COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test

COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVCAP 72 Tests P/N: 04902068 190 CMV Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: 03587797 190 Wash Reagent ZASTOSOWANIE Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV jest testem in vitro opartym na amplifikacji kwasu nukleinowego, służącym do ilościowego oznaczania DNA wirusa cytomegalii w ludzkim osoczu z EDTA, wykorzystującym aparat COBAS AmpliPrep do automatycznego przetwarzania próbek oraz analizator COBAS TaqMan lub COBAS TaqMan 48 do automatycznej amplifikacji i detekcji. Za pomocą testu można dokonywać oceny ilościowej DNA CMV w zakresie stężenia 150 10 000 000 kopii/ml. Jedna kopia DNA CMV (określonego na podstawie testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV) odpowiada 0,91 jednostki międzynarodowej (IU) [1,1 kp/iu] według pierwszego międzynarodowego standardu WHO dla ludzkiego wirusa cytomegalii dla technologii opartych na amplifikacji kwasów nukleinowych (NIBSC 09/162) 40. Test ten, łącznie z objawami klinicznymi i innymi markerami laboratoryjnymi, znajduje zastosowanie w diagnozie i leczeniu zakażenia CMV u pacjentów, u których CMV stanowi zagrożenie. Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV nie jest przeznaczony do przesiewowego badania na obecność wirusa CMV we krwi lub produktach krwiopochodnych ani do stosowania jako test diagnostyczny potwierdzający zakażenie wirusem CMV. Wyniki uzyskane za pomocą testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV należy interpretować w kontekście wszystkich istotnych objawów klinicznych oraz wyników badań laboratoryjnych. PODSUMOWANIE I OBJAŚNIENIE TESTU Ludzki wirus cytomegalii (HCMV lub CMV) jest patogenem należącym do rodziny wirusów Herpes, a jego obecność stwierdzono zarówno w społeczeństwach uprzemysłowionych, jak i w izolowanych grupach plemiennych 1,2. Może być przenoszony przez krew, wydzielinę z górnych dróg oddechowych, mocz, wydzielinę szyjkową i pochwową, płyn nasienny, mleko, łzy oraz kał 3 9. Pierwotne zakażenia CMV u osób z prawidłową odpornością występują zazwyczaj bezobjawowo i często prowadzą do niewykrytych utajonych zakażeń. Najczęstszymi miejscami zakażenia są komórki jednojądrzaste krwi obwodowej oraz komórki śródbłonka naczyniowego. U człowieka CMV pozostaje w stanie utajonym w monocytach/makrofagach 2. Osoby z zakażeniem utajonym mogą okresowo wydzielać wirusa do płynów ustrojowych i w ten sposób zarażać innych. Osoby z obniżoną odpornością, w tym niemowlęta, pacjenci po przeszczepach oraz pacjenci z AIDS, należą do grupy wysokiego ryzyka wystąpienia ciężkiego zakażenia CMV, które może prowadzić do podwyższonej zachorowalności i śmiertelności 10. Do poważnych objawów klinicznych choroby wywołanej przez CMV należą: zespół CMV, zapalenie siatkówki, nieżyt żołądkowo-jelitowy, zapalenie wątroby, zapalenie mózgu, zapalenie przełyku, zapalenie jelit, zapalenie trzustki oraz zapalenie płuc 1 13. Do metod laboratoryjnych stosowanych w diagnostyce rozsianego zakażenia oraz aktywnej choroby narządu docelowego spowodowanej przez ludzki wirus cytomegalii należą: wyizolowanie wirusa metodą hodowli z leukocytów krwi obwodowej (ang. peripheral blood leukocytes, PBL), badanie histologiczne bioptatów, metody serologiczne, pomiar antygenu pp65 oraz detekcję DNA CMV przy użyciu łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) 14. Metody oceny hodowli mają małą wartość predykcyjną; wymagają od 48 godzin do 3 tygodni, a ich zastosowanie ograniczone jest do pacjentów z upośledzoną odpornością. Ocena poziomu antygenu pp65 jest pracochłonna i wymaga opracowania próbki krwi w ciągu sześciu godzin od jej pobrania, ponieważ przechowywanie próbki powoduje spadek poziomu antygenu 15,22. Ocena pp65 jest również trudna do przeprowadzenia u pacjentów z ciężką neutropenią. Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu. 04898362049-02PL 1 Doc Rev. 2.0

Wykazano, że dodatnie wyniki DNA CMV w osoczu uzyskane przy użyciu metody PCR dobrze korelują z dodatnim wynikiem w hodowli PBL oraz ze zwiększonym ryzykiem rozwoju systemowej choroby cytomegalowirusowej (CMV). Wiele badań wykazuje związek między wiremią CMV a ryzykiem wystąpienia choroby spowodowanej przez wirusa CMV 16 19. Ryzyko choroby wywołanej przez CMV można w prosty sposób zdefiniować jako znacznego stopnia wiremię, co wskazuje na ważną rolę miana wirusowego w patogenezie choroby 18,27,30,31. Badania przeprowadzone u pacjentów po transplantacji i chorych na AIDS wykazują, że detekcja DNA CMV przy pomocy PCR ma dużą wartość predykcyjną odnośnie do dalszego rozwoju choroby i wystąpienia jej objawów 17,23 26. Badania ilościowe poziomu DNA CMV wykazały, że znacznego stopnia wiremia, jak i narastanie wiremii w czasie są uważane za najgorszy czynnik prognostyczny dla licznych zagrożeń związanych z CMV 18,27,28. Ponadto ilościowe badanie metodą PCR pozwala na monitorowanie efektywności leczenia przeciwwirusowego oraz pośrednio na ocenę oporności wirusa 26,29,30,32. Zaleca się kontrolować wiremię CMV przy ustalaniu bieżących wytycznych terapeutycznych u pacjentów, u których przeprowadzano przeszczep narządu miąższowego, dla oceny ryzyka wystąpienia choroby wywoływanej przez CMV i potrzeby leczenia prewencyjnego, jak również monitorowania odpowiedzi pacjenta z aktywną chorobą wywołaną przez CMV na leczenie 21,22. Zaleca się również taką kontrolę w ramach diagnozowania choroby wywołanej przez CMV u pacjentów po przeszczepie hematopoetycznych komórek macierzystych 33. ZASADY PROCEDURY Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV jest testem amplifikacji kwasu nukleinowego służącym do ilościowego oznaczania DNA wirusa cytomegalii (CMV) w ludzkim osoczu. Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV składa się z dwóch głównych etapów: (1) przygotowania próbki w celu wyizolowania DNA CMV oraz (2) jednoczesnej amplifikacji PCR docelowego DNA i detekcji rozszczepionej, podwójnie znakowanej sondy oligonukleotydowej swoistej dla łańcucha docelowego. Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV umożliwia automatyczne przygotowanie próbki, a następnie automatyczną amplifikację PCR oraz detekcję docelowego DNA CMV i DNA standardu ilościowego CMV (ang. Quantitation Standard, QS). Odczynnik Master Mix zawiera primery i sondy swoiste zarówno dla DNA CMV, jak i DNA CMV QS. Detekcji amplifikowanego DNA dokonuje się przy użyciu swoistych dla sekwencji docelowych oraz swoistych dla standardu QS podwójnie znakowanych sond oligonukleotydowych, pozwalających na niezależną identyfikację amplikonu CMV i amplikonu CMV QS. DNA CMV oznacza się ilościowo za pomocą standardu ilościowego CMV QS. Kompensuje on wpływ hamowania oraz kontroluje proces przygotowywania i amplifikacji, pozwalając uzyskać dokładniejsze oznaczenie ilościowe DNA CMV w każdej próbce. Standard ilościowy CMV QS to niezakaźny konstrukt DNA, zawierający identyczne miejsca wiązania primerów jak docelowy DNA CMV oraz charakterystyczne miejsce wiązania sondy, umożliwiające odróżnienie amplikonu CMV QS od amplikonu CMV. Standard CMV QS jest dodawany do każdej próbki w znanej liczbie kopii i wraz z nią przechodzi przez kolejne etapy procesu przygotowania oraz jednoczesnej amplifikacji PCR i detekcji rozszczepionych, podwójnie znakowanych sond oligonukleotydowych. Analizator COBAS TaqMan lub analizator COBAS TaqMan 48 oblicza stężenie DNA CMV w badanych próbkach przez porównywanie sygnału CMV z sygnałem standardu CMV QS dla każdej próbki i kontroli. Wybór sekwencji docelowej Próbki DNA wirusa CMV oraz DNA standardu CMV QS przygotowuje się przy użyciu techniki wiązania kwasów nukleinowych na krzemionce, a jako primery w procesie amplifikacji DNA wirusa CMV i DNA standardu CMV QS wykorzystywane są określone oligonukleotydy. Podwójnie znakowane sondy oligonukleotydowe swoiste dla sekwencji docelowej oraz swoiste dla standardu QS pozwalają na niezależną identyfikację amplikonów CMV oraz CMV QS. W teście COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV stosuje się dwa primery do reakcji PCR. Generująca sygnał, podwójnie znakowana sonda ulega hybrydyzacji do jednej z dwóch nici i jest rozszczepiana przez polimerazę DNA Z05 podczas wydłużania primerów. 04898362049-02PL 2 Doc Rev. 2.0

