Praca oryginalna Original Article

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 50(2): 107-114 Praca oryginalna Original Article Ekspresja cząstek sygnałowych pstat3 i pstat5 w naturalnych limfocytach regulatorowych T CD4 + CD25 + FoxP3 + w szlaku sygnałowym zależnym od interleukiny 2 u chorych na astmę oskrzelową Expression of signaling molecules pstat3 and pstat5 in CD4 + CD25 + FoxP3 + natural regulatory T cells signaling pathway depends on interleukin 2 in patients with bronchial asthma Justyna Andrzejczak 1, Makandjou-Ola Eusebio 1, Łukasz Kraszula 1, Maciej Kupczyk 2, Piotr Kuna 2, Mirosława Pietruczuk 1 1 Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej, II Katedra Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu Medycznego w Łodzi 2 Klinika Chorób Wewnętrznych, Astmy i Alergii, II Katedra Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Streszczenie Wprowadzenie: W patogenezie astmy oskrzelowej szczególną rolę przypisuje się dysfunkcji naturalnych limfocytów regulatorowych T CD4 + CD25 + FoxP3 + (ntreg). Podłoża dysfunkcji komórek ntreg można upatrywać w zaburzeniu wewnątrzkomórkowego przekaźnictwa sygnałowego. Cel badań: Zależność prawidłowej aktywności limfocytów Treg od interleukiny 2 (IL-2) skłoniła do zbadania przebiegu ścieżki sygnałowej IL-2/STAT w astmie oskrzelowej. Stąd celem pracy była ocena ekspresji cząstek sygnałowych pstat3 i pstat5 u chorych na astmę oskrzelową, w zależności od jej ciężkości, przed i po stymulacji limfocytów ntreg IL-2. Materiał i metody: Grupa badana stanowiła 52 pacjentów z astmą oskrzelową (27 z ciężką oraz 25 z umiarkowaną-łagodną postacią choroby). Astma oskrzelowa została rozpoznana u pacjentów zgodnie z obowiązującymi zaleceniami GINA 2012. Do oceny ekspresji cząstek sygnałowych wykorzystano metodę Cytometric Beads Array (CBA) oraz technikę wielokolorowej cytometrii przepływowej. Wyniki: Stwierdzono, że stężenie cząstek pstat3 i pstat5 u chorych na astmę oskrzelową jest obniżone w porównaniu do grupy kontrolnej. Wykazano, że Il-2 istotnie wpływa na wzrost ekspresji molekuły pstat5 tylko u chorych na astmę umiarkowaną-łagodną (p < 0,05). U części pacjentów z astmą ciężką poziom białka pstat3 jest krytycznie niski lub niewykrywalny i nie wzrasta po stymulacji komórek ntreg IL-2. Wnioski: Istnieją różnice w ekspresji cząstek sygnałowych pstat3 i pstat5 pomiędzy chorymi na astmę umiarkowaną-łagodną, ciężką a grupą kontrolną. U niektórych pacjentów z astmą ciężką komórki ntreg nie zawsze odpowiadają na stymulację IL-2. Może to świadczyć o zaburzeniach signalingu komórkowego i stanowić doskonały punkt uchwytu w terapii celowanej astmy oskrzelowej na przyszłość, a zwłaszcza jej ciężkiej postaci opornej na działanie glikokortykosteroidów. (Diagn Lab 2014; 51(2): 107-114) Summary Introduction: A particular role is attributed to dysfunction of naturally occuring CD4 + CD25 + FoxP3 + regulatory T (ntreg) lymphocytes in pathogenesis of bronchial asthma. ntreg cell dysfunction may be due to a disorder of intracellular signal transduction. Aim: The dependence of normal activity of Treg cells on IL-2 led to the examination of the IL-2/STAT signaling pathway in bronchial asthma. Hence, the purpose of the study was to evaluate the expression of pstat3 and pstat5 in patients with asthma before and after stimulation of ntreg lymphocytes with IL-2. Material and methods: The study group included 52 patients with asthma (27 with severe and 25 with mild-moderate disease). Asthma was diagnosed in accordance with current recommendations of GINA, 2012. To evaluate the expression of the signal transducers we used the method of Cytometric Beads Array (CBA), and multi-color flow cytometry technique. Results: The concentration of the signal particles in asthmatics is reduced compared to the control group. It has been shown that IL-2 has a significant impact on the increase in the expression of molecules pstat5 only in patients with mild-moderate asthma (p<0.05). In some patients with severe asthma pstat3 protein level is critically low or undetectable and does not increase after stimulation of ntregs with IL-2. Conclusions: There are differences in the expression of pstat3 signal transduction particles and pstat5 between patients with mild to moderate and severe asthma. In some patients with severe asthma ntreg cells do not always respond to IL-2. This may indicate the signal transduction disorders and provide an excellent grip point in targeted therapy of bronchial asthma in the future, especially its severe form resistant to the corticosteroids. (Diagn Lab 2014; 51(2): 107-114) 107

