Wykład Stres oksydacyjny. Rola chloroplastów, peroksysomów i mitochondriów w produkcji ROS. Kontrola stężenia ROS w komórkach roślinnych Autor dr Agnieszka Gniazdowska-Piekarska W tym wykładzie dowiesz się co to są reaktywne formy tlenu i co znaczy pojęcie stres oksydacyjny. Dowiesz się jaka rolę pełnią reaktywne formy tlenu w komórce roślinnej i z czego wynika dwoista natura ich działania. Dowiesz się kiedy i gdzie produkowane są reaktywne formy tlenu w roślinach a także poznasz mechanizmy regulacji ich stężenia w komórkach.
Dwa oblicza cząsteczki tlenu Jestem dobry, czy zły? Jestem wszechobecny na Ziemi. Beze mnie nie ma życia, Jestem konieczny w procesie oddychania mitochondrialnego. Odpowiadam za poważne uszkodzenia komórek, czasami prowadzące do śmierci. Wolne rodniki tlenowe - bracia i siostry powstający w wyniku niepełnej redukcji mojej cząsteczki uczestniczą w przekazywaniu informacji, jako cząsteczki sygnałowe. Tlen jest pierwiastkiem bardzo rozpowszechnionym na Ziemi. W dolnych warstwach atmosfery zawartość tego gazu wynosi 21 %. Tlen rozpuszczony w wodzie umożliwia życie wielu organizmom wodnym. Tlen jest składnikiem niezbędnym do życia ponieważ umożliwia komórkom uzyskanie dużych ilości energii w procesie oddychania mitochondrialnego (więcej niż zapewniłaby beztlenowa fermentacja). Komórki płacą jednak wysoką cenę za tę energetyczną korzyść. Tlen jest koniecznym, ale niebezpiecznym przyjacielem. W stanie podstawowym cząsteczka tlenu ma dwa elektrony na prostopadłych względem siebie antywiążących orbitalach p. Spiny dwóch elektronów na orbitalach p cząsteczki tlenu są równoległe. Tlen mający dwa niesparowane elektrony mógłby wejść w reakcję, ale tylko z cząsteczką mającą również dwa niesparowane elektrony. Jednak większość cząsteczek na sparowane elektrony. Ponieważ trudno jest znaleźć cząsteczce tlenu partnerów do reakcji dwuelektronowej lub czteroelektronowej, tlen wstępuje na drogę reakcji jednoelektronowej tworząc anionorodnik ponadtlenkowy. Stąd już blisko do powstania stresu oksydacyjnego.
Co to są reaktywne formy tlenu (ROS)? Główni sprawcy stresu oksydacyjnego. Reaktywne formy tlenu (ROS) (rodniki tlenowe i nadtlenek wodoru są produktami kolejnych stopni redukcji cząsteczki tlenu. Niepełna redukcja cząsteczki tlenu prowadzi do powstawania ROS. Całkowita redukcja + 4 e - + 4H + 2H 2 O 4 e - + 4H + e - 2 e - + 2H + O 2 e - + 2H + H 2 e - + H + H 2 O + HO 2 e - + 2H + Niepełna redukcja e - + H + 2H 2 O Tlen cząsteczkowy jest utleniaczem: reagując ze związkami organicznymi, utlenia je, pobierając od nich elektrony, a sam ulega redukcji. Całkowita redukcja oznacza przyłączenie 4 protonów i 4 elektronów i powstają wówczas 2 cząsteczki H 2 O. Jest to reakcja egzoergiczna, a produkt reakcji tlenek wodoru (H 2 O) jest niereaktywny wobec innych składników komórki. Cząsteczka tlenu, nie zawsze ulega pełnej, czteroelektronowej redukcji. Jeśli tlen ulega jednoelektrodowej redukcji tworzy się anionorodnik ponadtlenkowy (O 2 ), dwuelektronowa redukcja prowadzi do wytworzenia nadtlenku wodoru (H 2 ) Rodnik to atom lub cząsteczka zdolna do samodzielnego istnienia, mająca jeden lub więcej niesparowanych elektronów. Obecność niesparowanego elektronu sprawia, że rodniki są (słabo) przyciągane przez pole magnetyczne Wolne rodniki są reaktywne, ponieważ dążą do sparowania elektronów (pozbycia się nadmiaru elektronów, lub przyłączenia dodatkowego elektronu). Podstawowe Reaktywne Formy Tlenu (ROS) Tlen singletowy 1 ozon O 3 Anionorodnik ponadtlenkowy Rodnik hydroksylowy HO Rodnik nadtlenkowy ROO
Nadtlenek wodoru H 2 (nie jest wolnym rodnikiem, ale jest zaliczany do ROS) Co to jest stres oksydacyjny? Stres oksydacyjny to stan braku równowagi pomiędzy produkcją reaktywnych form tlenu (ROS), a zdolnością do ich szybkiej detoksykacji, detoksykacji powstających toksycznych produktów lub naprawy wyrządzonych szkód. Nadprodukcja i nagromadzanie ROS powoduje oksydacyjne uszkodzenia składników komórki, a szczególnie białek, lipidów i DNA. Mechanizmy detoksykacji ROS i naprawy uszkodzeo Stres oksydacyjny ROS Wg. Bartosz 2003 Stres oksydacyjny jest to stan nierównowagi pomiędzy nasileniem reakcji prowadzących do generacji reaktywnych form tlenu a reakcjami związanymi z ich usuwaniem. Istnieje wiele danych wskazujących, że powstawanie stresu oksydacyjnego jest wspólną odpowiedzią roślin na różne czynniki stresowe. Czynniki wywołujące stres oksydacyjny Uszkodzenia mechaniczne, zranienie postanoksja, posthypoksja lignifikacja nodulacja starzenie niska lub wysoka temperatura ROS Intensywne PAR patogeny susza metale ciężkie Stres oksydacyjny
