III. Mikro- i pikoplankton jeziorny

EKOFIZJOLOGIA MIKROORGANIZMÓW WODNYCH III. Mikro- i pikoplankton jeziorny Prowadzący ćwiczenia: Dr Bartosz Kiersztyn Mgr Katarzyna Jakubiec 1

Heterotroficzne komponenty pętli mikrobiologicznej bakterie Wprowadzenie Pętla mikrobiologiczna jest integralną częścią sieci troficznych każdego ekosystemu wodnego i stanowi złożony zespół procesów odpowiedzialnych za transfer i udostępnianie rozpuszczonej w wodzie materii organicznej (DOM) różnym mikro- i makroorganizmom heterotroficznym żyjących w ekosystemie wodnym. Kluczową pozycję w pętli mikrobiologicznej zajmują bakterie heterotroficzne, które jako wydajne osmoorganotrofy zdolne do asymilacji rozpuszczonej materii organicznej (DOM) i wbudowywania jej we własną biomasę. Przeprowadzają one proces biokonwersji DOM do upostaciowionej materii organicznej (POM). Powstała biomasa bakteryjna stanowi bazę pokarmową m.in. dla bakteriożernych pierwotniaków, z których najważniejszą rolę odgrywają heterotroficzne nanowiciowce (HNF) o rozmiarach od 2 do 10 µm, będące z kolei źródłem pokarmu dla większych zwierząt planktonowych. Ponieważ bakteriożercy stanowią poziom troficzny komunikujący się bezpośrednio z bakteriami, od ich aktywności pokarmowej zależy jak duża część ze zasymilowanej przez bakterie heterotroficzne rozpuszczonej materii organicznej przekazywana jest do wyższych poziomów troficznych ekosystemów wodnych. Zgodnie z powszechnie przyjmowaną w ekologii mikroorganizmów wodnych koncepcją, liczebność bakterii w środowiskach wodnych podlega dwóm mechanizmom kontroli: (i) od podstawy piramidy troficznej ( bottom-up ), poprzez stężenie i dostępność organicznych źródeł węgla, pierwiastków biogennych i energii; oraz (ii) od szczytu piramidy troficznej ( top down ) poprzez presję pokarmową bakteriożerców i lizę fagową. W przeciwieństwie do kontroli bottom-up, wpływającej jedynie na maksymalne tempo wzrostu bakterioplanktonu, mechanizm kontroli top down determinuje nie tylko rzeczywistą liczebność i wielkość biomasy bakteryjnej, lecz również kształtuje skład i dynamikę zespołów bakterii wodnych. Zaś od aktywności pokarmowej bakteriożerców zależy zróżnicowanie taksonomiczne, morfologiczne i genetyczne bakterii, a także udział w bakteriocenozie komórek aktywnych metabolicznie, formy morfologiczne i rozmiary 2

komórek; czy wreszcie stosunek ilościowy bakterii swobodnie pływających do osiadłych. Standardowo stosowane techniki mikrobiologiczne są nieprzydatne w izolacji oraz hodowli bakterii wodnych, ponieważ nie udaje się wyhodować jedynie części procenta bakteriimobecnych w wodach naturalnych. Uzyskanie szczegółowych i wiarygodnych danych dotyczących liczebności bakterioplanktonu stało się możliwe dopiero dzięki wprowadzeniu do badań hydromikrobiologicznych nowoczesnych technik mikroskopowych. Ich połączenie z zastosowaniem zaawansowanego systemu komputerowej analizy obrazu mikroskopowego pozwala na szybką i precyzyjną analizę ilościową i jakościową bakterioplanktonu w jego naturalnym środowisku, bez konieczności izolacji bakterii i ich hodowli w warunkach laboratoryjnych.