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Słowa kluczowe: astma, IL-2, ntreg, pstat3, pstat5 Key words: asthma, IL-2, ntreg, pstat3, pstat5 Wstęp Astmę oskrzelową definiuje się, jako przewlekłą chorobę zapalną dróg oddechowych z nadreaktywnością oraz zmiennie nasiloną obturacją oskrzeli, ustępującą samoistnie bądź pod wpływem leczenia. Wyróżnia się wiele fenotypów astmy oskrzelowej, co świadczy o znacznej heterogenności tej choroby. Jednak bez względu na atopowe, nieatopowe czy mieszane podłoże astmy oskrzelowej, immunologiczny mechanizm zapalenia przebiega podobnie [1]. Polega on na nadmiernej odpowiedzi komórkowej typu Th2, oraz nadprodukcji cytokin napędzających wytwarzanie immunoglobulin klasy E oraz zapalenie eozynofilowe. Dużą rolę w tym procesie odgrywają naturalne limfocyty regulatorowe T CD4 + CD25 + FoxP3 + (ntreg), które hamują limfocyty efektorowe, jak również inne komórki zapalenia alergicznego [2]. Nabycie funkcji supresorowej przez komórki ntreg wiąże się głównie z aktywacją de novo ekspresji czynnika transkrypcyjnego FoxP3 (forkhead box P3). Aktywacja ta przebiega za pośrednictwem skomplikowanej sieci szlaków sygnałowych, obejmujących kilka czynników transkrypcyjnych, głównie NFAT (nuclear factor of activated T-cells, czynnik transkrypcyjny aktywowanych komórek T), Smad2/Smad3 oraz STAT3 i STAT5 (signal transducers and activators of transcription) [3]. Uważa się, że dysfunkcja limfocytów Treg przyczynia się do rozwoju m.in. chorób alergicznych i astmy [4]. Może ona wynikać z nieprawidłowej odpowiedzi tych komórek na cytokiny, głównie interleukinę 2 (IL-2) oraz TGFβ (transforming growth factor beta, transformujący czynnik wzrostu beta). Na szczególną uwagę zasługuje IL-2, która wpływa na powstanie oraz dojrzewanie limfocytów ntreg w grasicy, oraz ma kluczowe znaczenie dla zachowania homeostazy tych komórek na obwodzie [5]. Limfocyty ntreg charakteryzuje stała ekspresja markera CD25, podjednostki α receptora dla IL-2, która wraz z podjednostkami β i γ tworzy receptor o wysokim powinowactwie. Dlatego komórki te mogą odpowiadać nawet na niskie stężenia IL-2 in vivo. Sygnał z receptora dla IL-2 prowadzi głównie do aktywacji kinaz tyrozynowych JAK1 i JAK3 (Janus kinases) z następującą fosforylacją i aktywacją cząstek sygnałowych STAT3 i STAT5, które dimeryzują i wędrują do jądra komórkowego, gdzie inicjują między innymi proces transkrypcji genu FoxP3. Interakcja pomiędzy IL-2 a jej receptorem prowadzi do aktywacji również innych ścieżek sygnałowych z zaangażowaniem kinaz MAPK (mitogen-activated protein kinase) i PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase). Jakkolwiek wcześniejsze badania wykazały dominację aktywacji ścieżki JAK/ STAT, co może wyjaśniać różnice czynnościowe, jaki wywiera IL-2 na limfocyty Treg w porównaniu do komórek efektorowych. Zaobserwowano, że stymulacja limfocytów Treg IL-2 in vitro, już po 2-4 godzinach prowadzi do bezpośredniej indukcji ekspresji genu FoxP3 i nie wymaga proliferacji komórkowej [6]. Wykazano niski odsetek naturalnych limfocytów Treg, a także ich molekuł supresorowych, takich jak GITR (glucocortocoid-induced tumor necrosis factor receptor) czy CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4) oraz czynnika transkrypcyjnego FoxP3, u chorych na ciężką postać astmy oskrzelowej w porównaniu z astmą łagodną/umiarkowaną i grupą kontrolną [7]. Wyniki te świadczą o zaburzeniu funkcji limfocytów ntreg, jednak wciąż brak jest danych literaturowych wyjaśniających przyczynę tego zjawiska. Podłoża dysfunkcji komórek ntreg można upatrywać w zaburzeniu wewnątrzkomórkowego przekaźnictwa sygnałowego. Zależność prawidłowej aktywności limfocytów Treg od IL-2 skłoniła do zbadania przebiegu ścieżki sygnałowej IL-2/STAT w astmie oskrzelowej. Dlatego celem niniejszej pracy była ocena ekspresji ufosforylowanych (aktywnych) cząstek sygnałowych STAT3 i STAT5 (pstat3 i pstat5) po stymulacji limfocytów ntreg IL-2. Jakiekolwiek zaburzenia szlaku sygnałowego dla IL-2 mogą otworzyć możliwość modyfikacji funkcji limfocytów Treg, na