Endonukleazy restrykcyjne molekularne nożyczki
Inżynieria genetyczna nauka o technikach badawczych pozwalających na ingerencję w materiał genetyczny organizmów w celu wyizolowania i charakterystyki określonych genów oraz zmiany ich właściwości dziedzicznych Dzięki technikom inżynierii genetycznej możemy : izolować z komórki fragmenty materiału genetycznego (geny) powielać geny (klonowanie molekularne) wprowadzać zmiany do informacji genetycznej przenosić fragmenty DNA (geny) do komórek innego organizmu
Nie należy utożsamiać inżynierii genetycznej z biotechnologią Biotechnologia to pojęcie szersze, obejmujące wszelkie manipulacje żywymi organizmami (zwłaszcza mikroorganizmami) w celu osiągnięcia określonych korzyści. Inżynieria genetyczna istnieje od ok. 40 lat, biotechnologia od niepamiętnych czasów Współczesna biotechnologia opiera się w dużej mierze na technikach inżynierii genetycznej. Dzięki nim możliwa jest: heterologiczna ekspresja genów kodujących określone białka zmiana (optymalizowanie) poziomu ekspresji konkretnego genu wprowadzanie celowych zmian sekwencji nukleotydowych powodujących zmiany aminokwasów a co za tym idzie modyfikacje właściwości białka, często ulepszenie funkcjonowania transgeneza bakterii, roślin i zwierząt organizmy genetycznie zmodyfikowane (GMO) terapia genowej
Klonowanie genu ludzkiej insuliny i produkcja zrekombinowanej insuliny w bakteriach Transformation
Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednie narzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw. zrekombinowane DNA (umożliwiają rekombinację materiału genetycznego in vitro czyli w próbówce). Najważniejsze z nich to: enzymy restrykcyjne, ligazy, wektory
Klonowanie genu ludzkiej insuliny i produkcja zrekombinowanej insuliny w bakteriach 1. Wszelkie zabiegi na materiale genetycznym muszą rozpocząć się od jego wyizolowania z komórki. 2. Cząsteczki DNA są następnie dzielone na mniejsze fragmenty za pomocą enzymów restrykcyjnych
Enzymy restrykcyjne jako narzędzie w inżynierii genetycznej i biologii molekularnej
Enzymy restrykcyjne (ER) pod względem biochemicznym to endonukleazy przecinają szkielet cukier-fosforan w DNA ER działają na określone sekwencje w DNA (miejsce rozpoznania): żeby strawić DNA enzym restrykcyjny musi zobaczyć określony ciąg liter Enzym Pochodzenie Miejsce trawienia 5' -->3' Nazewnictwo (Smith i Nathans) Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych opiera się na literowych skrótach, w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii, a druga i trzecia od gatunku. Następna litera oznacza szczep lub typ, a kolejne enzymy z danego typu lub szczepu otrzymują liczby rzymskie. Ava I Anabaena variabilis C* C/T C G A/G G Bam HI Bacillus amyloliquefaciens G* G A T C C Bgl II Bacillus globigii A* G A T C T Eco RI Escherichia coli RY 13 G* A A T T C Eco RII Escherichia coli R245 * C C A/T G G Hae III Haemophilus aegyptius G G * C C Hha I Haemophilus haemolyticus G C G * C Hind III Haemophilus inflenzae Rd A* A G C T T Hpa I Haemophilus parainflenzae G T T * A A C Kpn I Klebsiella pneumoniae G G T A C * C Mbo I Moraxella bovis *G A T C Mbo I Moraxella bovis *G A T C Pst I Providencia stuartii C T G C A * G Sma I Serratia marcescens C C C * G G G SstI Streptomyces stanford G A G C T * C Sal I Streptomyces albus G G * T C G A C Taq I Thermophilus aquaticus T * C G A Xma I Xanthamonas malvacearum C * C C G G G
Podział enzymów restrykcyjnych na klasy I, II i III Główne różnice pomiędzy klasami enzymów ER dotyczą: wzajemnej lokalizacji systemu restrykcji i metylacji DNA W klasie I i III te dwie aktywności są w obrębie jednego kompleksu enzymatycznego, złożonego z dwóch lub trzech heterologicznych podjednostek, w II są rozdzielone lokalizacji miejsca trawienia względem miejsca rozpoznania DNA Enzymy poszczególnych klas różnią się także wymaganiami co do kofaktorów
Endonukleazy restrykcyjne I klasy Aktywność metylacji i ATP-zależnej restrykcji są w tym samym białku Substratem jest dwuniciowy DNA (dsdna) zawierający określoną sekwencję miejsce rozpoznania Enzymy klasy I rozpoznają taką sekwencję Przykłady enzymów I klasy: CfrA1 EcoAI EcoBI EcoKI Ogólnie: GCANNNNNNNNGTGG GAGNNNNNNNGTCA TGANNNNNNNNTGCT AACNNNNNNGTGC 3 nt/6-8 N/4-5 nt - sekwencja rozpoznawana jest asymetryczna przecinają obydwie nici w pewnej odległości (kilkadziesiąt-kilkaset pz) od rozpoznanej sekwencji Do swojej aktywności wymagają S-adenozylo-metioniny (SAM), Mg +2 i ATP.
Endonukleazy restrykcyjne III klasy Substratem jest dsdna Aktywność metylacji i ATP-zależnej restrykcji są w tym samym białku Rozpoznają asymetryczne miejsca 5-7 nukleotydowe: EcoP I AGACC EcoP 15I CAGCAG Hinf III CGAAT przecinają DNA w odległości 24-26 nt od miejsca rozpoznania Wymagają do działania jonów Mg +2 i ATP.