Przygotowanie próbki Próbka do testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV jest przygotowywana automatycznie w aparacie COBAS AmpliPrep przy użyciu techniki wiązania kwasów nukleinowych na krzemionce. W procedurze używana jest objętość 500 µl osocza. Cząsteczki wirusa CMV poddawane są lizie poprzez inkubację w podwyższonej temperaturze z proteazą i chaotropowym buforem do lizy/wiążącym, który uwalnia kwasy nukleinowe i chroni uwolniony DNA wirusa CMV przed znajdującymi się w osoczu cząsteczkami DNazy. Do każdej próbki wraz z odczynnikiem lizującym i szklanymi cząstkami magnetycznymi wprowadzana jest proteaza oraz znana liczba cząsteczek DNA standardu CMV QS. Mieszanina poddawana jest następnie inkubacji, a DNA wirusa CMV oraz DNA standardu CMV QS ulegają związaniu na powierzchni szklanych cząstek magnetycznych. Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, ulegają usunięciu poprzez przepłukiwanie szklanych cząsteczek magnetycznych. Po oddzieleniu cząsteczek szkła magnetycznego i zakończeniu procesu przepłukiwania adsorbowane kwasy nukleinowe ulegają wymywaniu przy użyciu roztworu wodnego w podwyższonej temperaturze. Tak przygotowana próbka, zawierająca uwolnione DNA wirusa CMV i DNA standardu CMV QS, jest dodawana do mieszaniny do amplifikacji i umieszczana w analizatorze COBAS TaqMan lub analizatorze COBAS TaqMan 48. Amplifikacja PCR Reakcję amplifikacji PCR przeprowadza się z użyciem termostabilnego, rekombinowanego enzymu polimerazy DNA Z05 Thermus specie (Z05). W obecności jonów magnezu (Mg 2+ ) i w odpowiednich warunkach układu buforowego, Z05 wykazuje aktywność polimerazy DNA 34. Umożliwia to prowadzenie amplifikacji PCR równocześnie z detekcją amplikonu w czasie rzeczywistym. Przetworzone próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (K-tube), gdzie zachodzi amplifikacja PCR. W obecności jonów Mg 2+ i nadmiarze trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów (dntp), do których należą trójfosforany dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny, dezoksyurydyny i dezoksytymidyny, polimeraza Z05 wydłuża przyłączone w wyniku hybrydyzacji primery, tworząc nici DNA. Amplifikacja sekwencji docelowej Zainstalowany w analizatorze COBAS TaqMan lub analizatorze COBAS TaqMan 48 termocykler podgrzewa mieszaninę reakcyjną w celu denaturacji dwuniciowego DNA i odsłonięcia sekwencji docelowych swoistych dla primerów. Podczas schładzania mieszaniny primery hybrydyzują do DNA docelowego. W obecności jonów Mg 2+ i nadmiaru trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów (dntp) Z05 wydłuża przyłączone primery wzdłuż docelowej matrycy, tworząc dwuniciowe cząsteczki DNA, zwane amplikonami. Analizator COBAS TaqMan lub analizator COBAS TaqMan 48 automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich zmierzając do podwojenia ilości amplikonu DNA. Wymagana liczba cykli jest zaprogramowana w analizatorze COBAS TaqMan lub analizatorze COBAS TaqMan 48. Amplifikacja następuje tylko w strefie genomu CMV ograniczonej primerami; nie jest amplifikowany cały genom CMV. Amplifikacja wybiórcza W teście COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV amplifikację wybiórczą docelowego kwasu nukleinowego z próbki osiąga się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) i trójfosforanu dezoksyurydyny (dutp). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA zawierających dezoksyurydynę 35, lecz nie DNA zawierającego dezoksytymidynę. W DNA występującym w naturze nie ma dezoksyurydyny, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie wskutek zastosowania trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego spośród trójfosforanów dezoksyrybonukleotydu (dntp) w odczynniku Master Mix. Dlatego dezoksyurydynę zawiera wyłącznie amplikon. Dezoksyurydyna warunkuje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase niszczy także wszystkie nieswoiste produkty reakcji powstałe po wstępnej aktywacji odczynnika Master Mix przez jony magnezu. Enzym AmpErase zawarty w odczynniku Master Mix katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie łańcucha dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym łańcuch amplikonu DNA pęka w miejscu, gdzie znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Gdy enzym AmpErase zostanie wystawiony na działanie temperatury powyżej 55 C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, ulega inaktywacji i dlatego nie niszczy docelowego amplikonu utworzonego w trakcie amplifikacji. 04898362049-02PL 3 Doc Rev. 2.0