przykład poprzez zastosowanie aktywatorów cząstek sygnałowych. Może to stanowić doskonały punkt uchwytu w terapii celowanej i dać duże nadzieje w leczeniu astmy oskrzelowej na przyszłość, a zwłaszcza jej ciężkiej postaci opornej na działanie glikokortykosteroidów. Materiał i metody Grupa badana stanowiła 52 pacjentów z rozpoznaną astmą oskrzelową (27 z ciężką oraz 25 z łagodną postacią choroby) leczonych w Poradni Przyklinicznej Kliniki Chorób Wewnętrznych, Astmy i Alergii, Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego Nr 1w Łodzi. Z doświadczenia wyłączono osoby z niestabilnym stanem klinicznym oraz palące tytoń. Grupa kontrolna to 25 zdrowych, niepalących ochotników, o zbliżonym do grupy badanej rozkładzie wieku i płci. Wszyscy pacjenci podpisali pisemne oświadczenie, wyrażając zgodę na udział w badaniach, po dokładnym zapoznaniu się z celem oraz metodyką eksperymentu. Badania zostały przeprowadzone za zgodą Uczelnianej Komisji Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu Medycznego w Łodzi (numer RNN/14/13/KE). Astma oskrzelowa została rozpoznana u pacjentów w oparciu o wywiad oraz występowanie zmiennie nasilonej obturacji oskrzeli, według obowiązujących zaleceń GINA 2012 (Global Initiative for Asthma) [8]. Stopień ciężkości choroby sklasyfikowano na podstawie kryteriów wyznaczonych przez grupę ekspertów ENFUMOSA (European Network for Understanding Mechanisms of Severe Asthma) [9]. Pacjenci zakwalifikowani do grupy umiarkowanej-łagodnej postaci astmy oskrzelowej otrzymywali maksymalnie 800 μg/d. budezonidu lub beklometazonu, 500 μg/d. flutikazonu albo równoważnika. Pacjenci z ciężką postacią astmy oskrzelowej przyjmowali wysokie dawki glikokortykosteroidów wziewnych ( 1600 μg/d. budezonidu lub beklometazonu, 800 μg/d. flutikazonu lub równoważnika). Długotrwała, doustna steroidoterapia polegała na podawaniu 800 μg/d. budezonidu lub beklometazonu, 400 μg/d. flutikazonu lub równoważnika. Ponadto pacjentów leczono przewlekle długodziałającymi β-agonistami (LABA, long acting b-agonist; formoterol w dawce 9 mcg/dawkę, 2 d. lub salmeterol 50 mcg/dawkę, 2 d.) lub doustną teofiliną (200 300 mg 1 2 108

Diagn Lab 2014; 50(2): 107-114 d.). Podczas rozpoznania ciężkiej postaci astmy oskrzelowej wykluczono czynniki, które mogły wpływać na stopień kontroli choroby, takie jak niestosowanie się do zaleceń lekarskich lub istnienie chorób współtowarzyszących. Pomimo stałej terapii przeciwzapalnej nie udało się uzyskać pełnej kontroli astmy, a w roku poprzedzającym włączenie pacjentów do grupy badanej wystąpiło przynajmniej jedno zaostrzenie astmy oskrzelowej. Wszyscy pacjenci wchodzący w skład grupy badanej, poza terapią steroidową nie przyjmowali innych leków wykazujących działanie immunosupresyjne. Pobieranie materiału i izolowanie komórek jednojądrzastych Materiałem badanym była krew żylna pobrana od pacjentów na wersenian dwupotasowy, w objętości 8 ml. Komórki jednojądrzaste (PBMC, peripheral blood mononuclear cells) wyizolowano w gradiencie gęstości poprzez nawarstwienie próbki krwi pełnej na podłoże Histopaque-1077 oraz wirowanie przez 30 minut przy obrotach 2500 rpm. Liczbę bezwzględną oraz odsetek otrzymanych limfocytów sprawdzono za pomocą analizatora hematologicznego Pentra DX. Czystość komórkowa pozwalająca na przystąpienie do sortowania musiała wynosić 80%. Sortowanie populacji komórek CD4+CD25+ Sortowanie przeprowadzono w procedurze dwustopniowej przy użyciu zestawu do izolacji komórek T CD4 + CD25 + (MACS Miltenyi Biotec). Pierwszy etap polegał na separacji negatywnej, podczas której izolowano limfocyty T CD4 +. Komórki PBMC inkubowano 10 min, w temperaturze 4 C z mieszaniną przeciwciał (anty-cd8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123, TCR γ/δ i CD235a (glikoforyna A)) sprzężonych z biotyną. Następnie dodano przeciwciała anty-biotynowe opłaszczone na kulkach magnetycznych Micro- Beads i inkubowano 15 minut w temperaturze 4 C. Zawiesinę komórek przepuszczono przez kolumnę LD. Limfocyty T CD4 + przepłynęły przez kolumnę i zostały zebrane do probówki. Wszystkie komórki niebędące limfocytami T CD4 + pozostały na kolumnie. Czystość wysortowanej populacji limfocytów CD4 + sprawdzano dokonując pomiaru cytometrycznego (cytometr przepływowy FACS CANTO II), po uprzednim wyznakowaniu przeciwciałami anty-cd4 zgodnie z procedurą