Stres oksydacyjny może być wspólną odpowiedzią tkanek roślinnych na różne czynniki stresowe: deficyt wody, stres osmotyczny, stres solny, niedobór mikro lub makro elementów, niska lub zbyt wysoka temperatura, atak patogenu, uszkodzenia mechaniczne, zranienie, promieniowanie UV, nadmiar promieniowania fotosyntetycznie czynnego, post-anoksja lub post-hypoksja, działanie zanieczyszczeń atmosferycznych (S, NO, N, O 3 ), jonów metali ciężkich, niektóre herbicydy. Stres oksydacyjny pojawia się także podczas naturalnych procesów fizjologicznych (tworzenie brodawek na korzeniach roślin motylkowatych, lignifikacja czy starzenie się komórek). Źródła powstawania ROS w komórkach roślinnych ROS Tlen singletowy 1 Anionorodnik ponadtlenkowy O 2 Nadtlenek wodoru H 2 Miejsce syntezy i reakcja w której powstaje ROS Chloroplast, fotoukład PSII Mitochondria łaocuch transportu elektronów Chloroplasty reakcja Mehlera, fotoukład PSII Ściana komórkowa- peroksydazy ściany komórkowej Błona komórkowa oksydaza NADPH Peroksysomy fotooddychanie Chloroplasty łaocuch transportu elektronów Glioksysomy - β-oksydacja kwasów tłuszczowych Ściana komórkowa redukcja anionorodnika ponadtlenkowego Rodnik hydroksylowy HO Chloroplast fotoukład PSII, reakcja Fentona redukcja H 2 w obecności Fe 2+ Reaktywne formy tlenu powstają w różnych przedziałach komórkowych, a intensywność ich syntezy jest warunkowana przez czynniki środowiskowe, jak też stan fizjologiczny rośliny. Aby zrozumieć tę cześć wykładu przypomnij sobie jak zbudowane sąt łańcuch transportu elektronów w chloroplastach i łańcuch transportu elektronów w mitochondriach. Przypomnij sobie, że w mitochondriach elektrony przekazywane są na tlen przez oksydazę cytochromową lub alternatywną, a w chloroplastach dochodzi do fotolizy wody i w rezultacie wydzielania tlenu. Informacje na ten temat znajdziesz w wykładach Barwniki asymilacujne i fotosynteza oraz Oddychanie.
Chloroplasty są głównym źródłem ROS w fotosyntetyzujących tkankach stroma Fd Cyt b 6 f P680 PSII H 2 O PC P700 PSI chl chl* O 2 1 Lumen tylakoidu Podstawowym źródłem reaktywnych form tlenu w fotosyntetyzujących komórkach są chloroplasty. Głównym miejscem produkcji ROS w chloroplastach jest łańcuch transportu elektronów zlokalizowany w błonach tylakoidów, w którym może dochodzić do powstawania tlenu singletowego oraz anionorodnika ponadtlenkowego. Tlen singletowy powstaje w czasie przechodzenia wzbudzonego stanu tripletowego cząsteczki chlorofilu ( 3 Ch*) do stanu singletowego ( 1 Ch*). Głównym miejscem powstawania tlenu singletowego jest centrum reakcji PSII oraz kompleksy antenowe LHC (ang. Light harvesting antena complexes). Anionorodnik ponadtlenkowy tworzony jest natomiast w fotoukładzie PSII (P680) oraz w reakcji Mehlera w której elektrony bezpośrednio z PSI są przenoszone na tlen (ta reakcja została opisana w wykładzie Barwniki asymilacyjne i fotosynteza ). Powstający O 2 ulega w chloroplastach dysmutacji do H 2 w reakcji katalizowanej przez dysmutazę ponadtlenkową (SOD). W stromie chloroplastów istotną rolę w zmiataniu ROS odgrywa enzymatyczny cykl reakcji zapobiegający uszkodzeniu aparatu fotosyntetycznego znany jako cykl askorbinianowo-glutationowy (Haliwella-Asady). Natomiast w lumen tylakoidów (środowisko lipofilne) funkcje antyutleniaczy pełnią drobnocząsteczkowe związki: plastochinol, α-tokoferol i α-tokoferylochinon.
Peroksysomy uczestniczą w generacji ROS w fotosyntetyzujących tkankach roślin o fotosyntezie typu C3 Generacja H 2 w peroksysomach fotosyntetyzujących komórek liści zachodzi podczas fotoddychania w reakcji katalizowanej przez oksydazę glikolanową. Powstający H 2 jest rozkładany do H 2 O przez katalazę. fotooddychanie glikolan oksydaza glikolanowa H 2 katalaza gliksalan H 2 O +1/2 glicyna Utlenianie glicyny w mitochondriach Peroksysomy w liściach występują zazwyczaj pomiędzy chloroplastami a mitochondriami, stykając się z nimi ściśle powierzchnią błon. Główną ich funkcją jest prowadzenie kilku reakcji cyklu fotoodechowego (opis reakcji znajdziesz w wykładzie dotyczącym barwników fotosyntetycznych i fotosyntezy). Jedną z reakcji tego cyklu jest utlenianie glikolanu do glioksalanu w reakcji katalizowanej przez oksydazę glikolanową w której powstaje nadtlenek wodoru. Peroksysomy roślinne są zatem głównymi organellami odpowiedzialnymi za wewnątrzkomórkową produkcję H 2. W starzejących się, żółknących liściach peroksysomy przekształcają się w glioksysomy. Wykazano, że w organellach tych dochodzi do wzrostu aktywności enzymów odpowiedzialnych za katabolizm puryn są to m. in. oksydaza ksantynowa i oksydaza moczanowa. Produktem aktywności oksydazy ksantynowej jest anionorodnik ponadtlenkowy, natomiast produktem aktywności oksydazy moczanowej jest nadtlenek wodoru. W starzejących się liściach indukowane są też inne procesy prowadzące do wzrostu stężenia reaktywnych form tlenu. W błonie peroksysomów występuje krótki łańcuch transportu elektronów złożony z flawoproteiny reduktazy NADPH oraz cytochromu. W wyniku działania tego łańcucha na zewnętrznej, cytoplazmatycznej stronie peroksysomów wytwarzany jest anionorodnik ponadtlenkowy. Zwiększonemu wytwarzaniu O - 2 przez błony peroksysomów towarzyszy wzrost stężenia H 2 wewnątrz tych organelli, związany z obniżeniem aktywności katalazy. W ostatnich latach wykazano również, że w peroksysomach powstają O -. 2 i tlenek azotu (NO. ), będący jedną z reaktywnych form azotu (RNS).