Detekcja produktów reakcji PCR w teście COBAS TaqMan W teście COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV wykorzystano technologię PCR w czasie rzeczywistym 36,37 (ang. real-time PCR). Zastosowanie sond podwójnie znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym pozwala na detekcję w czasie rzeczywistym gromadzenia się produktu reakcji PCR przez monitorowanie intensywności emisji fluorescencyjnych barwników reporterowych uwalnianych w trakcie procesu amplifikacji. Sondy składają się z oligonukleotydów swoistych dla wirusa CMV i standardu CMV QS znakowanych barwnikiem reporterowym i wygaszaczem. W teście COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV sondy dla wirusa CMV i standardu CMV QS są oznakowane różnymi fluorescencyjnymi barwnikami reporterowymi. Gdy sondy są nienaruszone, fluorescencja barwnika reporterowego jest tłumiona bliskością wygaszacza na zasadzie efektu przenoszenia energii typu Förstera. Podczas reakcji PCR sonda ulega hybrydyzacji z sekwencją docelową, a następnie rozszczepieniu pod wpływem posiadanej przez termostabilną polimerazę DNA Z05 aktywności 5' 3' nukleazy. Od chwili uwolnienia i rozdzielenia reportera i wygaszacza nie zachodzi już zjawisko wygaszania, a aktywność fluorescencyjna barwnika reporterowego nasila się. Amplifikację DNA wirusa CMV oraz DNA CMV QS mierzy się niezależnie od siebie, wykorzystując różne długości fal. Proces ten powtarza się przez określoną liczbę cykli, a w każdym cyklu następuje efektywne zwiększenie intensywności emisji poszczególnych barwników reporterowych, umożliwiając niezależną identyfikację DNA wirusa CMV oraz DNA CMV QS. Cykl PCR, w którym krzywa wzrostu rozpoczyna wzrost wykładniczy, jest zależny od ilości materiału startowego na początku reakcji PCR. Podstawy oceny ilościowej w teście COBAS TaqMan Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV zapewnia dokładność wyników oznaczeń ilościowych w bardzo szerokim zakresie dynamiki, ponieważ monitorowanie amplikonu przeprowadza się w trakcie fazy wykładniczej amplifikacji. Im wyższe jest miano wirusa CMV w badanej próbce, tym wcześniej fluorescencja barwnika reporterowego sondy CMV wzrasta powyżej wyjściowego poziomu fluorescencji (patrz rysunek 1). Ponieważ ilość DNA standardu CMV QS jest stała we wszystkich próbkach, fluorescencja barwnika reporterowego sondy CMV QS powinna pojawiać się w każdej próbce po podobnej liczbie cykli (patrz rysunek 2). W próbkach, w których fluorescencja standardu QS jest nieprawidłowa, stężenie jest poddawane odpowiedniej modyfikacji. Pojawienie się swoistych sygnałów fluorescencyjnych jest rejestrowane jako krytyczna wartość progowa (Ct). Wartość Ct definiuje się jako liczbę cykli, po której fluorescencja barwnika reporterowego przekracza ustaloną wcześniej wartość progową (ustalony poziom fluorescencji) i zapoczątkowuje fazę wykładniczego wzrostu siły sygnału (patrz rysunek 3). Większa wartość Ct wskazuje na niższe miano początkowe docelowych sekwencji CMV. Uogólniając, 2-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem wartości Ct docelowego DNA wirusa CMV o 1, natomiast 10-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem Ct o 3,3. Rysunek 1 przedstawia przykładowe krzywe wzrostu dla sekwencji docelowej w serii rozcieńczeń, obejmującej przedział 5-krotnej wartości log 10. W miarę wzrostu stężenia wirusów krzywe wzrostu przesuwają się w kierunku wcześniejszych cykli. Zatem krzywa wzrostu leżąca najdalej na lewo odzwierciedla najwyższy poziom miana wirusa, a krzywa wzrostu leżąca najdalej na prawo oznacza najniższy poziom miana wirusa. 04898362049-02PL 4 Doc Rev. 2.0

Rysunek 1 Krzywe wzrostu dla sekwencji docelowej w serii rozcieńczeń wirusa obejmującej zakres 5-krotnej wartości log 10 Normalizowana fluorescencja Miano najwyższe Miano najniższe Liczba cykli Rysunek 2 przedstawia przykładowe krzywe wzrostu dla standardu Quantitation Standard w próbkach z serią rozcieńczeń wirusa obejmującą zakres 5-krotnej wartości log 10. Ilość dodanego do każdej próbki preparatu Quantitation Standard jest stała dla każdej reakcji. Wartość Ct dla preparatu Quantitation Standard jest podobna niezależnie od miana wirusa. Rysunek 2 Krzywe wzrostu dla standardu ilościowego w serii rozcieńczeń wirusa obejmującej zakres 5-krotnej wartości log 10 Normalizowana fluorescencja Miano najniższe Miano najwyższe Liczba cykli 04898362049-02PL 5 Doc Rev. 2.0

Rysunek 3 przedstawia na przykładzie, w jaki sposób wartości fluorescencji w każdym cyklu są normalizowane dla każdej krzywej wzrostu. Liczbę cykli cząstkowych (Ct) oblicza się w chwili, gdy sygnał fluorescencyjny przekracza ustalony poziom fluorescencji. Rysunek 3 Wartości fluorescencji w każdym cyklu są normalizowane dla każdej krzywej wzrostu Normalizowana fluorescencja Ustalony poziom fluorescencji Wartość Ct = 27,3 Liczba cykli Ocena ilościowa DNA CMV Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV służy do ilościowego oznaczania stężenia DNA wirusa CMV z wykorzystaniem drugiej sekwencji docelowej (preparat CMV Quantitation Standard), którą w znanym stężeniu dodaje się do każdej próbki testowej. Standard CMV QS jest niezakaźnym konstruktem DNA zawierającym fragmenty sekwencji wirusa CMV z obszarami wiązania primerów, które są identyczne z obszarami wiązania na docelowej sekwencji wirusa CMV. Standard CMV QS zawiera miejsca wiązania primerów CMV i daje produkt amplifikacji o takiej samej długości i składzie zasad jak w docelowym DNA wirusa CMV. Obszar wiązania sondy detekcyjnej w obrębie CMV QS został zmodyfikowany, aby umożliwić odróżnienie amplikonu CMV QS od amplikonu docelowego CMV. Podczas fazy hybrydyzacji reakcji PCR w analizatorze COBAS TaqMan lub analizatorze COBAS TaqMan 48 próbki zostają oświetlone i wzbudzone światłem przefiltrowanym, a następnie rejestruje się wyniki emisji przefiltrowanej fluorescencji każdej próbki. Odczyty dotyczące poszczególnych próbek poddaje się korekcji w celu wyeliminowania zmienności wywołanej działaniem instrumentów. Aparat wprowadza odczyty fluorescencji do programu AMPLILINK i zapisuje w bazie danych. Stosuje się metodę odczytów wstępnych do określenia, czy DNA wirusa CMV oraz DNA standardu CMV QS reprezentują zestawy, które można uznać za ważne; w sytuacji, gdy dane nie mieszczą się w ustalonych granicach, generowane są odpowiednie oflagowania. Po ukończeniu i pomyślnej ocenie wszystkich odczytów wstępnych odczyty fluorescencji są następnie przetwarzane w celu obliczenia wartości Ct dla DNA wirusa CMV i DNA standardu CMV QS. Tablica swoistych dla danej serii stałych kalibracji dołączona do testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV służy do obliczania wartości miana próbek i kontroli na podstawie wartości Ct DNA wirusa CMV oraz DNA standardu CMV QS. Wyniki oznaczenia miana podaje się jako liczbę kopii/ml (kp/ml). 04898362049-02PL 6 Doc Rev. 2.0