Endonukleazy restrykcyjne II klasy Posiadają rozdzieloną aktywność restryktazy i metylazy, ich geny zwykle sąsiadują w genomie Substratem jest dwuniciowe DNA - dsdna (nieliczne enzymy mogą przecinać określone sekwencje w jednoniciowym ssdna). W większości przypadków enzymy typu II trawią obydwa pasma DNA w obrębie miejsca rozpoznania - krótkiej sekwencji (4-12 nukleotydów) Większość enzymów restrykcyjnych nie przecina zmetylowanego DNA na jednym lub obu pasmach ich miejsca rozpoznania, choć nieliczne wymagają metylacji do aktywności in vitro bezwzględnie wymagają jonów magenzu
Właściwości miejsca rozpoznania ER klasy II Większość miejsc rozpoznania jest ścisłym palindromem z symetrią rotacyjną ma długość 4, 5, 6, 7, 8 nt Niekiedy palindrom może być przerwany przez serie 1-9 dowolnych nt np. Sfi I GGCCNNNNNGGCC Długość sekwencji rozpoznawanej warunkuje częstość trawienia DNA np.: (zakładając że G+C = 50%) enzymy z 8 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co ok. 65 kpz (służą np. do konstrukcji bibliotek genomowych) z 6 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co 4096 bp (4 6 ) (wygodne do klonowania genów) 4 nt sekwencją rozpoznania trawioną DNA z częstością co 256 bp (4 4 ) (tworzenie tzw. odcisków palca DNA fingerpinting)
Enzymy rzadkotnące: Rozpoznają 7-8 nukleotydowe sekwencje np.: SapI 5 - GCTCTTC -3 Sgf1 5 - GCGATCGC -3 Enzymy, które rozpoznają sekwencje bogate w pary GC albo AT SmaI rozpoznaje 5 CCCGGG -3, trawi co 78 kb; NotI rozpoznaje 5 GCGGCCGC 3, trawi co 10 MB.
Niektóre enzymy pochodzące z różnych bakterii rozpoznają identyczne sekwencje, są to tzw. izoschizomery i mogą przecinać te sekwencje w dokładnie taki sam sposób
Neoizoschizomery enzymy rozpoznające taką samą sekwencję, ale przecinające ją w inny sposób. Przykłady: SmaI XmaI SacI SstI EcoICRI Ecl136 5 CCC GGG 3 5 C CCGGG 3 5 GAGCT C 3 5 GAGCT C 3 5 GAG CTC 3 5 GAG CTC 3
Trawienie enzymami restrykcyjnymi tworzy wolne końce DNA Lepkie końce mogą być różnej długości (zwykle są 2 lub 4 nt, ale mogą być także 1 lub 3 nt) i mogą mieć nadmierności typu 5 lub 3, w zależności od użytego enzymu restrykcyjnego. Mogą też tworzyć tępe końce Większość enzymów trawi DNA generując końce z 5 - fosforanem lub 3 OH (wyjątek np. Nci I tworzy końce: 3 -fosforan i 5 -OH)
Jeśli lepkie końce są komplementarne, ligaza może je bardzo łatwo połączyć niezależnie od pochodzenia DNA, tworząc formy rekombinacyjne Możemy łączyć ze sobą również końce tępe ale jest to trochę trudniejsze zrekombinowane DNA
Użycie ER in vitro Czynniki wpływające na aktywność enzymów restrykcyjnych Skład buforu: Enzymy mają różne preferencje jeśli chodzi o siłę jonową (stęż. soli) i kationy (Na lub K). Zwykle pracują w ph 8.0. Bufory są zwykle dostarczane razem z enzymem przez producenta. Źle dobrany bufor powoduje albo brak trawienia albo tzw. częściowe trawienie. można trawić równocześnie kilkoma enzymami dobierając pośrednie warunki reakcji Bufor do przechowywania: Tris-EDTA, EDTA jest inhibitorem działania enzymów restrykcyjnych, ale nie w stężeniach poniżej 0,05 mm Temperatura inkubacji; Większość enzymów pracuje w 37 C. Enzymy izolowane z termofilnych bakterii tną DNA w temp. 50 65 C, inne z bakterii psychrofilnych, ze względu na krótki okres półtrwania, w temp. 25 C. Jednostka aktywności Ilość enzymu potrzebna to strawienia 1μg DNA faga w 60 min, w odpowiedniej temp., w objętości 50 μl
Na wydajność trawienia duży wpływ ma czystość DNA: kontaminacje solami (np. z innych buforów ważne przy wielokrotnych trawieniach), inhibitory, nukleazy mogą powodować trawienie częściowe lub jego kompletny brak DNA Rodzaj użytego DNA Oligonukleotydy i produkty PCR Plazmidowe i fagowe DNA Genomowe DNA (w roztworze) Genomowe DNA w postaci bloczków agarozowych (więcej enzymu, dłuższa inkubacja)
Aktywność gwiaździsta (star activity, relaxation of specificity) Enzym w niestandardowych warunkach tnie DNA w miejscach innych niż miejsce rozpoznania, np. BamHI (GGATCC) może trawić sekwencje: NGATCC, GPuATCC, GGNTCC Niestandardowe warunki to: zbyt długa inkubacja bardzo wysokie stęż. enzymu wysokie ph lub niska siła jonowa, za wysokie stęż. glicerolu, obecność rozpuszczalników organicznych w reakcji (etanol, DMSO) zastąpienie jonów Mg innymi dwuwartościowymi kationami jak Mn lub Co
Zastosowanie enzymów restrykcyjnych 1. Izolacja wybranych fragmentów DNA (np. genów) 2. Rekombinowanie DNA in vitro i klonowanie genów 3. Mapowanie fizyczne genomów 4. Diagnostyka (np. chorób) i identyfikacja (np. ustalanie pokrewieństwa