firmową (BD Bioscience) (Rycina 1). W drugim etapie przystąpiono do sortowania limfocytów T CD4 + CD25 + w procesie selekcji pozytywnej. Wyizolowane limfocyty T CD4 + inkubowano z kulkami magnetycznymi opłaszczonymi przeciwciałami anty-cd25. Po 15 minutach zawiesinę komórek przepuszczono przez kolumnę LD. Przez kolumnę przepłynęły limfocyty T CD4 + CD25 -. Limfocyty T CD4 + CD25 +, które pozostały na kolumnie, wypłukano do osobnej probówki poprzez zastosowanie buforu i tłoczka. Czystość wysortowanej populacji limfocytów CD4 + CD25 + sprawdzano dokonując pomiaru cytometrycznego (cytometr przepływowy FACS CANTO II), po uprzednim wyznakowaniu przeciwciałami anty-cd4, CD25 zgodnie z procedurą firmową (BD Bioscience) (Rycina 2). Analiza cytometryczna Oceny subpopulacji limfocytów T CD4 + CD25 + FoxP3 + dokonano po uprzednim wyznakowaniu komórek przeciwciałami monoklonalnymi firmy BD Pharminogen: anti-human CD4 sprzężone z AmCyan (klon SK3), anti-human CD25 sprzężone z FITC (klon M-A251). Do 100 μl zawiesiny limfocytów dodano przeciwciała w stężeniu zgodnym z protokołem firmowym (BD Bioscience). Po 20 minutowej inkubacji w ciemności i temperaturze pokojowej (20-25 C) do zawiesiny limfocytów dodano odczynnik Human FoxP3 Buffer A (BD Pharmingen) w celu utrwalenie komórek (10 minut). Następnie zwiększono przepuszczalność błon komórkowych przy użyciu buforu C (BD Pharmingen). Dobrze wymieszaną zawiesinę komórek inkubowano 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodano przeciwciała anti-human FoxP3 sprzężone z V-450 (klon 236A/E7) w stężeniu zgodnym z protokołem firmowym (BD Bioscience). Po 30 minutowej inkubacji w ciemności i temperaturze pokojowej mierzono ekspresję markerów CD4, CD25 oraz FoxP3 przy użyciu cytometru przepływowego BD FACS CANTO II (oprogramowanie FACS DIVA wersja 6.2). Oceny wysortowanej subpopulacji komórek dokonywano w oparciu Rycina 1. Wykres typu dot-plot przedstawiający czystość komórkową po pierwszym etapie sortowania (populacja limfocytów T CD4 + ). Rycina 2. Wykres typu dot-plot przedstawiający czystość komórkową po drugim etapie sortowania (populacja limfocytów T CD4 + CD25 + ). 109

www.diagnostykalaboratoryjna.eu o ekspresję FoxP3. Ponieważ prawie wszystkie komórki (ponad 90%) wykazały fenotyp CD4 + CD25 + FoxP3 + uznano tą populację za naturalne limfocyty T regulatorowe (ntreg) (Ryciny 3, 4 i 5). Rycina 3. Ekspresja antygenów CD4 i CD25 na wysortowanych limfocytach T. Ocenę ekspresji pstat3 i pstat5 w komórkach ntreg CD4 + CD25 + wykonano techniką CBA (Cytometric Bead Array) (BD Bioscience), w 2 układach badawczych: bez i po stymulacji IL-2. Limfocyty ntreg stymulowano w probówkach, przy użyciu IL-2 o stężeniu 10 μg/ ml przez 15 minut według protokołu producenta (BD Bioscience). Stymulacja komórek prowadzi do aktywacji (ufosforylowania) białek STAT3 i STAT5. Podczas krótkiego czasu inkubacji nie dochodzi do syntezy de novo cząstek sygnałowych STAT3 i STAT5. Następnie komórki utrwalono przy użyciu 1% SDS (siarczan dodecylu sodu) oraz inkubowano w łaźni wodnej. W lizatach komórkowych oznaczano aktywne, czyli ufosforylowane cząstki sygnałowe STAT3 oraz STAT5 (pstat3 oraz pstat5) z wykorzystaniem zestawu BD CBA (Cytometric Bead Array) Flex Set. Zgodnie z procedurą firmową (BD Bioscience) materiał badany inkubowano z dwoma zestawami mikro-kuleczkek opłaszczonych przeciwciałami Phospho Stat3 (Y705) oraz Phospho Stat5 (Y694) a także przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem, które wiązały wewnątrzkomórkowe białko pstat tworząc kompleks kanapkowy (sandwich complex). Oceny jakościowej (ekspresji cząstek sygnałowych) oraz ilościowej (stężenie białek pstat) dokonano przy użyciu 8 kolorowego cytometru przepływowego BD FACS CANTO II (kanały FL3 i FL4). Mierzono średnią intensywność fluorescencji (MFC mean fluorenscence channel). Stężenie (pg/ml) oznaczanego białka odczytywano z krzywej standardowej sporządzonej na podstawie rozcieńczeń standardu zgodnie z procedurą producenta (BD Bioscience). Przykładowe wyniki badań otrzymane techniką CBA przedstawia rycina 6. Rycina 4. Kontrola dla FoxP3. Rycina 5. Ekspresja FoxP3 w wysortowanych limfocytach T. Rycina 6. Przykładowe wyniki badań otrzymane techniką CBA, A. Rozproszenie przednie (FSC) na rozproszenie boczne (SSC) B. Histogram zliczeń w kanale PE dla pstat3. 110