Znaczne ilości ROS są wytwarzane w peroksysomach (typ glioksysomy) w procesie β- oksydacji kwasów tłuszczowych, w enzymatycznej reakcji z udziałem oksydaz flawinowych oraz w procesie dysproporcjonowania rodników O -. 2. Ciekawostka dla zainteresowanych. Peroksysomy są również jednym z podstawowych źródeł tlenku azotu (NO) w komórce roślinnej. Jest to reaktywna forma azotu (RNS ang. reactive nitrogen species) pełniąca bardzo istotne funkcje regulacyjne w komórkach roślinnych i działająca jako cząsteczka sygnałowa. Biosynteza tej molekuły w peroksysomach zachodzi prawdopodobnie na drodze enzymatycznej zależnej od aktywności podobnej do ssaczych syntaz tlenku azotu, co oznacza, ze NO powstaje z aminokwasu L-argininy. Istnieją również inne drogi biosyntezy NO u - roślin, należy do nich np. reakcja katalizowana przez reduktazę azotanową lub reduktazę N : NO, NI-NOR (ang. nitrite: NO-reductase), zlokalizowaną w błonie komórkowej korzeni. W komórkach roślinnych istnieje również nieenzymatyczna droga syntezy NO. Produkcja NO bez udziału enzymów zachodzi w kwaśnym ph, w obecności reduktantów np. askorbinianu. Jedną z wielu poznanych funkcji NO jest udział tego gazu w reakcjach roślin na różnego rodzaju stresy biotyczne i abiotyczne. Cząsteczki NO, podobnie jak ROS mogą (bezpośrednio) stanowić czynnik toksyczny w obronie przed patogenami lub mogą (pośrednio) brać udział w reakcjach obronnych jako cząsteczki sygnałowe (wtórne przekaźniki sygnałów). Najwięcej wiadomo na temat oddziaływania NO w regulacji odpowiedzi odpornościowej roślin na atak patogenów. Współdziałanie RNS i ROS wykazano podczas odpowiedzi na czynniki stresowe (zasolenie, promieniowanie UV-B), w indukcji reakcji nadwrażliwości HR (ang. hypersensitive response).. Znany jest udział NO w regulacji procesów wzrostu i rozwoju roślin. NO powoduje zahamowanie starzenia organów wegetatywnych roślin takich, jak liście i generatywnych (owoce) oraz przyspiesza ich wzrost. NO hamuje starzenie się liści poddanych działaniu stresu mechanicznego, w tym przypadku zwiększając stężenie askorbinianu w tkankach. Wykazano udział NO w regulacji wzrostu korzeni bocznych oraz przybyszowych. Podanie NO roślinom pozbawionym światła sprzyja procesom de etiolacji (zazieleniania) siewek oraz hamuje wydłużanie się międzywęźli. NO uczestniczy również w regulacji gospodarki wodnej roślin, poprzez regulację ruchów aparatów szparkowych. W przypadku niedoboru wody w środowisku dochodzi do szybkiego zamykania aparatów szparkowych pod wpływem ABA, w reakcji zależnej od NO i H 2. Tlenek azotu jest także zaangażowany w regulację procesu ustępowania spoczynku i kiełkowania nasion. Transdukcja sygnału NO odbywa się za pośrednictwem cgmp (cykliczny guanozynomonofosforan) i aktywację cyklazy guanylanowej.
Syntaza ATP W procesie oddychania mitochondrialnego, w standardowych warunkach, obserwuje się zjawisko tzw. przecieku mitochondrialnego, które polega na niepełnej redukcji (około 1-2 %) tlenu zużywanego przez rośliny. Prowadzi to do wytwarzania ROS, głównie O -. 2, który ulega dysmutacji do H 2. Jednak głównym źródłem ROS w mitochondriach jest łańcuch transportu elektronów. Można więc przyjąć, że wzrost produkcji ROS w mitochondriach jest związany z intensywnością oddychania. Tworzeniu ROS w mitochondriach sprzyja obniżenie aktywności oksydazy cytochromu c, oraz wyczerpanie akceptora fosforanu ADP w warunkach dużej dostępności substratu oddechowego. Powstający O 2 ulega w mitochondriach dysmutacji do H 2 w reakcji katalizowanej przez dysmutazę ponadtlenkową (SOD). Powstawanie ROS w mitochondriach H + I ND O 2 H + III c H + IV II UQ ND AOX NADH O bursztynian 2 O 2 NAD + fumaran H 2 O Matriks mitochondrialna H 2 O H + Wg. Blokhina, Fagerstedt 2009. Physiol Plant 138: 447-462 (zmodyfikowane). Anionorodnik ponadtlenkowy (O 2 ) może być generowany w wyniku jednoelektronowej redukcji zachodzącej z udziałem flawin lub ubichinonu. Miejscem jego tworzenia jest kompleks I (oksydoreduktaza NADH:ubichinon), kompleks II (oksydoreduktaza bursztynian:ubichinon) i kompleks III (oksydoreduktaza ubichinol:cytochrom c).
