieszadło magnetyczne, łaźnia wodna, pipety, stoper wykonanie: Roztwór amylazy śliny: wodę podgrzać do temperatury 40 w łaźni wodnej. Tak przygotowaną wodą wstępnie przepłukać usta, a następnie pobrać kilka mililitrów wody do ust i płukać nimi usta przez kilka minut. Roztwór śliny wypluć do zlewki. znaczanie aktywności: do probówki odebrać 3 ml uprzednio przygotowanego roztworu amylazy śliny i ogrzewać przez 10 min we wrzącej łaźni wodnej. Następnie do trzech probówek odmierzyć po 1 ml 1% zawiesiny skrobi (stale mieszającej się na mieszadle magnetycznym). Do pierwszej probówki dodać 1 ml wyjściowego roztworu amylazy, do drugiej 1 ml ogrzewanego roztwór amylazy, a do trzeciej kilka kropel wody. Prowadzić inkubację przez 15 min w temperaturze 38, w łaźni wodnej. Następnie probówki ostudzić w zlewce z zimną wodą i do wszystkich dodać po kropli roztworu jodu w postaci płynu Lugola. Zawartość probówek przenieść do probówek wirowniczych na 2 ml i zwirować przez 3 min. Porównać ilość otrzymanego osadu i wyciągnąć wnioski o aktywności amylazy w poszczególnych próbkach. 6.2 Specyficzność substratowa odczynniki: 1% kleik skrobiowy, 1% sacharoza sprzęt: 3 probówki szklane krótkie, statyw, zlewka, mieszadło magnetyczne, łaźnia wodna, pipety, stoper wykonanie: do dwóch probówek odmierzyć po 1ml roztworu amylazy śliny. Do jednej dodać 1 ml 1% zawiesiny skrobi (stale mieszającej się na mieszadle magnetycznym), do drugiej 1 ml 1% roztworu sacharozy. ałość inkubować przez 15 min w temperaturze 38, w łaźni wodnej. Następnie probówki ostudzić i na obu roztworach przeprowadzić reakcję Trommera (patrz instr. ukry proste). 7. Reakcja celulozy z jodem Zwarta struktura włókien celulozowych uniemożliwia trwałą adsorpcję jodu. Pod wpływem jodu pierwiastkowego włókna celulozowe barwią się na kolor żółtobrunatny, natomiast silnie pęcznieją w obecności kwasu siarkowego, co umożliwia wnikanie drobin jodu do wnętrza i jego adsorpcję na cząsteczkach celulozy. Powstaje wówczas intensywna barwa niebieska. odczynniki: 2 dest., 60% 2 S 4, płyn Lugola, lignina sprzęt: 2 szkiełka zegarkowe, pipety automatyczne, stoper wykonanie: na dwóch szkiełkach zegarkowych umieścić skrawki ligniny. Jeden z nich zwilżyć 1 ml wody destylowanej, a drugi 1 ml 60% roztworu 2 S 4. Po upływie 2 minut oba skrawki zabarwić płynem Lugola. dczynniki: 0,5% arabinoza, 0,5% fruktoza, 1% glukoza, 0,25M us 4, 2M Na, 4% benzydyna w lodowatym kwasie octowym, 20% α-naftol w 95% etanolu, stężony 2 S 4, stężony l, rezorcyna kryst., odczynnik Fehlinga I i II, odczynnik Nylandera, odczynnik antronowy 40 mg antronu w 25 ml stężonego 2 S 4, 0,5% glukoza, 0,5% maltoza, 0,5% laktoza, 0,5% sacharoza, 1% sacharoza, 1% glikogen, 1% kleik skrobiowy, 2 M l, 2 M Na, 0,25 M us 4, 1 M 2 S 4, 60% 2 S 4, płyn Lugola, odczynnik Benedicta. 6