Diagn Lab 2014; 50(2): 107-114 Rycina 7. Porównanie wskaźnika średniej intensywności fluorescencji (MFI) cząstki sygnałowej pstat3 w limfocytach ntreg przed oraz po stymulacji IL-2, u chorych z astmą ciężką (SA), umiarkowaną-łagodną (MA) oraz w grupie kontrolnej (NC). Rycina 8. Porównanie stężenia białka pstat3 w limfocytach ntreg przed oraz po stymulacji IL-2, u chorych z astmą ciężką (SA), umiarkowaną-łagodną (MA) oraz w grupie kontrolnej (NC). Rycina 9. Porównanie wskaźnika średniej intensywności fluorescencji (MFI) cząstki sygnałowej pstat5 w limfocytach ntreg przed oraz po stymulacji IL-2, u chorych z astmą ciężką (SA), umiarkowaną-łagodną (MA) oraz w grupie kontrolnej (NC). Analiza statystyczna Otrzymane dane zostały opracowane statystycznie za pomocą programu STATISTICA 10.0 PL. Ocenie poddano zmienne ilościowe takie jak mediana, minimum, maksimum oraz dolny i górny kwartyl (na podstawie tych wartości sporządzono wykresy). Do analizy danych zastosowano testy nieparametryczne. Za pomocą testu kolejności par Wilcoxona sprawdzano wpływ obecności stymulatora (IL-2) na komórki. Do porównania trzech grup niezależnych wykorzystano test Kruskala-Wallis a. W celu porównania dwóch grup niezależnych zastosowano test U Manna-Whitneya. Ocenę korelacji przeprowadzono na podstawie współczynnika rang Spearmana. Statystyczną istotność wyniku warunkował poziom istotności p<0,05. Wyniki W grupach chorych na ciężką oraz umiarkowaną-łagodną astmę oskrzelową średnia intensywność fluorescencji (MFC, mean fluorescence channel) oraz stężenie ufosforylowanego białka STAT3 (pstat3), było wyższe w limfocytach ntreg po stymulacji IL-2 w porównaniu do komórek niestymulowanych (Ryc. 7). Stężenie (p<0,001) oraz średnia intensywność fluorescencji (p<0,026) białka pstat3 w stymulowanych limfocytach ntreg istotnie różniło się pomiędzy grupami badanymi (astma ciężka, umiarkowana-łagodna i grupa kontrolna). Zaobserwowano, że różnice te były istotne pomiędzy chorymi na astmę oskrzelową, zarówno ciężką jak i umiarkowaną-łagodną, a grupą kontrolną (p<0,05). Nie wykazano jednak znamiennie statystycznie różnic pomiędzy astmą umiarkowaną- -łagodną a astmą ciężką (Ryc. 8). Średnia intensywność fluorescencji (MFC) cząstki sygnałowej pstat5 w limfocytach ntreg wykazała istoty wzrost po stymulacji IL-2 u chorych na astmę umiarkowaną-łagodną (p<0,002). Nie stwierdzono jednak znamiennego statystycznie wpływu stymulacji na zwiększenie stężenia białka pstat5 w grupie astmy umiarkowanej-łagodnej oraz wzrostu stężenia i średniej intensywności fluorescencji molekuły pstat5 u chorych na astmę ciężką. Nie wykazano także znaczących różnic średniej intensywności fluorescencji oraz stężenia białka pstat5 w stymulowanych komórkach ntreg pomiędzy badanymi grupami (Ryc. 9). U chorych na ciężką astmę oskrzelową stężenie białka pstat3 dodatnio korelowało ze stężeniem oraz średnią intensywnością fluorescencji (MFC) cząstki sygnałowej pstat5 w stymulowanych limfocytach Treg (R=0,55; p<0,02). Wykazano tu również wprost proporcjonalną zależność między stężeniem a intensywnością fluorescencji molekuły pstat3 w komórkach ntreg po stymulacji IL-2 (R=0,55; p<0,02). Oceniając stymulowane komórki Treg u chorych na astmę 111

www.diagnostykalaboratoryjna.eu umiarkowaną-łagodną wykazano, że intensywność fluorescencji (MFC) cząsteczki sygnałowej pstat5 dodatnio korelowała ze stężeniem oraz średnią intensywnością fluorescencji białka pstat3 (R=0,55; p<0,02) (Ryc. 9). W grupach chorych na astmę ciężką oraz umiarkowaną-łagodną nie zaobserwowano korelacji pomiędzy stężeniem czy średnią intensywnością fluorescencji cząstek pstat3 oraz pstat5 w stymulowanych limfocytach ntreg a ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3. Nie wykazano również zależności pomiędzy stężeniem oraz średnią intensywnością fluorescencji ocenianych molekuł pstat3 i pstat5 a ekspresją powierzchniowych antygenów CD4, CD25 (Ryc. 10). Rycina 10. Porównanie stężenia białka pstat5 w limfocytach ntreg przed oraz po stymulacji IL-2, u chorych z astmą ciężką (SA), umiarkowaną-łagodną (MA) oraz w grupie kontrolnej (NC). Dyskusja Astma oskrzelowa stanowi ogólnoświatowy problem zdrowotny, ekonomiczny oraz społeczny. W Polsce na astmę oskrzelową cierpi około 8% dzieci oraz 5-7% dorosłych. Co roku liczba nowych zachorowań wzrasta. Szczególnym problemem