ROS powstają również jako odpowiedź rośliny na atak organizmów patogenicznych Reakcja nadwrażliwości reakcja systemiczna modyfikacja budowy ściany komórkowej Ściana komórkowa H 2 plazmolema Kompleks oksydazy NADPH cytoplazma NADPH NADP + H + W warunkach stresu biotycznego związanego z obecnością patogenów podstawowym miejscem syntezy ROS jest błona komórkowa. Reakcja ta jest katalizowana przez kompleks błonowej oksydazy NADPH. Powstające ROS biorą udział w indukcji specyficznych reakcji rośliny na obecność patogenów (reakcja nadwrażliwości, odpowiedzi systemicznej, modyfikacji struktury ściany komórkowej). Wiesz już w których kompartymentach komórkowych i na jakiej drodze dochodzi do tworzenia ROS. Postaraj się, spoglądając na poniższy rysunek przeanalizować udział poszczególnych organelli komórkowych w generowaniu ROS. Pamiętaj o tym, że procesy te zachodzą w komórce jednocześnie.
Podsumowanie Główne źródła ROS w fotosyntetyzującej komórce mezofilowej roślin o fotosyntezie C3 PSII światło PSI peroksysom glikolan H 2 gliksalan glicyna Oksydaza NADPH SOD Wiązanie C fotooddychanie H 2 chloroplast Cykl TCA H 2 glicyna NADH H 2 Peroksydazy ściany komórkowej NADH seryna mitochondrium Ściana komórkowa Uproszczony schemat powstawania ROS w komórce mezofilowej rośliny o fotosyntezie C3 zmodyfikowane w.g. Ślesak i inni 2007 Acta Biochim. Pol. 54: 39-50. Niektóre skutki działania ROS na komórki i ich składniki Uszkodzenia kwasów nukleinowych Peroksydacja lipidów błonowych Zahamowanie fosforylacji oksydacyjnej Utlenianie związków niskocząsteczkowych: glutation, askorbinian, NADH Inaktywacja enzymów Inaktywacja białek transportowych Zaburzenia wewnątrzkomórkowej homeostazy Ca 2+ Zaburzenia struktury cytoszkieletu (polimeryzacja aktyny, rozerwanie mikrofilamentów) Powstawanie mutacji Toksyczność ROS w komórkach wynika z ich ogromnej reaktywności z różnymi składnikami komórki takimi jak: lipidy, białka (w tym enzymy), kwasy nukleinowe i cukry. Prowadzi to do wielu uszkodzeń na terenie komórki (oksydacja lipidów, inaktywacja enzymów, białek transportujących, receptorów i kanałów jonowych, uszkodzenie struktury kwasów nukleinowych, depolimeryzacja polisacharydów). Najgroźniejszą formą ROS dla komórkowego DNA jest rodnik hydroksylowy ( OH), który może niszczyć strukturę
deoksyrybozy oraz zasad purynowych i pirymidynowych. Rodnik ten natychmiast wchodzi w reakcję ze wszystkimi składnikami komórki. Reaguje też z wolnymi cukrami. Stężenie ROS dodatkowo wzrasta w reakcji Fentona, w obecności takich katalizatorów jak jony żelaza (Fe 3+ ) czy miedzi (Cu 2+ ), co powoduje gwałtowną produkcję OH, przy współudziale H 2 i O -. 2. Wzmożona peroksydacja lipidów występuje wówczas, gdy ROS reagują z nienasyconymi kwasami tłuszczowymi wchodzących w skład lipidów błon komórkowych. Prowadzi to do zniszczenia struktury błony, utraty turgoru, a następnie śmierci komórek. Oddziaływania ROS z białkami dotyczą modyfikacji aminokwasów oraz fragmentacji łańcuchów polipeptydowych. Zmiany takie mogą powodować z jednej strony agregację białek poprzez tworzenie dodatkowych wiązań lub z drugiej strony naznaczać białka do proteolizy. Wiesz już, że ROS indukują tzw. stres oksydacyjny. Wiesz też, jakie są negatywne skutki działania ROS na składniki komórki. Teraz dowiesz się jak roślina broni się przed konsekwencjami nadmiernej produkcji i akumulacji ROS. Jednocześnie z produkcją ROS aktywacji ulega system antyoksydacyjny w komórkach roślinnych. Komórkowy system antyoksydacyjny to wieloskładnikowy system enzymatyczny i drobnocząsteczkowy odpowiadający za zmiatanie ROS. Komórkowy system antyoksydacyjny składa się z szeregu enzymów odpowiadających za rozkładanie ROS i niskocząsteczkowych związków łatwo reagujących z wolnymi rodnikami. Do systemu antyoksydacyjnego enzymatycznego zaliczamy takie enzymy