ODCZYNNIKI COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: 04902068 190) CMV CS1 (Kaseta odczynnikowa z cząsteczkami magnetycznymi) Szklane cząsteczki magnetyczne Bufor Tris-base 0,09% azydku sodu 0,1% metyloparaben CMV CS2 (Kaseta z odczynnikiem lizującym do oznaczeń CMV) Cytrynian sodu dwuwodny 42,5% tiocyjanian guanidyny 3,6% polidokanol 1,8% ditiotreitol Xn 42,5% (wagowo) tiocyjanian guanidyny CMVCAP 72 testy 1 x 72 testy 1 x 72 testy Produkt szkodliwy R20/21/22, R52/53, R32: Działa szkodliwie przez drogi oddechowe, w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Działa szkodliwie na organizmy wodne; może powodować długo utrzymujące się niekorzystne zmiany w środowisku wodnym. W kontakcie z kwasami uwalnia bardzo toksyczne gazy. S24/25, S36/37/39, S61: Unikać zanieczyszczenia skóry i oczu. Nosić odpowiednią odzież ochronną, odpowiednie rękawice ochronne i okulary lub ochronę twarzy. Unikać zrzutów do środowiska. Postępować zgodnie z instrukcją lub kartą charakterystyki. CMV CS3 Kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń CMV, zawierająca: Pase (Roztwór proteinazy) Bufor Tris < 0,05% EDTA Chlorek wapnia Octan wapnia 7,8% proteinaza Glicerol Xn 7,8% (wagowo) proteinaza 1 x 72 testy 1 x 3,8 ml Produkt szkodliwy R36, R42: Działa drażniąco na oczy. Może powodować uczulenie w następstwie narażenia drogą oddechową. S23, S45: Nie wdychać pary. W przypadku awarii lub jeżeli źle się poczujesz, niezwłocznie zasięgnij porady lekarza jeżeli to możliwe, pokaż etykietę. 04898362049-02PL 7 Doc Rev. 2.0

EB (Bufor do elucji) Bufor Tris-base Wodorotlenek sodu 0,09% azydku sodu CMV CS4 Kaseta odczynników swoistych dla testu do oznaczeń CMV zawierająca: CMV QS (Standard ilościowy CMV) Bufor Tris-HCl EDTA < 0,005% Poly ra RNA (syntetyczny) < 0,001% niezakaźny plazmid DNA (bakteryjny) zawierający sekwencje CMV wiążące primery i unikalny region wiążący sondę 0,05% azydku sodu CMV MMX (Odczynnik CMV Master Mix) Bufor Tricine Octan potasu Wodorotlenek potasu < 20% dimetylosulfotlenek Glicerol < 0,05% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,01% primery sensowne i antysensowne CMV < 0,01% aptamer oligonukleotydowy < 0,01% znakowane barwnikami fluorescencyjnymi sondy oligonukleotydowe swoiste dla CMV oraz standardu oznaczenia CMV Quantitation Standard < 0,05% polimeraza DNA Z05 (bakteryjna) < 0,1% enzymu AmpErase (uracylo-n-glikozylazy) (bakteryjnej) 0,09% azydku sodu MgCl 2 (Roztwór magnezu CAP/CTM) < 0,6% chlorku magnezu 0,09% azydku sodu CMV H(+)C (Kontrola CMV wysoko dodatnia) < 0,001% fag lambda zawierający DNA wirusa CMV Osocze ludzkie niereaktywne w testach licencjonowanych przez US FDA w zakresie przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2 i antygenu HIV p24 lub RNA HIV-1, HBsAg; DNA wirusa CMV niewykrywalne przy użyciu metod PCR 1 x 8,1 ml 1 x 72 testy 1 x 6,2 ml 1 x 3,2 ml 1 x 9,8 ml 6 x 0,65 ml 0,1% substancja konserwująca ProClin 300 Xi mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu i 2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu (3 : 1) Produkt drażniący S24, S37: Unikać zanieczyszczenia skóry. Nosić odpowiednie rękawice ochronne. R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. 04898362049-02PL 8 Doc Rev. 2.0

CMV L(+)C (Kontrola CMV nisko dodatnia) < 0,001% fag lambda zawierający DNA wirusa CMV w średnim stężeniu około 100 razy mniejszym niż średnie stężenie DNA wirusa CMV w CMV H(+)C Osocze ludzkie niereaktywne w testach licencjonowanych przez US FDA w zakresie przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2 i antygenu HIV p24 lub RNA HIV-1, HBsAg; DNA wirusa CMV niewykrywalne przy użyciu metod PCR 6 x 0,65 ml 0,1% substancja konserwująca ProClin 300 Xi mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu i 2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu (3 : 1) Produkt drażniący S24, S37: Unikać zanieczyszczenia skóry. Nosić odpowiednie rękawice ochronne. R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. CMV ( ) C (Kontrola ujemna CMV) Osocze ludzkie niereaktywne w testach licencjonowanych przez US FDA w zakresie przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2 i antygenu HIV p24 lub RNA HIV-1, HBsAg; DNA wirusa CMV niewykrywalne przy użyciu metod PCR 6 x 0,65 ml 0,1% substancja konserwująca ProClin 300 Xi mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu i 2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu (3 : 1) Produkt drażniący S24, S37: Unikać zanieczyszczenia skóry. Nosić odpowiednie rękawice ochronne. R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. CMV H(+)C Clip (Klips z kodem kreskowym dla kontroli CMV wysoko dodatniej) CMV L(+)C Clip (Klips z kodem kreskowym dla kontroli CMV nisko dodatniej) CMV ( ) C Clip (Klips z kodem kreskowym dla kontroli ujemnej CMV) 1 x 6 klipsów 1 x 6 klipsów 1 x 6 klipsów COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Odczynnik płuczący COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: 03587797 190) PG WR 1 x 5,1 l PG WR (Odczynnik płuczący COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) Cytrynian sodu dwuwodny < 0,1% N-metyloizotiazolon-HCl 04898362049-02PL 9 Doc Rev. 2.0

OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI A. DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. B. Test jest przeznaczony do stosowania z osoczem ludzkim pobranym na antykoagulant EDTA. C. Nie należy pipetować za pomocą ust. D. Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami i odczynnikami z zestawów, należy stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyć ręce po pracy z próbkami i odczynnikami testowymi. E. Przy pobieraniu materiału z fiolek kontroli unikać skażenia odczynników bakteriami lub nukleazą. F. Zaleca się używanie jałowych jednorazowych pipet oraz końcówek pipet niezawierających DNazy. G. Nie mieszać kontroli pochodzących z różnych serii lub różnych fiolek tej samej serii. H. Nie mieszać ze sobą kaset odczynników lub kontroli pochodzących z różnych zestawów. I. Nie otwierać kaset COBAS AmpliPrep; nie wymieniać, nie mieszać, nie usuwać ani nie dodawać butelek do kasety. J. Wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. K. Nie używać zestawu po upływie daty ważności. L. Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS, ang. Material Safety Data Sheet) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. M. Z próbkami oraz kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując bezpieczne procedury laboratoryjne przedstawione w Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 oraz w CLSI Document M29-A3 39. Dokładnie wyczyścić i zdezynfekować wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym 0,5-procentowym roztworem podchlorynu sodowego w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. Uwaga: Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zazwyczaj zawiera podchloryn sodu w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku 1:10 pozwoli uzyskać roztwór 0,5% podchlorynu sodu. N. UWAGA: Odczynniki CMV ( ) C, CMV L(+)C i CMV H(+)C zawierają ludzkie osocze otrzymane z krwi ludzkiej. Materiał źródłowy został przebadany i uznany za niereaktywny pod względem obecności antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg), przeciwciał przeciwko HIV-1/2 oraz HCV, a także antygenu HIV p24 lub RNA HIV-1. Testowanie ujemnego osocza ludzkiego metodą PCR nie wykazało obecności DNA wirusa CMV. Nie ma znanych metod testowych mogących zapewnić całkowitą pewność, że produkty pochodzące z krwi ludzkiej nie przenoszą czynników zakaźnych. Dlatego każdy materiał pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźny. Z odczynnikami CMV ( ) C, CMV L(+)C i CMV H(+)C należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując bezpieczne procedury laboratoryjne przedstawione w Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 oraz w CLSI Document M29-A3 39. Dokładnie wyczyścić i zdezynfekować wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym 0,5% roztworem podchlorynu sodowego w wodzie dejonizowanej lub destylowanej. O. Odczynniki MGP, EB, CMV QS, MgCl 2 i CMV MMX zawierają azydek sodu. Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. P. Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem należy używać osłon na oczy oraz fartuchów laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Należy unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, trzeba natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania wspomnianych odczynników należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je wodą. 04898362049-02PL 10 Doc Rev. 2.0

Q. Nie dopuszczać do kontaktu CMV CS2 i odpadów płynnych z aparatu COBAS AmpliPrep zawierających tiocyjanian guanidyny z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Takie mieszaniny mogą spowodować powstanie silnie toksycznego gazu. R. Podczas utylizacji zużytych zestawów do przetwarzania próbek COBAS AmpliPrep Sample Processing Units (SPU) zawierających tiocyjanian guanidyny należy unikać ich kontaktu z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Takie mieszaniny mogą spowodować powstanie silnie toksycznego gazu. WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA A. Nie zamrażać odczynników ani kontroli. B. Odczynniki CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 i CMV CS4 należy przechowywać w temperaturze od 2 do 8 C. Odczynniki te, jeśli są nieużywane, są stabilne aż do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu odczynniki zachowują stabilność przez 70 dni w temperaturze od 2 do 8 C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej. Odczynniki CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 i CMV CS4 mogą być stosowane przez maksymalnie 6 cykli pracy urządzenia, łącznie przez okres do 100 godzin pracy w aparacie COBAS AmpliPrep. Pomiędzy kolejnymi cyklami pracy odczynniki należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. C. Odczynniki CMV H(+)C, CMV L(+)C i CMV ( ) C należy przechowywać w temperaturze od 2 do 8 C. Kontrole są stabilne aż do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu niewykorzystane do badania odczynniki należy wyrzucić. D. Klipsy z kodem kreskowym [CMV H(+)C Clip, CMV L(+)C Clip i CMV ( ) C Clip] należy przechowywać w temperaturze 2 30 C. E. Odczynnik PG WR przechowywać w temperaturze 2 30 C. Odczynnik PG WR zachowuje stabilność do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu odczynnik zachowuje stabilność przez 28 dni w temperaturze 2 30 C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej. DOSTARCZONE MATERIAŁY A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMVCAP CMV Test (P/N: 04902068 190) CMV CS1 (Kaseta zawierająca szklane cząsteczki magnetyczne do oznaczeń CMV) CMV CS2 (Kaseta z odczynnikiem lizującym do oznaczeń CMV) CMV CS3 (Kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń CMV) CMV CS4 (Kaseta odczynników swoistych dla testu do oznaczeń CMV) CMV H(+)C (Kontrola CMV wysoko dodatnia) CMV L(+)C (Kontrola CMV nisko dodatnia) CMV ( ) C (Kontrola ujemna CMV) CMV H(+)C Clip (Klips z kodem kreskowym dla kontroli CMV wysoko dodatniej) CMV L(+)C Clip (Klips z kodem kreskowym dla kontroli CMV nisko dodatniej) 04898362049-02PL 11 Doc Rev. 2.0

CMV ( ) C Clip (Klips z kodem kreskowym dla kontroli ujemnej CMV) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Odczynnik płuczący COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: 03587797 190) PG WR PG WR (Odczynnik płuczący COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Przyrządy i oprogramowanie Aparat COBAS AmpliPrep Analizator COBAS TaqMan lub analizator COBAS TaqMan 48 Opcjonalnie: stacja dokująca Opcjonalnie: aparat cobas p 630 Program AMPLILINK w wersji 3.3 Series Stacja robocza z drukarką do programu AMPLILINK Podręczniki programu AMPLILINK w wersji serii 3.3: Instrukcja obsługi aparatu COBAS AmpliPrep, współpracującego z analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 lub aparatem cobas p 630 i oprogramowaniem AMPLILINK w wersji serii 3.3; Instrukcja obsługi analizatora COBAS TaqMan (z opcjonalną stacją dokującą) do użytku z podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.3; Instrukcja obsługi analizatora COBAS TaqMan 48 do użytku z oprogramowaniem AMPLILINK, podręcznik programu w wersji serii 3.3; Podręcznik programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z narzędziem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 oraz analizatorem COBAS AMPLICOR lub Podręcznik programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 i aparatem cobas p 630. Materiały jednorazowe Jednostki przetwarzania próbki: SPU Probówki wejściowe na próbki (ang. S-tube input) z klipsami z kodem kreskowym Statywy z końcówkami K Statywy z probówkami K 04898362049-02PL 12 Doc Rev. 2.0

INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE Statyw na próbki (statyw SK24) Statyw na odczynnik Statyw na SPU Nośnik K Transporter nośników K Statyw na nośniki K (wymagany tylko do analizatora COBAS TaqMan 48) Pipetory z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania niezawierającymi DNazy (pojemność 1000 µl)* Rękawice jednorazowe bezpudrowe Mieszadło wibracyjne * Dokładność pipetorów musi mieścić się w zakresie 3% podanej objętości. Tam gdzie jest to wymagane, należy używać pozbawionych DNazy końcówek z barierą aerozolową lub końcówek dodatniego wypierania w celu zapobieżenia skażeniu krzyżowemu między próbką i amplikonem. POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK Uwaga: Ze wszystkimi próbkami i próbami kontrolnymi należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym. Uwaga: Ten test został zatwierdzony wyłącznie do badania ludzkiego osocza pobranego jako antykoagulant. Badanie innych rodzajów próbek może dawać nieprawidłowe wyniki. A. Pobieranie próbek Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV jest przeznaczony do stosowania z próbkami osocza. Krew należy pobierać do jałowych probówek zawierających EDTA (korek lawendowy) jako antykoagulant, a następnie mieszać zgodnie z zaleceniami producenta probówki. B. Transport próbek Krew pełną należy przechowywać w temperaturze 2 25 C nie dłużej niż 6 godzin. Oddzielić osocze od pełnej krwi w ciągu 6 godzin od pobrania, odwirowując (800 1600 x g przez 20 minut) w temperaturze pokojowej. Osocze należy przenieść do jałowych probówek polipropylenowych. Transport pełnej krwi lub osocza musi przebiegać zgodnie z przepisami krajowymi i lokalnymi dotyczącymi transportu czynników zakaźnych 41. Krew pełną należy transportować w temperaturze 2 25 C i odwirować w ciągu 6 godzin od pobrania. Osocze należy transportować w temp. 2 8 C lub zamrożone w temp. 20 C. C. Przechowywanie próbek Próbki osocza można przechowywać w temperaturze 2 8 C do 7 dni. Próbki osocza wykazują stabilność przez 6 tygodni w stanie zamrożenia w temperaturze 20 C. Zaleca się przechowywanie próbek w porcjach o objętości 550 600 µl w sterylnych polipropylenowych probówkach o pojemności 2,0 ml z nakrętką (takich jak Sarstedt 72.694.006). Rysunek 4 przedstawia dane dotyczące stabilności próbek pochodzące z badań nad przechowywaniem próbek przeprowadzonych z użyciem testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV. 04898362049-02PL 13 Doc Rev. 2.0

Rysunek 4 Stabilność wirusa CMV w osoczu z dodatkiem EDTA 3,50 Log10 miana (kp/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Próbka 2 8ºC 0 dni 2 8ºC 3 dni 2 8ºC 7 dni 20ºC 6 tyg. Próbki osocza można zamrażać i rozmrażać do 3 razy bez znacznej utraty DNA wirusa CMV. Rysunek 5 przedstawia dane pochodzące z badania dotyczącego zamrażania i rozmrażania przeprowadzonego z użyciem testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV. Rysunek 5 Wyniki oznaczania wirusa CMV po zastosowaniu do 3 cykli zamrażania i rozmrażania (Z R) próbki (osocze z dodatkiem EDTA) 3,50 Log10 miana (kp/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Próbka Zamrażanie/rozmrażanie 0 x Zamrażanie/rozmrażanie 2 x Zamrażanie/rozmrażanie 1 x Zamrażanie/rozmrażanie 3 x 04898362049-02PL 14 Doc Rev. 2.0

INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA Uwaga: Szczegółowe instrukcje obsługi, szczegółowy opis dotyczący możliwych konfiguracji, drukowania wyników oraz interpretacji oflagowań wyników, komentarze i komunikaty o błędach można znaleźć w (1) instrukcji obsługi aparatu COBAS AmpliPrep do użytku z analizatorem COBAS TaqMan, COBAS TaqMan 48 lub aparatem cobas p 630 i programem AMPLILINK w wersji serii 3.3; (2) instrukcji obsługi analizatora COBAS TaqMan (z opcjonalną stacją dokującą) do użytku z podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.3; (3) instrukcji obsługi analizatora COBAS TaqMan 48 do użytku z podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.3; (4) podręczniku programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, analizatorem COBAS TaqMan 48 lub podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem COBAS AmpliPrep, analizatorem COBAS TaqMan, COBAS TaqMan 48 i aparatem cobas p 630. Wielkość serii Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające do 72 testów, które można przeprowadzać w seriach liczących 12 24 testów. Każda seria musi obejmować co najmniej jedno powtórzenie kontroli CMV ( ) C, CMV L(+)C i CMV H(+)C (patrz rozdział Kontrola jakości ). Przebieg pracy Przebieg pracy analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 należy rozpocząć w ciągu 120 minut od zakończenia przygotowywania próbki i kontroli. Uwaga: Próbek i kontroli po obróbce nie zamrażać ani nie przechowywać w temperaturze 2 8 C. Przygotowanie próbki i kontroli Uwaga: W przypadku stosowania próbek zamrożonych należy je pozostawić w temperaturze pokojowej do całkowitego rozmrożenia i przed użyciem wymieszać na mieszadle wibracyjnym przez 3 5 sekund. Kontrole przed użyciem należy wyciągnąć z miejsca przechowywania o temperaturze 2 8 C i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej. Przygotowanie aparatu COBAS AmpliPrep Część A. Konserwacja i płukanie A1. Aparat COBAS AmpliPrep w trybie oczekiwania (stand by) jest gotowy do pracy. A2. Włącz stację roboczą programu AMPLILINK za pomocą przycisku ON. Przygotuj stację roboczą do pracy w następujący sposób: a. Zaloguj się do systemu operacyjnego Windows XP. b. Dwukrotnie kliknij ikonę programu AMPLILINK. c. Zaloguj się do programu AMPLILINK, wprowadzając przydzielony identyfikator użytkownika i hasło. A3. Skontroluj stan odczynnika PG WR na ekranie Status i w razie potrzeby wymień go. A4. Wykonaj wszystkie czynności konserwacyjne wyszczególnione w zakładce Due. Aparat COBAS AmpliPrep automatycznie przepłucze system. 04898362049-02PL 15 Doc Rev. 2.0