Ogólna liczba bakterii (metoda DAPI) Zasada oznaczenia Nieaktywne fluorescencyjnie DAPI (4,6-diamidino-2-phenyl-indol) wiążąc się z dwuniciowym DNA (dsdna) obecnym w komórkach bakterii tworzy kompleks silnie fluoryzujący w kolorze niebieskim po pobudzeniu światłem UV = 365 nm. Wybarwione komórki bakterii (tj. genofory bakteryjne emitujące niebieskie światło) w próbkach wody przesączonych przez filtr membranowy liczy się bezpośrednio na filtrze pod mikroskopem epifluorescencyjnym zaopatrzonym w filtry (ekscytacja = 365 nm, emisja = 420 nm) dla widma barwnika DAPI. Odczynniki i wyposażenie 1. DAPI (4,6-diamidino-2-phenyl-indol) 2. Woda destylowana przefiltrowana przez 0.2 µm filtr membranowy 3. Filtry membranowe poliwęglanowe 0.2 µm, 25 mm (czarne) 4. Filtry membranowe celulozowe 0.2 µm, 25 mm (białe) 5. Szklany zestaw do sączenia próbek wody przez filtry membranowe 25 mm, pojemność 10-50 ml (np. Millipore, Sartorius), zaopatrzony w spiek szklany 6. Ew. niefluoryzujący olejek immersyjny (CITIFLUOR AF1 lub inny) 7. Mikroskop epifluorescencyjny z lampą UV (powiększenie 1000x, obiektyw immersyjny 100x, okular siatkowy 10x) wyposażony w filtr do fluorescencji UV-2A (EX 330-380 nm, DM 400 nm, BA 420 nm). 4

Przygotowanie odczynników i roztworów 1. Roztwór stężony 500 μg DAPI ml -1 (I) Rozpuścić 10 mg DAPI w 20 ml wody destylowanej (przefiltrowanej przez 0.2 µm filtr membranowy). Stężony roztwór DAPI podzielić na porcje 1 ml w celu długotrwałego (kilka miesięcy) przechowywania w temperaturze -20 C. 2. Roztwór roboczy 50 μg DAPI ml -1 5 ml stężonego roztworu DAPI (I) zmieszać z 45 ml wody destylowanej (przefiltrowanej przez filtr 0.2 µm). Okres przechowywania w lodówce do 2 tygodni. Uwaga: jeżeli roztwór roboczy DAPI jest przechowywany w lodówce, to każdorazowo przed jego użyciem do barwienia należy go przesączyć powtórnie przez filtr 0.2 µm. Barwienie 1. Do 10 ml (1 ml badanej próbki wody z bakteriami + 9 ml wody jałowej) próby w probówce lub małym naczynku dodać 0.2 ml roztworu roboczego DAPI (stężenie końcowe barwnika w próbce 1 µg ml -1 próbki). W zależności od spodziewanej liczby bakterii można zmienić proporcje próbki i wody jałowej. 2. Barwić w ciemności przez 10-15 minut, w temperaturze pokojowej. Filtracja próbek wody 1. Na szklanym spieku w aparacie do filtracji umieścić zwilżony wodą 0.2 µm celulozowy filtr membranowy (biały), a następnie na jego powierzchni delikatnie umieścić czarny filtr membranowy 0.2 µm błyszczącą stroną do góry. Zamknąć aparat do filtracji. 2. Wlać wybarwioną próbkę wody do leja aparatu filtracyjnego i przesączyć. 3. Po przesączeniu wyjąć filtr z aparatu i wysuszyć.

Liczenie wybarwionych bakterii 1. Na cienkim szkiełku podstawowym umieścić wysuszony filtr (czarny) z wybarwionymi bakteriami. Dodać kroplę olejku immersyjnego (ew. olejku wzbudzającego fluorescencję CITIFLUOR AF1 lub innego) i położyć cienkie szkiełko nakrywkowe. Preparat umieścić pod mikroskopem epifluorescencyjnym (wcześniej dodać kroplę olejku immersyjnego). Intensywność fluorescencji kompleksu DAPIdsDNA w komórkach bakterii jest niezmienna pod mikroskopem przez okres do około 3 minut. Po tym czasie fluorescencja słabnie. 2. Policzyć bakterie w oparciu o system analizy obrazu NIS element (pow. 1000x) Obliczenia N n S f S k V - liczba bakterii (bakterie ml -1 ) - średnia liczba bakterii policzonych na polu obrazu - powierzchnia filtra z osadzonymi bakteriami (mm 2 ) - powierzchnia pola, w którym liczono bakterie (mm 2 ) (całkowita powierzchnia, z której liczono bakterie) - objętość próbki wody przesączonej przez filtr (ml) 6