jak: dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), katalaza (CAT), enzymy zaangażowane w cykl glutationowoaskorbinianowy (zwany też cyklem Halliwell-Asada): peroksydaza askorbinianowa (APX), reduktaza monodehydroaskorbinianowa (MDHAR), reduktaza dehydroaskorbinianu (DHAR) oraz reduktaza glutationowa (GR). Innymi enzymami zaangażowanym w metabolizm ROS są peroksydazy całkowite (POx) oraz peroksydaza glutationowa (GPX). W przypadku mitochondrium, enzymem zaangażowanym w regulację stężenia ROS jest alternatywna oksydaza (AOX), która katalizuje redukcję z pominięciem kompleksu III i IV, zatem może ograniczać ilość powstałego ROS. Zapamiętaj! Enzymy komórkowego systemu antyoksydacyjnego to: Dysmutaza ponadtlenkowa (SOD),
Katalaza (CAT), Peroksydaza glutationowa, (GPX) Peroksydaza askorbinianowa (APX), Reduktaza glutationowa (GR) Reduktaza monodehydroksyaskorbinianu (MDHAR) Reduktaza dehydroksyaskorbinianu(dhar) Systemy antyoksydacyjne współdziałające w usuwaniu ROS w chloroplastach funkcjonują w cyklu Halliwella-Asady (glutationowo-askorbinianowym). Postaraj się zapamiętać na czym polega antyoksydacyjna rola poszczególnych enzymów i jakie reakcje są przez nie katalizowane. Pamiętaj, że w wyniku działania enzymów antyoksydacyjnych dochodzi do usunięcia ROS i wytworzenia cząsteczki wody. Enzymy antyoksydacyjne i ich aktywnośd katalityczna katalaza Odpowiada za zmiatanie H 2, nie potrzebuje antyoksydantów cząsteczkowych Peroksydaza glutationowa Odpowiada za zmiatanie H 2, wymaga obecności GSH Dysmutaza ponadtlenkowa Odpowiada za zmiatanie, nie potrzebuje antyoksydantów cząsteczkowych Reduktaza glutationowa Zapewnia odtwarzanie GSH z GSSG, zużywa NADPH
Reakcje katalizowane przez podstawowe enzymy systemu antyoksydacyjnego Dysmutaza ponadtlenkowa: + + 2H+ H 2 + Katalaza: 2H 2 2H 2 O+ Peroksydaza glutationowa: 2GSH+ H 2 GSSG+2H 2 O Reduktaza glutationowa GSSG+NADPH + H + 2GSH+H + Peroksydaza askorbinianowa: askorbinian + H 2 dehydroaskorbinian + 2 H 2 O GSSG utleniona forma glutationu (związek niebezpieczny dla komórki bo utlenia grupy tiolowe białek, prowadząc do powstawania mostków disulfidowych GSH- zredukowana forma glutationu (antyoksydant) Enzymami, które zalicza się do głównych i działających jako pierwsze antyoksydanty są: dysmutazy ponadtlenkowe (SOD). Różne izoformy SOD mogą występować w różnych częściach komórki: (i) w matriks mitochondrium, peroksysomach i glioksysomach MnSOD (tetrametr, zawierający mangan w centrum aktywnym, złożony z czterech podjednostek o masie cząsteczkowej około 20 kda) (ii) w stromie chloroplastów - Cu,ZnSOD (homodimer zawierający miedź i cynk w centrum aktywnym, złożony z dwóch podjednostek o masie cząsteczkowej około 16 kda), oraz izoforma zawierająca żelazo - FeSOD, (iii) a w cytozolu Cu,ZnSOD. Wszystkie z wymienionych izoform SOD charakteryzuje różna wrażliwość na -. H 2 i HCN. Enzymy te katalizują reakcję dysproporcjonowania do H 2 i. Wydaje się, że MnSOD i FeSOD są ewolucyjnie starsze w stosunku do Cu,ZnSOD. Nie wszystkie izoformy SOD wykazują taką samą aktywność, wykazano, że najbardziej aktywną jest Cu,ZnSOD. U wszystkich gatunków roślin, w których analizowano aktywność różnych izoform SOD, stwierdzono, że obecność tego enzymu zależy zarówno od wieku jak i od stadium rozwojowego tkanek. Do konstytutywnych enzymów zalicza się Cu,ZnSOD obecną w cytozolu, a aktywność MnSOD podlega regulacji przez takie czynniki jak tlen, czy silne utleniacze np. żelazicyjanek. MnSOD i FeSOD są izoformami występującymi w specyficznych organellach komórkowych, takich jak mitochondria czy chloroplasty, natomiast cytoplazmowa izoforma Cu,ZnSOD wydaje się być konstytutywna. Katalazy (CAT) są kolejnymi enzymami szlaku antyoksydacyjnego, zaangażowanymi w metabolizm ROS, tetramerami, które katalizują reakcję dysmutacji H 2 do H 2 O i.
