OD HPLC do UPLC Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska 1
PREHISTORIA 1966 Chromatogram autorstwa L.R.Snyder Analiza chinolin LC-GC North America, 30(4), 328-341, 2012 2
PREHISTORIA 1976 3
HISTORIA 1986 4
HISTORIA 1996 5
DZISIAJ 21 wiek 6
DZISIAJ 7
UPLC UPLC Utra-Performance Liquid Chromatography UHPLC Ultra-High Performance Liquid Chromatography UHPLC Ultra-High Pressure Liquid Chromatography UPLC Ultra-Price Liquid Chromatography ULTRASPRAWNA / ULTRASZYBKA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA 8
UPLC ULTRASPRAWNA / ULTRASZYBKA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA Zwyczajowa nazwa przyjęta dla chromatografii cieczowej z użyciem kolumn o średnicy ziarna wypełnienia < 2µm 9
Czas analizy chromatograficznej w warunkach izokratycznych jest określony przez czas retencji ostatniego piku chromatograficznego L HNreq tr = u (1+k) = u (1+k) L długość kolumny u liniowa prędkość przepływu fazy ruchomej H wysokość półki teoretycznej Nreq wymagana ilość półek teoretycznych 10
Czas analizy chromatograficznej w warunkach izokratycznych jest określony przez czas retencji ostatniego piku chromatograficznego L HNreq tr = u (1+k) = u (1+k) L długość kolumny u liniowa prędkość przepływu fazy ruchomej H wysokość półki teoretycznej Nreq wymagana ilość półek teoretycznych 0 1 2 3 4 5 6 7 8 min 11
Czas retencji analitu L HNreq tr = u (1+k) = u (1+k) L długość kolumny u liniowa prędkość przepływu fazy ruchomej H wysokość półki teoretycznej Nreq wymagana ilość półek teoretycznych H h (~2.2) h = dp H = dp Nreq tr ~ 2.2 (1+k) u dp f(dp) f(u) 12
13
Zwiększenie rozdzielczości Przy zachowaniu długości kolumny chromatograficznej poprzez zmniejszenie średnicy ziarna zwiększa się rozdzielczość 14
Zwiększenie rozdzielczości Przy zachowaniu długości kolumny chromatograficznej poprzez zmniejszenie średnicy ziarna zwiększa się rozdzielczość 15
Sprawność (liczba półek teoretycznych) Długość kolumny [mm] 5µm 3µm 2µm 150 80000 120000 190000 100 67000 80000 160000 50 33000 40000 80000 16
Nreq tr ~ 2.2 (1+k) u dp Prędkość przepływu fazy ruchomej [cm/sec] Zmniejszenie średnicy ziarna skraca czas analizy Zwiększenie prędkości przepływu fazy ruchomej skraca czas analizy 17
Skrócenie czasu analizy 18
Skrócenie czasu analizy Zmniejszenie średnicy ziarna wypełnienia Zwiększenie prędkości przepływu fazy ruchomej ciśnienie [ MPa ] p [ bar ] 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 5 10 15 20 25 dp [ µm ] 19
Pomiędzy HPLC a UPLC Kolumny wypełnione materiałem osadzonym na rdzeniu 20
Skrócenie czasu analizy Dostosowanie sprzętu chromatograficznego odporność na wysokie ciśnienia szybkość zbierania danych sygnałów objętość pozakolumnowa 21
Dostosowanie sprzętu chromatograficznego Automatyczny podajnik próbek Powinien zapewniać małą objętość martwą Odporność na wysokie ciśnienia Skrócić cykl: pobieranie przemywanie igła w gnieździe podanie próbki overlapping Nastrzyk, 30sec nastrzyk analiza Nastrzyk, 10sec nastrzyk analiza Nastrzyk, 10sec plus overlapping nastrzyk analiza nastrzyk analiza nastrzyk nastrzyk analiza nastrzyk nastrzyk analiza nastrzyk analiza analiza 33 % 44 % analiza 22
Dostosowanie sprzętu chromatograficznego Detektor Objętość celi pomiarowej może wpływać na poszerzenie pików chromatograficznych Długa droga światła (10mm, 13µL) Mała transmisja światła duży szum Krótka droga światła (3mm, 2µL) Duża transmisja światła mały szum 23
Dostosowanie sprzętu chromatograficznego Wzrost czułości 24
Dostosowanie sprzętu chromatograficznego Przetwornik analogowo-cyfrowy Szybkość zbierania danych 25
UPLC wybór kolumny Kryterium: CZAS 50mm L Kryterium: ROZDZIELCZOŚĆ 100mm L Zawsze: 2.1mm ID, < 2µm Temperatura: zawsze podwyższona lepkość (ciśnienie) plus kinetyka (czas) 26
1986 45 minut! 27
2011 < 4.5 minuty! 28
Analiza WWA Analiza białek 1. fluorene 2. phenanthrene 3. anthracene 4. fluoranthene 5. pyrene 6. chrysene 7. benzo(b)fluoranthene 8. benzo(k)fluoranthene 9. benzo(g,h,i)perylene Analiza flawonoidów 1.Myricetin 2. Quercetin 3. Apigenin 4. Kaempferol 5. Baicalein 6. Chrysin 7. Acacetin 29
ANALIZA WITAMIN 30
ANALIZA DIURETYKÓW 1 6 4 5 8 2 3 7 1. acetazolamide, 2. hydrochlorothiazide, 3. hydroflumethiazide, 4. clopamide, 5. trichlormethiazide, 6. indapamide, 7. bendroflumethiazide, 8. spironolactone Warunki chromatograficzne: Kolumna: 30mmL x 2.1mm x1.7 μm ACQUITY UPLC C18; 35 C; Elucja: gradient 9 45% (H2O + 0.1% HCOOH ) / ACN; 0.86 ml/min Detekcja: UV 273nm 31
ANALIZA AMINOKWASÓW 32
ANALIZA PEPTYDÓW Kolumna C18: 5μm 70 pików Pojemność pików: 143 Kolumna C18: 1.8μm 168 pików Pojemność pików: 360 33
UPLC SZYBKOŚĆ CZUŁOŚĆ ROZDZIELCZOŚĆ 34
Od HPLC do UPLC Lata 70-te 2004r. 10µm, 5µm, 3,5µm 1,7µm 15-25cm L 2-10cm L 2.1-4.6mm ID 2.1mm ID do 400bar do 1200bar czas analizy 45minut czas analizy 5 minut 35
Waters '1964 Waters ' 2014 36
PRZYSZŁOŚĆ Sprawność [liczba półek teoretycznych / m] 500000 1.0µm 400000 1.4µm 1.7µm 300000 200000 3µm 5µm 10µm 100000 0 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Ciśnienie w układzie chromatograficznym [bar] 37