OGÓLNA LICZBA HETEROTROFICZNYCH NANOWICIOWCÓW (HNF) (METODA DAPI) Zasada oznaczenia DNA i inne struktury komórkowe obecne w komórkach pierwotniaków po wybarwieniu barwnikiem fluorochromowym DAPI w świetle UV powodują emisję silnie niebieskiego koloru. Pierwotniaki w próbkach wody przesączonych przez filtr membranowy o średnicy porów 1 µm liczy się bezpośrednio na filtrze pod mikroskopem epifluorescencyjnym zaopatrzonym w filtry (ekscytacja 365 nm, emisja 420) dla widma barwnika DAPI. Odczynniki i wyposażenie 1. DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol) 2. Filtry membranowe poliwęglanowe (Poretics) 2 µm, 25 mm, (czarne) 3. Filtry mebranowe celulozowe (Sartorius, Millipore) 2 µm, 25 mm 4. Filtry mebranowe (celulozowe lub poliwęglanowe) 10 µm, 47 mm 5. Szklany zestaw do sączenia próbek wody przez filtry membranowe 25 mm, pojemność 10-50 ml (np. Millipore, Sartorius), zaopatrzony w spiek szklany 6. Szklany zestaw do sączenia próbek wody przez filtry membranowe 47 mm (np. Millipore, Sartorius), zaopatrzony w siatkę teflonową. 7. Mikroskop epifluorescencyjny z lampą UV (powiększenie 1000x, obiektyw imersyjny 100x, okular siatkowy 10x). 8. Nie fluoryzujący olejek imersyjny

Przygotowanie odczynników i roztworów I. Roztwór stężony 500 µg DAPI/ml Rozpuścić 10 mg DAPI w 20 ml wody dest. (przefiltrowanej przez 0.2 µm filtr membranowy). Stężony r-r DAPI podzielić na porcje 1 ml w celu długotrwałego (kilka miesięcy) przechowywania w -20 o C II. Roztwór roboczy 50 µg DAPI/ml 5 ml stężonego r-ru DAPI (I) zmieszać z 45 ml wody dest. (przefiltrowanej przez 0.2 µm). Okres przechowywania w lodówce do 2 tygodni. Uwaga: jeżeli roztwór roboczy DAPI jest przechowywany w lodówce to każdorazowo przed jego użyciem do barwienia należy go przesączyć powtórnie przez filtr 0.2 µm. Barwienie 1. 50 ml próbki wody z pierwotniakami delikatnie przesączyć przez filtr membranowy 10 µm, 47 mm (stosując możliwie najmniejsze podciśnienie). 2 Do badanej próbki wody z pierwotniakami dodać 1 ml roztworu roboczego DAPI (stężenie końcowe barwnika w próbce 1 µg/ml próbki). 3 Barwić przez okres 10-15 min. w temp. pokojowej. Filtracja próbek wody 1. Na szklanym spieku w aparacie do filtracji umieścić zwilżony wodą 2 µm celulozowy filtr membranowy a następnie na jego powierzchni delikatnie umieścić czarny filtr 2 µm błyszczącą stroną do góry. Zamknąć aparat do filtracji. 2. W zależności od spodziewanej ilości wiciowców w badanej próbce delikatnie przesączyć od 10 do 30 ml wybarwionej DAPI próbki wody. 8

Liczenie wybarwionych HNF 1. Na cienkim szkiełku podstawowym umieścić filtr z wybarwionymi pierwotniakami. Dodać kroplę olejku imersyjnego i położyć cienkie szkiełko nakrywkowe. Preparat umieścić pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Intensywność fluorescencji kompleksu DNA-DAPI w komórkach pierwotniaków jest niezmienna pod mikroskopem przez okres do ok. 3 min. Po tym czasie fluorescencja lekko słabnie. 2. Policzyć wiciowce w polu widzenia kamery z wykorzystaniem systemu analizy obrazu NIS element. Obliczenia N Liczba wiciowców (HNF ml -1 ) n średnia liczba HNF policzonych w polu Sf powierzchnia filtra z osadzonymi HNF (mm 2 ) Sk powierzchnia pola, w którym liczono HNF (mm 2 ) V objętość próbki wody przesączonej przez filtr (ml)