Aktywność CAT nie wymaga obecności siły redukcyjnej, enzym ten jest bardzo aktywny, choć ma niższe powinowactwo do substratu w porównaniu do peroksydaz. CAT należą do metalo-enzymów, w centrum aktywnym zawierają żelazo czyli należą do hemoprotein. Inną grupą CAT, są enzymy, które zamiast żelaza posiadają w centrum aktywnym mangan. CAT te charakteryzuje niewrażliwość na cyjanki i azydki. U rzodkiewnika CAT jest kodowana przez rodzinę genów (CAT1, CAT2, CAT3). Każdy z tych genów koduje pojedyncze podjednostki, które razem mogą tworzyć co najmniej sześć różnych izoform katalazy. U słonecznika zidentyfikowano osiem lizoform tego enzymu (CAT1 CAT8). Głównym miejscem występowania CAT są peroksysomy, ale w przypadku kukurydzy, izoforma CAT 3 zlokalizowana jest w mitochondrium. Reduktaza glutationowa (GR) to heterotetramer, składający się z podjednostek o masie cząsteczkowej około 60 kda i 32 kda. GR katalizuje redukcję glutationu (GSSG do GSH) w obecności NADPH, który ulega utlenieniu do NADP +. Wzrost aktywności GR jest zintegrowany ze zwiększoną produkcją NADPH (donor elektronów dla GR) w szlaku pentozofosforanowym (PPP). Aktywność GR oznaczono głównie w tkankach aktywnych fotosyntetycznie, przede wszystkim w chloroplastach, ale enzym ten może znajdować się również w innych częściach roślin, takich jak korzenie. Peroksydazy (POx) to grupa enzymów korzystających z różnych donorów elektronów, w zależności od katalizowanej reakcji. POx (zaliczane do peroksydaz guaiacolowych) biorą udział m.in. w biosyntezie lignin, degradacji IAA, biosyntezie etylenu. W centrum aktywnym tego typu peroksydaz, zaliczanych do glikoprotein, znajduje się Fe. Osobną grupę peroksydaz (nie będących glikoproteinami), typowych zmiataczy ROS, stanowią: APX (wykorzystująca askorbinian jako donor elektronów), występująca głównie u roślin i GPX (wykorzystująca glutation jako donor elektronów), charakterystyczna dla ssaków. Peroksydazy glutationowe należą do rodziny izozymów katalizujacych redukcję H 2, organicznych nadtlenowodorów i lipidowych nadtlenowodorów, z udziałem GSH jako donora elektronów. GPX należą do tetramerów o masie cząsteczkowej około 80 kda. Do niedawna uważano, że GPX występują głównie w organizmach zwierzęcych, dopiero pod koniec XX w. oznaczono ich aktywność w tkankach roślinnych. Trudności w identyfikacji GPX u roślin związane są z brakiem stałej obecności tego enzymu w komórkach. Synteza GPX zachodzi w odpowiedzi na czynnik stresowy. Brak jonów żelaza w centrum aktywnym cząsteczki GPX odróżnia ją od innych POx. Aktywność GPX jest niższa niż aktywność całkowitych POx, w przypadku wysokich stężeń H 2 występujących w komórkach roślinnych. U rzodkiewnika GPX są kodowane przez rodzinę 8 genów (GPX1 - GPX8). Wykazano, u rzodkiewnika, że
GPX występują w chloroplastach (wyodrębnione geny GPX1 i GPX7), cytozolu (GPX2, GPX4, GPX6), mitochondriach (GPX3) oraz retikulum endoplazmatycznym (GPX5). Prawdopodobnie GPX8 występuje w cytozolu. Najważniejszymi, enzymatycznymi zmiataczami ROS w komórkach roślin są CAT i APX, natomiast GPX uczestniczą w usuwaniu nadtlenków lipidów i nadtlenków alkilowych. U roślin oznaczana jest głównie aktywność GPX podobna. Enzymy komórkowego systemu antyoksydacyjnego H 2 CAT H 2 O askorbinian SOD APX MDHAR DHAR GR Systemy antyoksydacyjne współdziałające w usuwaniu ROS w chloroplastach tzw. cykl Halliwella-Asady (askorbinianowo-glitationowy) Zwróć uwagę, że współdziałanie poszczególnych enzymów cyklu Haliwella Asady jest uzależnione od jednoczesnej obecności glutationu i askorbinianu.
W skład nieenzymatycznego systemu antyoksydacyjnego można zaliczyć głównie cząsteczkowe, komórkowe zmiatacze ROS, rozpuszczalne w wodzie, jak: askorbinian i glutation oraz rozpuszczalne w tłuszczach, głównie tokoferole. Antyoksydacyjne działanie tokoferoli związane jest przede wszystkim z usuwaniem wtórnych rodników organicznych i przerywaniem łańcuchowych reakcji wolnorodnikowych lipidów. Innymi cząsteczkowymi składnikami systemu detoksykacji ROS są: polifenole, flawonoidy, antocyjany i peroksyredoksyny homologi tioredoksyn. Peroksyredoksyny są antyoksydantami zależnymi od grup tiolowych i mogą redukować OH. i H 2 oraz ochraniać białka przed stresem oksydacyjnym poprzez redukcję mostków disulfidowych. Zapamiętaj! Podstawowe antyoksydanty cząsteczkowe (nieenzymatyczne) pełniące rolę zmiataczy lub wychwytywaczy ROS to: ASKORBINIAN (ASA- witamina C) GLUTATION (GSH- forma zredukowana) TOKOFEROL (α-tokoferol-witamina E) FLAWONOIDY KAROTENOIDY Stosunek zawartości zredukowanej formy antyoksydanta do utlenionej formy antyoksydanta jest sygnałem modulującym mechanizmy zmiatania ROS.
Ascorbinian (witamina C) bierze udział w cyklu reakcji Haliwella-Asady, jest również konieczny do prawidłowego funkcjonowania cyklu ksantofilowego (fotokonwersja wiolaksantyna/zeaksantyna o którym była mowa na wykładzie dotyczącym fotosyntezy C3, C4 i CAM). Ponad 40 % całkowitej zawartości askorbinianu występującego w komórkach odnajdowane jest w chloroplastach. Glutation (γ-glu-cys-gly) to ważny rezerwuar nie-białkowych reszt tiolowych w komórkach roślinnych. Występuje w postaci zredukowanej (GSH) i utlenionej (GSSG). W standardowych warunkach dominującą formą glutationu jest forma zredukowana i stanowi ona ponad 90 % ogólnej jego zawartości. U roślin, glutation występuje w stężeniu od 0,1 0,5 µm g -1 świeżej masy, ale największą ilość tego tripeptydu zanotowano dla wyizolowanych chloroplastów grochu od 2 4,5 mm. Forma zredukowana glutationu pełni funkcję ochronną w stosunku do białek narażonych na działanie stresu oksydacyjnego. Grupa tiolowa GSH oddziaływuje z grupami tiolowymi białek. Stabilizując grupy SH aminokwasów budujących białkach, glutation odpowiada za utrzymanie ich prawidłowej struktury. Stanowi on ponadto prekursor fitochelatyn, uczestniczących w odpowiedzi roślin na stres obecności metali ciężkich. Poza udziałem w metabolizmie ROS utrzymanie odpowiedniego stosunku GSH/GSSG odpowiada za komórkową homeostazę potencjału redoks i pełni rolę wtórnego przekaźnika informacji w szlakach transdukcji sygnałów. Reguluje nie tylko metabolizm komórkowy ale uczestniczy w aktywacji ekspresji niektórych genów. Zmiany stosunku GSH/GSSG stanowią składowy element w szlaku sygnalnym indukowanym przez H 2. Istnieją również przesłanki świadczące o tym, że glutation uczestniczy w regulacji podziałów komórkowych, od jego stężenia zależy przejście komórki do fazy S (fazy poprzedzającej mitozę), również jest niezbędny do przejścia komórki do fazy G1. Glutation należy zatem do czynników stymulujących i determinujących dalsze losy komórki. Stanowi bezpośredni donor elektronów w reakcjach katalizowanych przez GPX. Karotenoidy takie jak ksantofile: zeaksantyna, anteraksanyna, wiolaksantyna czy luteina uczestniczą przede wszystkim w wygaszaniu tlenu singletowego w antenach fotosyntetycznych. Tokoferole przede wszystkim usuwają rodnikowe produkty utleniania lipidów, wygaszają 1, neutralizują powstające podczas utleniania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych rodniki nadtlenkowe lipidów.