klinicznym jest ciężka astma oskrzelowa, w której może występować oporność na leczenie glikokortykosteroidami [10]. Liczne dane literaturowe potwierdzają niekwestionowaną rolę limfocytów Treg w patogenezie astmy oskrzelowej [11, 12]. Uważa się, że podobnie jak w innych chorobach alergicznych, rozregulowana równowaga immunologiczna z dominacją procesów prozapalnych wynika między innymi z dysfunkcji limfocytów ntreg. Niewiele jednak wiadomo na temat podłoża zaburzenia immunosupresyjnej aktywności tych komórek, w tej grupie chorób [13]. Wcześniejsze badania wykazały istotną różnicę w odsetku limfocytów ntreg CD4 + CD25 + FoxP3 + u pacjentów z astmą ciężką w porównaniu do astmy umiarkowanej-łagodnej oraz grupy kontrolnej [14]. Wyniki innych autorów również potwierdziły, że u chorych na ciężką postać astmy oskrzelowej odsetek limfocytów ntreg jest obniżony, zwłaszcza podczas zaostrzeń choroby [15]. Wciąż jednak nie odkryto mechanizmów prowadzących do zaburzeń aktywności supresorowej limfocytów ntreg w astmie oskrzelowej, a szczególnie w jej ciężkiej postaci. Niezakłócone funkcjonowanie każdej komórki warunkowane jest poprzez prawidłowe odbieranie informacji pochodzących z zewnątrz oraz przekazywanie ich do wnętrza jądra komórkowego. W proces ten zaangażowanych jest wiele substancji sygnałowych (np. cytokiny, hormony i czynniki wzrostu), które poprzez ligację z odpowiednimi receptorami komórkowymi inicjują kaskadowy cykl reakcji polegający na aktywacji kolejnych cząstek białkowych, w wyniku której dochodzi do regulacji ekspresji genów [16]. Uważa się, że w kształtowaniu fenotypu oraz funkcji supresorowej limfocytów ntreg biorą udział cząstki sygnałowe STAT3 i STAT5. Wiadomo, że ekspresja cząstki sygnałowej STAT3 odgrywa kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu limfocytów ntreg in vivo [17]. Badania przeprowadzone przez Kasprzycką i wsp. u pacjentów z chłoniakiem anaplastycznym wytwarzającym kinazę ALK (kinaza chłoniaka anaplastycznego), które posiadają fenotyp limfocytów Treg i wykazują ekspresję genu FoxP3, wykazały bezpośrednie powiązanie pomiędzy aktywacją cząstki sygnałowej STAT3 a ekspresją czynnika transkrypcyjnego FoxP3. ALK wykazuje swoje onkogenne właściwości pośrednicząc w aktywacji cząstki STAT3. Dowiedziono, że niedobór molekuły STAT3 w komórkach chłoniaka skutkował obniżeniem ekspresji FoxP3 [18]. Zaobserwowano również, że ablacja STAT3 przy użyciu krótkołańcuchowych interferujących RNA (sirna) hamuje ekspresję FoxP3 oraz supresyjne właściwości limfocytów ntreg [19]. Brak jest doniesień naukowych na temat zmian w ekspresji FoxP3 u pacjentów z mutacjami genu STAT3 [20]. Natomiast u pacjentów z mutacją genu STAT5 stwierdzono brak ekspresji FoxP3 oraz zaburzoną aktywność supresorową komórek Treg. Stanowi to potwierdzenie kluczowego znaczenia signalingu STAT5 dla ekspresji genu FoxP3 i funkcji limfocytów Treg in vivo [21]. Odkrycia Wuest i wsp. dowodzą, iż szlaki sygnalizacyjne STAT5 dla rodziny cytokin IL-2 oraz wielu innych zależnych od receptora γc (gamma-chain receptor) różnie wpływają na działanie komórek ntreg, zdecydowanie zwiększając ich żywotność oraz regulując ekspresję czynnika transkrypcyjnego FoxP3. Wykazano jednak, że tylko IL-2 silnie indukuje supresorowe funkcje tych limfocytów [22]. Zaobserwowano również, że w warunkach in vitro IL-2 wybiórczo reguluje ekspresję FoxP3 w komórkach T CD4 + CD25 +. W regulację tą zaangażowane są białka STAT3 oraz STAT5, które przyłączają się do wysoce konserwatywnych miejsc wiązania STAT w pierwszym intronie genu FoxP3 [23]. W niniejszej pracy zaobserwowano, że stężenie ufosforylowanego białka STAT3 (pstat3) u chorych na astmę oskrzelową umiarkowaną-łagodną oraz ciężką jest znacznie niższe w porównaniu do grupy kontrolnej. Co więcej, zauważono, że w limfocytach ntreg u części pacjentów z astmą ciężką, poziom aktywnego białka pstat3 jest krytycznie niski lub niewykrywalny (minimum 0,00 pg/ml; maksimum 1,72 pg/ml) (Ryciny 7 i 8). Stwierdzono, że u wszystkich pacjentów z astmą oskrzelową, zarówno umiarkowaną-łagodną jak i ciężką, wystepuje ekspresja aktywnej, czyli ufosforylowanej cząstki sygnałowej STAT5 (pstat5). Niemniej jednak stężenie białka pstat5, w niestymulowanych 112