APP Autotroficzny składnik mikrobiologicznej sieci troficznej Uwagi ogólne Autotroficzny pikoplankton (APP) w skład, którego wchodzą głównie cyanobakterie i drobne zielenice stanowi najmniejszą frakcję fitoplanktonu (od 0,2 do 2,0 m). APP został odkryty i opisany dopiero pod koniec lat 70-tych przez Johnsona i Sieburtha 1979 oraz Waterburego i in. 1979 a od lat 90tych stał się jednym z rutynowo badanych składników fitoplanktonu. Podobnie jak w przypadku większego fitoplanktonu, APP stanowi poziom producentów pierwotnych przekształcając na drodze fotosyntezy nieorganiczny węgiel i pierwiastki biogenne w związki organiczne. Rozmiar komórek kwalifikuje APP do tej samej grupy wielkościowej co bakterie. Wraz z bakteriami APP dostarcza materię organiczną nanoi mikroplanktonowym konsumentom w obrębie pętli mikrobiologicznej, stanowiąc jednak jej autotroficzny składnik. APP może być również bezpośrednio konsumowany przez wydajnych filtratorów, jak Daphnia należących do makrozooplanktonu, co powoduje skrócenie obiegu materii. Z powodu bardzo małych rozmiarów komórek i w konsekwencji korzystnego stosunku powierzchni do objętości, APP może korzystać ze śladowych stężeń azotu (N) i fosforu (P). Dlatego APP w środowiskach mało żyznych jest konkurencyjny w stosunku do większych glonów. W konsekwencji w ultraoligotroficznych i oligotroficznych regionach mórz i oceanów oraz w oligotroficznych jeziorach, APP może być dominującym producentem pierwotnym decydując o produkcji pierwotnej całego ekosystemu. Z kolei wzrost dostępności związków biogennych powoduje, że APP traci swoją przewagę konkurencyjną na rzecz większych komórek glonowych, a jego udział w łącznej biomasie i produkcji fitoplanktonu maleje. Wraz ze wzrostem statusu troficznego jeziora i spadkiem przezroczystości wody, zmienia się także proporcja pomiędzy cyanobakteriami i eukariotycznym APP oraz pomiędzy cyanobakteriami bogatymi w fikoerytrynę i bogatymi w fikocyaninę (dodatkowe barwniki fotosyntetyczne). APP jest również wrażliwy na zanieczyszczenia, co manifestuje się spadkiem liczebności komórek. Dlatego może być traktowany jako organizm wskaźnikowy 10

dla gradientu troficznego oraz zanieczyszczeń. Rutynowe badania nad składem i dynamiką APP opierają się głównie na analizie mikroskopowej w mikroskopie fluorescencyjnym, jednak poznanie przynależności taksonomicznej i różnorodności APP możliwe jest dopiero po zastosowaniu metod biologii molekularnej i analizie wybranych genów markerowych. Zasada oznaczania Komórki APP są bardzo małe, zwykle kuliste lub owalne o wielkości pomiędzy 0,2 i 2,0 µm i nie posiadają widocznych cech morfologicznych umożliwiających identyfikację taksonomiczną. Identyfikacji i określania liczebności APP dokonuje się na podstawie zdolności komórek APP, a dokładnie barwników fotosyntetycznych zawartych w tych komórkach, do autofluorescencji po pobudzeniu światłem o określonej długości fal. Dlatego do analizy APP nie są potrzebne żadne barwniki fluorochromowe, a tylko mikroskop fluorescencyjny wyposażony w specjalne filtry wzbudzające i blokujące. Stosując zestaw filtrów; niebieski i zielony można odróżnić najczęściej występujące składniki APP tj. zielenice określana jako chlorello-podobne (w literaturze jako Chlorella-like) zawierające głównie chlorofil a i niezawierające barwników fikobilinowych od cyanobakterii, u których fikoerytryna i fikocyjanina maskują autofluorescencję chlorofilu a. Zielenice różnią się ponadto zwykle od cyanobakterii wielkością komórek, lokując się w górnym przedziale wielkości od około 1,5 do 2,0 µm, podczas gdy wielkość cyanobakterii waha się zwykle w granicach od 0,5 do 1,5 µm. Cyanobakterie bogate w fikoerytrynę, jako barwnik dodatkowy, oznaczane są jako umownie jako PE a bogate w fikocyjanię jako PC. Barwnik fotosyntetyczny Filtr niebieski B-2A EX 450-490, DM 505-510, BA 520 Filtr zielony G-2A EX 510-560, DM 580, BA 590 Filtr zielony CY3 (HYQ) EX 530-560, DM 570, BA 573-648 Chlorofil a czerwony czerwony czerwony słabo widoczny Fikoerytryna żółto-pomarańczowy czerwono-pomarańczowy pomarańczowy Fikocyjanina czerwony (słaba autofluorescencja lub brak często niewidoczne) intensywnie czerwony intensywnie czerwony