Część B. Ładowanie kaset z odczynnikami Uwaga: Wszystkie kasety odczynników należy wyjąć z miejsca przechowywania o temperaturze 2 8 C, natychmiast załadować do aparatu COBAS AmpliPrep i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej wewnątrz aparatu na co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem przygotowywania pierwszej próbki. Nie dopuszczać do ogrzania się kaset z odczynnikami do temperatury pokojowej poza aparatem ze względu na możliwość skraplania pary na etykietach z kodem kreskowym. W przypadku pojawienia się skroplonej pary nie ścierać jej z etykiet z kodem kreskowym. B1. Umieść kasety CMV CS1 w statywie na odczynniki. Umieść kasety CMV CS2, CMV CS3 i CMV CS4 w osobnym statywie na odczynniki. B2. Włóż statyw na odczynniki zawierający CMV CS1 na pozycję A w aparacie COBAS AmpliPrep. B3. Włóż statyw na odczynniki zawierający CMV CS2, CMV CS3 i CMV CS4 na pozycję B, C, D lub E w aparacie COBAS AmpliPrep. Dodatkowe informacje przedstawiono w tabeli 1. Część C. Ładowanie materiałów jednorazowych Uwaga: Określ liczbę potrzebnych kaset odczynnikowych COBAS AmpliPrep, zestawów Sample Processing Units (SPU), probówek wejściowych próbki (S-tube), końcówek K-tip oraz probówek K-tube. Każda próbka lub kontrola wymaga użycia jednej jednostki SPU, jednej probówki wejściowej S, jednej końcówki K i jednej probówki K. Aparat COBAS AmpliPrep współpracujący z analizatorem COBAS TaqMan lub analizatorem COBAS TaqMan 48 charakteryzuje się wieloma możliwościami ustawień przebiegu pracy. Szczegółowe informacje patrz tabela 1. W zależności od wybranego ustawienia przebiegu pracy załaduj odpowiednią liczbę statywów z kasetami odczynników, statywów na próbki z probówkami wejściowymi S, statywów z jednostkami SPU, statywów z końcówkami K, statywów z probówkami K oraz nośników K w statywach na nośniki K na odpowiednie pozycje w aparacie COBAS AmpliPrep (dodatkowe informacje podano w tabeli 1). C1. Umieść jednostki SPU w statywach i załaduj statywy na odpowiednie pozycje J, K lub L w aparacie COBAS AmpliPrep. C2. W zależności od wybranego ustawienia przebiegu pracy włóż pełne statywy probówek K na pozycje M, N, O lub P w aparacie COBAS AmpliPrep. C3. Załaduj pełne statywy z końcówkami K na pozycje M, N, O lub P w aparacie COBAS AmpliPrep. C4. W przypadku wybranego przebiegu pracy nr 3 analizatora COBAS TaqMan 48 włóż nośniki K do statywu na nośniki K w miejsca M, N, O lub P w aparacie COBAS AmpliPrep. 04898362049-02PL 16 Doc Rev. 2.0

Tabela 1 Możliwości ustawień przebiegu pracy aparatu COBAS AmpliPrep z analizatorem COBAS TaqMan lub analizatorem COBAS TaqMan 48 1 2 3 Przebieg pracy Aparat COBAS AmpliPrep plus stacja dokująca plus analizator COBAS TaqMan Aparat COBAS AmpliPrep plus analizator COBAS TaqMan Aparat COBAS AmpliPrep plus analizatory COBAS TaqMan 48 Sposób przeniesienia do analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 Automatyczne przenoszenie nośnika K Ręczne przenoszenie probówek K w statywach na próbki do analizatora COBAS TaqMan Ręczne przenoszenie nośnika K za pomocą statywów na nośniki K do analizatora COBAS TaqMan 48 Statywy, zasobniki i materiały jednorazowe Probówki K w pełnych statywach na probówki K Końcówki K w pełnych statywach na końcówki K Probówki wejściowe S zawierające próbki oraz kontrole w statywach na próbki Jednostki SPU w statywach na zestawy SPU Odczynnik CS1 w statywie na kasety Odczynniki CS2, CS3, CS4 w statywie na kasety Probówki K w pełnych statywach na probówki K Końcówki K w pełnych statywach na końcówki K Probówki wejściowe S zawierające próbki oraz kontrole w statywach na próbki Jednostki SPU w statywach na zestawy SPU Odczynnik CS1 w statywie na kasety Odczynniki CS2, CS3, CS4 w statywie na kasety Po zakończeniu przetwarzania próbki: Probówki K w statywach na próbki (gotowe do przeniesienia ręcznego) Probówki K w statywach na próbki Końcówki K w pełnych statywach na końcówki K Probówki wejściowe S zawierające próbki oraz kontrole w statywach na próbki Jednostki SPU w statywach na zestawy SPU Odczynnik CS1 w statywie na kasety Odczynniki CS2, CS3, CS4 w statywie na kasety Puste nośniki K z kodem kreskowym w statywie na nośniki K Po zakończeniu przetwarzania próbki: Probówki K w nośniku K w statywie na zasobniki Pozycja w aparacie COBAS AmpliPrep M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Jak powyżej (F H) F H M P F H J L A B E M P Jak powyżej (M P) 04898362049-02PL 17 Doc Rev. 2.0

Część D. Tworzenie zleceń i ładowanie próbek D1. Przygotowanie statywów na próbki: Do każdej pozycji statywu na próbki, gdzie zostanie umieszczony materiał próbki (probówka S-tube), przymocuj klips opatrzony etykietą z kodem kreskowym. Do każdej pozycji statywu na próbki, gdzie zostanie umieszczony materiał kontroli (probówka S), przymocuj odpowiedni klips opatrzony etykietą z kodem kreskowym dla danej kontroli [CMV ( ) C, CMV L(+)C oraz CMV H(+)C]. Klipsy z kodami kreskowymi dla kontroli powinny mieć takie same numery serii, jak numery serii fiolek kontroli w zestawie. Zwróć uwagę, aby odpowiednie kontrole umieścić na pozycjach z odpowiednim klipsem z kodem kreskowym kontroli. Na każdej pozycji oznaczonej klipsem z kodem kreskowym umieść jedną probówkę wejściową S. D2. Utwórz zlecenia dla poszczególnych próbek i kontroli przy pomocy programu AMPLILINK w oknie Orders w zakładce Sample. Wybierz odpowiedni plik definicji testu i zakończ procedurę poprzez zapisanie. D3. W oknie Orders w zakładce Sample Rack przypisz zlecenia dla próbek i kontroli do pozycji statywów na próbki. Należy wprowadzić numer statywu na próbki dla statywu przygotowanego w punkcie D1. D4. Wydrukuj raport Sample Rack Order, który będzie służyć jako arkusz roboczy. D5. Przygotuj statywy na próbki i kontrole w miejscu pracy wyznaczonym do dodawania próbek i kontroli, jak opisano poniżej. Umieść każdą próbkę i kontrolę [CMV ( ) C, CMV L(+)C i CMV H(+)C] na mieszadle wibracyjnym na 3 5 sekund. Unikaj zanieczyszczenia rękawic podczas manipulacji próbkami i kontrolami. D6. Przenieś 500 µl każdej próbki i kontroli [CMV ( ) C, CMV L(+)C oraz CMV H(+)C] do odpowiedniej, oznaczonej kodem kreskowym probówki wejściowej S-tube za pomocą mikropipetora z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania wolnych od DNazy. Unikaj przenoszenia cząstek stałych i/lub skrzepów fibrynowych z oryginalnej próbki do probówki wejściowej S. Próbki i kontrole należy przenieść na pozycje probówek zgodnie z przygotowanym i zapisanym w punkcie D4 arkuszem roboczym. Klipsy z kodami kreskowymi dla kontroli powinny mieć takie same numery serii, jak numery serii fiolek kontroli w zestawie. Przypisz odpowiednie kontrole do właściwych pozycji z odpowiednim klipsem z kodem kreskowym kontroli. Unikaj zanieczyszczenia górnej części probówek S materiałem próbki lub kontroli. D7. W przypadku przebiegów pracy 1 i 2 statywy na próbki wypełnione probówkami wejściowymi S umieść na pozycjach F, G lub H w aparacie COBAS AmpliPrep. D8. W przypadku przebiegu pracy 3 z użyciem analizatora COBAS TaqMan 48 statywy na próbki z probówkami wejściowymi S oraz probówkami K (po jednej dla każdej z probówek wejściowych S, umieszczonej w prawym położeniu i sąsiadującej z probówką wejściową) umieść na pozycjach F, G lub H w aparacie COBAS AmpliPrep. Część E. Rozpoczęcie przebiegu pracy aparatu COBAS AmpliPrep E1. Przy użyciu programu AMPLILINK uruchom aparat COBAS AmpliPrep. Część F. Zakończenie przebiegu pracy aparatu COBAS AmpliPrep i transfer do analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 (dotyczy wyłącznie ustawienia przebiegu pracy 2 i 3) F1. Sprawdź, czy nie pojawiły się oflagowania lub komunikaty o błędzie. F2. Usuń z aparatu COBAS AmpliPrep przetworzone próbki i kontrole znajdujące się w statywach na próbki (w przypadku analizatora COBAS TaqMan bez stacji dokującej) lub w statywach na nośniki K (w przypadku analizatora COBAS TaqMan 48), w zależności od ustawienia przebiegu pracy (szczegółowe informacje przedstawiono w części G). 04898362049-02PL 18 Doc Rev. 2.0