Diagn Lab 2014; 50(2): 107-114 komórkach Treg, u chorych na astmę oskrzelową jest obniżone w porównaniu do grupy kontrolnej. Najniższą ekspresję białka pstat5 obserwowano w grupie chorych na astmę umiarkowaną- -łagodną (Ryciny 9 i 10). Przyczyną tego zjawiska może być wpływ leczenia glikokortykosteroidami. W poprzednich badaniach zaobserwowano dodatnią korelację pomiędzy odsetkiem limfocytów ntreg a dawką przyjmowanych steroidów wziewnych u pacjentów z astmą ciężką [7]. Wiadomo także, iż poprzez mechanizm zależny od genu FoxP3, glikokortykosterydy oddziaływują na generację komórek Treg. Ponieważ pacjenci z astmą ciężką otrzymują przewlekłą oraz wysokodawkową sterydoterapię, wyjaśnia to różnice pomiędzy widocznie wyższą ekspresją białka pstat5 u tych chorych w porównaniu do grupy pacjentów z astmą umiarkowaną-łagodną. W prezentowanej pracy badano również oddziaływanie stymulacji komórek ntreg interleukiną 2, na ekspresję cząstek sygnałowych pstat3 oraz pstat5. Istotnie statystyczny (p<0,05) okazał się wpływ IL-2 na wzrost średniej intensywności fluorescencji molekuły pstat5 w limfocytach ntreg u chorych na astmą umiarkowaną-łagodną. Pomimo tego wzrost stężenia białka pstat5 w tej grupie pacjentów był nieznamienny. Podobnie, u chorych na astmę ciężką zaobserwowano nieznamienny statystycznie wzrost poziomu białka pstat5 w stymulowanych komórkach ntreg (p = 0,052) (Ryciny 9 i 10). Brak istotności statystycznej można tu tłumaczyć wysoką zmiennością ocenianego parametru oraz zmiennością osobniczą. Stwierdzono również, że po stymulacji komórek ntreg interleukiną 2, poziom białka pstat5 nie różni się istotnie pomiędzy grupami badanymi. Zaobserwowano, że stężenie białka pstat3 u chorych na astmę umiarkowaną-łagodną wzrasta pod wpływem stymulacji komórek ntreg, jednak nie jest to wzrost istotny statystycznie. Zauważono, że niski poziom białka pstat3 nieznamiennie wzrasta u niektórych pacjentów z astmą ciężką po stymulacji komórek ntreg. Niemniej jednak stwierdzono występowanie grupy chorych z krytycznie niskim bądź niewykrywalnym stężeniem białka pstat3 (minimum 0,00; maksimum 2,27), które nie wzrasta pod wpływem stymulacji (Ryciny 7 i 8). Stwierdzono także, że stężenie białka pstat3, po stymulacji komórek, istotnie różniło się pomiędzy badanymi grupami (astma ciężka, astma umiarkowana-łagodna oraz grupa kontrolna) (p<0,05). Różnice te były znamiennie widoczne pomiędzy chorymi na astmę oskrzelową a grupą kontolną (p<0,05). Nie zaobserwowano jednak istotnych różnic w postymulacyjnej ekspresji pstat3 pomiędzy pacjentami z astmą ciężką a astmą umiarkowaną-łagodną. U chorych na astmę ciężką zauważono, że po stymulacji limfocytów ntreg interleukiną 2, stężenie białka pstat3 dodatnio korelowało ze stężeniem oraz intensywnością fluorescencji molekuły pstat5. Podobną zależność zaobserwowano w grupie pacjentów z astmą umiarkowaną-łagodną, gdzie intensywność fluorescencji cząstki pstat5 oceniana po stymulacji komórek wykazywała wprost proporcjonalną zależność od stężenia oraz intensywności fluorescencji białka pstat3. Może to świadczyć o wzajemnym współdziałaniu tych białek w szlaku przekazywania sygnałów. Badania dotyczące cząstek sygnałowych nie należą do badań przeprowadzanych często z uwagi na uwarunkowania co do procedur technicznych oraz odpowiedniego sprzętu. Nieliczne dane literaturowe dotyczą oceny STAT3 i STAT5 w komórkach Treg u chorych na astmę oskrzelową. Niewiele jest również doniesień naukowych o ekspresji tych cząstek sygnałowych w limfocytach Treg w innych chorobach. Wyniki zaprezentowanych badań wskazują, że istnieją różnice w ekspresji cząstek sygnałowych STAT3 i STAT5 pomiędzy chorymi na astmę umiarkowaną-łagodną, ciężką a grupą kontrolną. U niektórych pacjentów z astmą ciężką komórki ntreg nie zawsze odpowiadają na stymulację IL-2. Może to świadczyć o zaburzeniach przekaźnictwo sygnałowego. Jednak z uwagi na dużą zmienność osobniczą w zakresie ocenianych parametrów należy zachować dużą ostrożność w interpretacji wyników. Z drugiej strony bardzo obiecujące wyniki badań pokazują, że może to stanowić doskonały punkt uchwytu w terapii celowanej astmy oskrzelowej na przyszłość a zwłaszcza jej ciężkiej postaci opornej na działanie glikokortykosteroidów. Wnioski: Średnie stężenia cząstek sygnałowych pstat3 i pstat5 u chorych na astmę oskrzelową są obniżone, szczególnie w ciężkiej postaci choroby. IL-2 istotnie wpływa na wzrost ekspresji molekuły pstat5 tylko u chorych na astmę umiarkowaną-łagodną. U części pacjentów z astmą ciężką poziom białka pstat3 jest krytycznie niski lub niewykrywalny i nie wzrasta po stymulacji komórek ntreg IL-2. Praca finansowana w ramach finansowania badań młodych pracowników nauki i studentów studiów doktoranckich nr 502-03/1-095-05/502-14-113. Piśmiennictwo 1. Global strategy for asthma management and prevention. GINA 2012. 