Odczynniki i wyposażenie 1. Formalina 20%, zbuforowana 2. Woda destylowana 3. Filtry membranowe poliwęglanowe (Poretics lub Nuclepore) 0,2 µm, 25 mm 4. Filtry membranowe celulozowe (Sartorius) 0,2 µm, 25 mm 5. Szklany zestaw do sączenia próbek wody przez filtry membranowe 25 mm pojemność 10-50 ml (np. Millipore, Sartorius), zaopatrzony w spiek szklany lub siatkę 6. Glicerol 50% roztwór wodny 7. Niefluoryzujący olejek immersyjny 8. Mikroskop epifluorescencyjny z lampą halogenową i filtrami wzbudzającymi niebieskim i zielonym (powiększenie 1000x, obiektyw immersyjny 100x, okular siatkowy 10x). Utrwalanie prób 1. Do 50 ml badanej próbki wody z APP w butelce lub małym naczyniu dodać 2,5 ml 20% -zbuforowanej formaliny (końcowe stężenie formaliny 1% ). 2. Przechowywać w lodówce do momentu analizy 12

Filtracja próbek wody 1. Na szklanym spieku w aparacie do filtracji umieścić zwilżony wodą 0,2 µm celulozowy filtr membranowy, a następnie na jego powierzchni delikatnie umieścić czarny filtr 0,2 µm membranowy (zwilżony wodą) błyszczącą stroną do góry. Zamknąć aparat do filtracji. 2. W zależności od oczekiwanego zagęszczenia komórek APP w badanej próbce przesączyć od 5 do 20 ml wody. 3. Po przefiltrowaniu zdjąć czarny filtr z aparatu filtracyjnego i osuszyć na powietrzu Oznaczanie liczebności APP w niebieskim i zielonym świetle wzbudzającym 1. Na cienkim szkiełku podstawowym umieścić kroplę glicerolu a następnie wysuszony filtr z osadzonymi komórkami APP. Dodać kroplę glicerolu i przykryć cienkim szkiełkiem nakrywkowym. Preparat osuszyć przyciskając do papieru laboratoryjnego a następnie na szkiełko nakrywkowe nałożyć kroplę olejku imersyjnego. Preparat umieścić pod mikroskopem epifluorescencyjnym. Intensywność fluorescencji APP jest zmienna i zwłaszcza w świetle niebieskim szybko słabnie. 2. Policzyć komórki APP w całej siatce okularowej, najpierw w świetle zielonym licząc osobno komórki cyanobakterii świecące na pomarańczowo (PE) i czerwono (PC), a następnie w świetle niebieskim większe komórki zielenic. 3. Komórki liczyć na 10-20 polach, lub do uzyskania sumy 400 komórek. Obliczyć średnią liczbę komórek na pole. 4. Przedstawić liczebność (liczba komórek na ml) dla poszczególnych grup, czyli PE, PC oraz Chlorella like oraz jako sumę cyanobakterii i eukaryota.

Przykładowy arkusz dla APP: Stanowisko Grupa - Typ fluorescencji PE Pole widzenia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Średnia PC Chlorella-like 14