Oprócz aktywnej walki z ROS roślina może unikać niekontrolowanego wzrostu stężenia ROS. Mechanizmy unikania niekontrolowanego wzrostu stężenia ROS to: Adaptacje anatomiczne struktura liści, epidermy, ruchy liści, prowadzące do ukrycia szparek lub przemieszczania się chloroplastów w komórkach mezofilowych liści Modyfikacje metabolizmu fotosyntetyczne wiązanie CO2 u roślin CAM lub C4 Rearanżacje aparatu fotosyntetycznego rozbudowa anten fotosyntetycznych Aktywacja alternatywnych oksydaz (AOX) w łańcuchu transportu elektronów (o tym zagadnieniu znajdziesz szczegółowe informacje w wykładzie o oddychaniu mitochondrialnym) Wiesz już, że ROS są toksyczne dla komórki, a stężenie ROS jest precyzyjnie regulowane - modulowane przez sprawnie funkcjonujący system antyoksydacyjny. Teraz dowiesz się, że bez ROS komórka nie mogłaby prawidłowo funkcjonować. ROS pełnią funkcję cząsteczek sygnałowych bodziec ROS Czynnik transkrypcyjny Fosfatazy + Kinazy MAP Odpowiedź fizjologiczna Przekazywanie informacji (transdukcja sygnału) wymaga przemieszczania się i szybkich zmian stężenia cząsteczek zwanych cząsteczkami sygnałowymi (przekaźniki informacji). Działanie ROS w komórkach roślinnych oprócz tego, że wywołują stres oksydacyjny przejawia się też ich funkcją sygnałową. Rolę tę pełni przede wszystkim H 2, który nie ma charakteru wolnorodnikowego. Jest stosunkowo stabilną formą ROS i posiada zdolność do
swobodnego przemieszczania się przez błony biologiczne, kanałami wodnymi akwaporynami lub specyficznymi kanałami zwanymi peroksykanałami. Może zatem oddziaływać z różnymi składnikami komórki np. modyfikować strukturę białek (reagowanie z grupami sulfhydrylowymi SH reszt aminokwasów) poza miejscem, w którym powstaje. Z tego względu H 2 uznawany jest za przekaźnik drugiego rzędu w przenoszeniu sygnału w komórkach roślinnych. Wszystkie formy ROS, stanowią bardzo ważny element w wielu szlakach transdukcji sygnału pełniąc funkcje wtórnych przekaźników informacji np. w szlaku sygnalnym etylenu czy ABA. Wyniki badań prowadzonych nad tolerancją tkanek rzodkiewnika na wysokie stężenia H 2 wykazały, że rośliny są w stanie przetrzymać stężenia rzędu 10 2-2 x 10 5 µm H 2. Ponadto, rośliny traktowane H 2, były bardziej odporne na stres świetlny i chłodu. ROS mogą modyfikować DNA, głównie na poziomie nukleotydów. Wykazano, że podwyższone stężenie H 2 w kulturze zawiesinowej komórek rzodkiewnika wywołuje zmianę poziomu ekspresji ponad 100 genów (część z nich stanowiły geny kodujące enzymy należące do systemu antyoksydacyjnego). ROS stymulują ponad 2-krotnie ekspresję genów kodujących takie białka jak: białka związane ze starzeniem organizmu i naprawą uszkodzonego DNA, m.in. aktywując czynniki transkrypcyjne. ROS mogą oddziaływać z białkami w regulacji różnych procesów metabolicznych, kontrolują również funkcjonowanie kaskady kinaz białkowych aktywowanych mitogenami (MAP). ROS hamują aktywność fosfataz, aktywują kanały wapniowe i białka wiążące wapń. Regulują potencjał redoks w komórce m.in. w wyniku oddziaływania na zmianę stosunku GSH/GSSG (glutationu w formie zredukowanej do formy utlenionej). Wykazano, że aktywność niektórych białek zaangażowanych w procesy energetyczne podlega modyfikacjom przez H 2. Ponadto, H 2 może współdziałać z NO w modyfikacji innych białek, oddziaływując na grupy sulfhydrylowe (-SH) i umożliwiając ich nitrozylację. Wspólnie z NO, ROS (głównie H 2 ) stymulują alternatywną drogę oddechową, poprzez aktywację genów alternatywnej oksydazy AOX. Z drugiej strony, AOX może zmniejszać stężenia ROS w mitochondriach, kiedy następuje zaburzenie transportu elektronów, zwłaszcza pod wpływem różnych czynników stresowych i w ten sposób działać jako antyoksydant. Jedną z najważniejszych potranslacyjnych modyfikacji białek przez ROS jest ich utlenianie, będące najprawdopodobniej procesem nieodwracalnym. Utlenianie w białkach reszt aminokwasowych takich jak: Arg (arginina), His (histydyna), Lys (lizyna), Pro (prolina), Thr (treonina) i Trp (tryptofan) powoduje powstawanie wolnych grup karbonylowych.