2. Seroogy CM, Gern JE. Mechanisms of asthma and allergic inflammation. J Allergy Clin Immunol 2005; 116, 996-999. 3. Ohkurasend N, Hamaguchi M, Sakaguchi S. FOXP3+ regulatory T cells: control of FOXP3 expression by pharmacological agents. Trends Pharmacol Sci 2011; 32: 158-166. 4. Sakaguchi S, Yamaguchi T, Nomura T i wsp. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell 2008; 133: 775-787. 5. Malek TR, Yu A, Zhu L i wsp. Il-2 family of cytokines in T regulatory cell development and homeostasis. J Clin Immunol 2008; 28: 635-639. 6. Zorn E, Nelson EA, Mohseni M, i wsp. IL-2 regulates FOXP3 expression in human CD4+CD25+ regulatory T cells through a STAT-dependent mechanism and induces the expansion of these cells in vivo. Blood 2006; 10:, 1571-1579. 7. Kraszula Ł, Eusebio M, Kupczyk M, Kuna P, Pietruczuk M. Wykorzystanie wielokolorowej cytometrii przepływowej do identyfikacji markerów czynnościowych limfocytów ntreg u chorych na ciężką astmę oskrzelową. Pneumonol Alergol Pol 2012; 80: 389 401. 8. Global strategy for asthma management and prevention, 2012, http://ginasthma.org 9. The ENFUMOSA cross-sectional European multicentre study of the clinical phenotype of chronic severe asthma. European Network for Understanding Mechanisms of Severe Asthma. Eur Respir J. 2003; 22: 470 477. 10. Chazan R. Rozpoznawanie i postępowanie w astmie w 2012 roku. Pneumonol. Alergol. Pol. 2012; 80: 375 382 11. Durrant DM, Metzger DW. Emerging Roles of T Helper Subsets in the Pathogenesis of Asthma. Immunol Invest 2010; 39:526 549. 113

www.diagnostykalaboratoryjna.eu 12. Robinson DS. Regulatory T cells and asthma. Clin Exp Allergy 2009; 39: 1314 1323. 13. Seroogy CM, Gern JE. The role of T regulatory cells in asthma. J Allergy Clin Immunol 2005; 116: 996-999. 14. Kraszula Ł, Eusebio M, Kupczyk M, Kuna P, Pietruczuk M. Naturalne regulatorowe limfocyty T u chorych na astmę oskrzelową. Diagn lab 2010; 46: 313-318. 15. Xue K, Zhou Y, Xiong S i wsp. Analysis of CD4+ CD25+ regulatory T cells and Foxp3 mrna in the peripheral blood of patients with asthma. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci 2007; 27: 31-33. 16. Wiczyńska B, Rolski J. Terapia celowana Część I. Mechanizmy przesyłania sygnałów przy udziale receptorów o aktywności kinazy tyrozynowej. Wsp Onkol 2007; 11: 331 336. 17. Chaudhry A, RudraD, Treuting P i wsp. CD4+ regulatory T cells control Th17 responses in a STAT3-dependent manner. Science 2009; 326: 986-991. 18. Kasprzycka M, Marzec M, Liu X, Zhang Q, Wasik MA. Nucleoplasmin/anaplastic lymphoma kinase (NPM/ALK) oncoprotein induces the T regulatory cell phenotype by activating STAT3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006; 103: 9964 9969. 19. Pallandre JR, Brillard E, Créhange G i wsp. Role of STAT3 in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory lymphocyte generation: implications in graft-versus-host disease and antitumor immunity. J Immunol 2007; 179: 7593-7604. 20. Holland SM, DeLeo FR, Elloumi HZ i wsp. STAT3 mutations in the hyper-ige syndrome. N Engl J Med 2007; 357: 1608-1619. 21. Cohen AC, Nadeau KC, Tu W i wsp. Cutting edge: decreased accumulation and regulatory function of CD4+CD25(high) T cells in human STAT5b deficiency. J Immunol 2006; 177: 2770. 22. Wuest TY, Willette-Brown J, Durum SK, Hurwitz AA. The influence of IL-2 family cytokines on activation and function of naturally occurring regulatory T cells. J Leukoc Biol 2008; 84: 973-980. 23. Zorn E, Nelson EA, Mohseni M i wsp. IL-2 regulates FOXP3 expression in human CD4+CD25+ regulatory T cells through a STAT-dependent mechanism and induces the expansion of these cells in vivo. Blood 2006; 108: 1571 1579. Adres do korespondencji: mgr Justyna Andrzejczak Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej II Katedra Chorób Wewnętrznych Uniwersytet Medyczny w Łodzi 90-153 Łódź, ul. Kopcińskiego 22 Tel. +48 42 6776981 e-mail: jusand@o2.pl Zaakceptowano do druku: 28.04.2014 114