F3. Usuń odpady z aparatu COBAS AmpliPrep. Uwaga: Przygotowanych próbek i kontroli nie należy wystawiać na działanie światła. Amplifikacja i detekcja Konfiguracja analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 Przebieg pracy analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 należy rozpocząć w ciągu 120 minut od zakończenia przygotowywania próbki i kontroli. Uwaga: Próbek i kontroli po obróbce nie zamrażać ani nie przechowywać w temperaturze 2 8 C. Część G. Ładowanie przetworzonych próbek G1. W zależności od wybranej konfiguracji przebiegu pracy aparatu wykonaj odpowiednie czynności w celu przeniesienia probówek K do analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48. Przebieg pracy 1: Przebieg pracy 2: Automatyczne przenoszenie nośnika K przez stację dokującą do analizatora COBAS TaqMan. Interwencja ręczna jest niepotrzebna. Ręczne przenoszenie probówek K w statywach na próbki do analizatora COBAS TaqMan. Przebieg pracy 3: Ręczny transfer nośnika K na statywie do nośników K do analizatora COBAS TaqMan 48. Ręczne przenoszenie nośników K do analizatora COBAS TaqMan 48 przy użyciu transportera nośników K. Część H. Rozpoczęcie przebiegu pracy analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 H1. Uruchom analizator COBAS TaqMan lub analizator COBAS TaqMan 48 przy użyciu jednej z poniższych opcji, zależnie od wybranych konfiguracji przebiegu pracy. Przebieg pracy 1: Przebieg pracy 2: Nie ma potrzeby przeprowadzania żadnych operacji. Automatyczny start pracy analizatora COBAS TaqMan po załadowaniu statywów na próbki. Przebieg pracy 3: Jeśli w nośniku K jest mniej niż 6 probówek K, wypełnij nośnik pustymi probówkami K. Wypełnianiem steruje oprogramowanie AMPLILINK. Otwórz pokrywę termocyklera, załaduj nośnik K i zamknij pokrywę. Rozpocznij przebieg pracy analizatora COBAS TaqMan 48. Część I. Zakończenie przebiegu pracy analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 I1. Po zakończeniu cyklu pracy analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48 wydrukuj raport wyników. Sprawdź, czy w raporcie wyników nie pojawiły się oznaczenia lub komunikaty o błędzie. Próbki oflagowane i opatrzone komentarzami należy interpretować zgodnie z opisem w części Wyniki. Po zatwierdzeniu dane ulegają archiwizacji. I2. Usuń zużyte probówki K z analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS TaqMan 48. 04898362049-02PL 19 Doc Rev. 2.0

WYNIKI Analizatory COBAS TaqMan i COBAS TaqMan 48 automatycznie oznaczają stężenie DNA CMV w próbkach i kontrolach. Stężenie DNA wirusa CMV jest wyrażane w kopiach (kp)/ml. Współczynnik przeliczania między liczbą kopii DNA CMV w mililitrze (określonego na podstawie testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV) i jednostką międzynarodową (IU)/ml wynosi 1,1 kp/iu [0,91 IU/kp] według pierwszego międzynarodowego standardu WHO dla ludzkiego wirusa cytomegalii dla technologii opartych na amplifikacji kwasów nukleinowych (NIBSC 09/162) 40. Wspomniany współczynnik przeliczania pomiędzy liczbą kopii a IU może się różnić w innych testach w kierunku DNA CMV. Oprogramowanie AMPLILINK: Określa wartość progową ilości cykli (Ct) dla DNA wirusa CMV oraz DNA standardu CMV QS. Określa stężenie DNA wirusa CMV na podstawie wartości Ct dla DNA wirusa CMV i DNA standardu CMV QS oraz swoistych dla danej serii współczynników kalibracji zapisanych w kodach kreskowych kasety. Określa, czy obliczone i wyrażone w kp/ml wartości dla kontroli CMV L(+)C oraz CMV H(+)C mieszczą się w określonych zakresach. Walidacja przebiegu pracy program AMPLILINK w wersji serii 3.3 Sprawdź okno wyników programu AMPLILINK lub wydruk w poszukiwaniu oflagowań i komentarzy, aby się upewnić, że dana seria badań jest ważna. W przypadku zleceń dla próbek kontroli przeprowadzana jest kontrola w celu określenia, czy wartość podana w kopiach/ml mieści się w określonym przedziale. Jeśli wartość podana w kopiach/ml dla próbki kontroli nie mieści się w odpowiednim zakresie, generowany jest ZNACZNIK sygnalizujący błąd kontroli. Seria testowa jest uważana za ważną, jeśli żadna z kontroli [CMV ( ) C, CMV L(+)C i CMV H(+)C] nie została opatrzona znacznikiem błędu. Seria testowa jest nieważna, jeżeli kontrole dla testu CMV zostały opatrzone którymkolwiek z poniższych oznaczeń: Kontrola ujemna Znacznik Wynik Interpretacja NC_INVALID Invalid Wynik nieważny albo ważny, lecz nieujemny pod względem obecności docelowego CMV. Próba kontrolna CMV nisko dodatnia Znacznik Wynik Interpretacja LPCINVALID Invalid Wynik nieważny lub kontrola poza zakresem wartości. Próba kontrolna CMV silnie dodatnia Znacznik Wynik Interpretacja HPCINVALID Invalid Wynik nieważny lub kontrola poza zakresem wartości. Jeśli seria testowa jest nieważna, należy ją w całości powtórzyć, łącznie z przygotowaniem próbek i kontroli oraz amplifikacją i detekcją. 04898362049-02PL 20 Doc Rev. 2.0