ROS pełnią funkcję cząsteczek sygnałowych H 2 uczestniczy w regulacji szeregu procesów fizjologicznych np. takich jak: Ruchy aparatów szparkowych indukowane obecnością kwasu abscysynowego (ABA) Reakcja grawitropiczna korzeni w odpowiedzi na auksynę Kiełkowanie nasion Starzenie owoców, nasion i liści Dojrzewanie owoców Reakcja roślin na patogeny Oddziaływanie ROS na żywą tkankę, polega nie tylko na ich toksyczności (właściwości antyseptyczne H 2 w stosunku do patogenów), ale również na regulacji wielu procesów fizjologicznych. Kontroli za pośrednictwem ROS podlegają oprócz procesów wymienionych powyżej wzrost i rozwój korzenia, liści i kwiatów. ROS uczestniczą w somatycznej embriogenezie, a także indukują programowaną śmierć komórki PCD (ang. programmed cell death). W czasie elongacyjnego wzrostu komórek, auksyny zwiększają apoplastyczną produkcję ROS. Peroksydazy związane ze ścianami komórkowymi katalizują wytwarzanie OH wykorzystując nagromadzone ROS. Rodnik OH uczestniczy w rozluźnianiu struktury ściany komórkowej i w ten sposób umożliwia wydłużanie się komórek. Dojrzewanie i starzenie się owoców jest procesem kontrolowanego utleniania. W tkankach owoców podczas dojrzewania zmniejsza się zawartość grup tiolowych, a wzrasta zawartość nadtlenku wodoru i nadtlenków lipidów. Dojrzewanie owoców można przyspieszyć przez traktowanie ich zewnętrznymi źródłami ROS lub doprowadzając do zwiększenia wewnątrzkomórkowego stężenia ROS. Wydaje się, że istnieje współdziałanie pomiędzy ROS i etylenem (hormon roślinny, zaliczany do grupy inhibitorów wzrostu) w regulacji starzenia tkanek i dojrzewania owoców
Podsumowanie Toksyczna i regulacyjna funkcja ROS Błony komórkowe chloroplasty mitochondria Funkcja sygnałowa ROS peroksysomy Endoplazmatyczne reticulum Działanie toksyczne Kaskadowa reakcja z udziałem kinaz białkowych MAP Indukcja stresu oksydacyjnego Aktywacja czynników transkrypcyjnych Uszkodzenia białek, kwasów nukleinowych lipidów błonowych Modyfikacja ekspresjii genów Utrata funkcji organelli komórkowych Odpowiedź fizjologiczna komórki Uszkodzenie lub śmierd komórki Podsumowanie wykładu Konsekwencją wysokiej zawartości w atmosferze jest powstawanie reaktywnych form tlenu (ROS), które są stale produkowane w komórkach roślinnych jako uboczny produkt metabolizmu głównie fotosyntetycznego i oddechowego. Do podstawowych reaktywnych form tlenu należą: nadtlenek wodoru (H 2 ), anionorodnik ponadtlenkowy (O.- 2 ), rodnik hydroksylowy. Wzmożoną produkcje ROS obserwuje się komórkach roślin poddanych działaniu różnych stresów, zarówno biotycznych jak i abiotycznych. Sytuacja nadmiernej produkcji ROS, przekraczającej możliwości usuwania ROS z komórek nosi nazwę stresu oksydacyjnego. Ochrona przed niekorzystnym działaniem ROS polega na uruchomieniu komórkowego systemu antyoksydacyjnego: drobnocząsteczkowego (askorbinian, glutation, karotenoidy, tokoferol) i enzymatycznego (dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza, enzymy cyklu Haliwella-Asady). Oprócz funkcji cytotoksycznej ROS pełnią także funkcję cząsteczek sygnałowych, odpowiedzialnych za przenoszenie informacji w regulacji odpowiedzi na różne stresy biotyczne i abiotyczne oraz procesów wzrostu i rozwoju roślin. Literatura podstawowa Fizjologia roślin, red. J. Kopcewicz, S. Lewak, rozdz. Stres oksydacyjny. Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa 2002 Małecka A., Tomaszewska B. 2005.Reaktywne formy tlenu w komórkach roślinnych i enzymatyczne systemy obronne. Postępy Biologii Komórki 32: 311-325.
Szymańska R., Strzałka K. 2010. Reaktywne formy tlenu w roślinach powstawanie, dezaktywacja i rola w przekazywaniu sygnału. Postępy Biochemii 56: 182-190. Druga twarz tlenu, Bartosz G. Wydawnictwo naukowe PWN, Warszawa 2003. Literatura dodatkowa i ciekawostki Lane N. 2005. Tlen. Cząsteczka, która stworzyła świat. Prószyński i S-ka, Warszawa. Gniazdowska A. (2004) Rola tlenku azotu w metabolizmie komórki roślinnej. Kosmos 53: 343-355. Gniazdowska A. Bogatek R. 2007. Regulacyjna rola NO w kiełkowaniu nasion. Postępy Biologii Komórki 34:431-443. Pytania problemowe 1. Zastanów się, czy określenie stres oksydacyjny ma jednoznacznie negatywne znaczenie? 2. Dlaczego mówi się niekiedy o dwóch obliczach cząsteczki tlenu? 3. Czy obecność sprawnego systemu antyoksydacyjnego gwarantuje usunięcie wszystkich ROS obecnych w komórce i czy byłoby to dla niej korzystne?