MODELOWANIE SZLAKÓW METABOLICZNYCH 1. Zagadnienia do samodzielnego przygotowania a. W jakiej postaci gromadzona jest energia w komórce? Dlaczego ATP może wykonać pracę? b. Na czym polega mechanizm syntezy ATP w procesie fosforylacji oksydatywnej (teoria chemiosmotyczna Mitchella)? c. Od czego zależy szybkość reakcji katalizowanej przez enzym? 2. Literatura B. Korzeniewski, Metabolizm, RM-FOSZE, Rzeszów 1996, Rozdział 1 i 3. Książka Metabolizm jest dostępna w postaci pliku PDF na stronie internetowej: http://awe.mol.uj.edu.pl/~benio/ D.G. Nicholls, Bioenergetyka, PWN, Warszawa 1987, Rozdział 1.2 i 3.2. 3. Wstęp Każdy z metabolitów M (związków biorących udział w przemianach biochemicznych komórki, przetwarzanych w szlakach metabolicznych z jednego w drugi poprzez odpowiednie enzymy) jest przez pewne reakcje produkowany (syntetyzowany; ewentualnie - pobierany z otoczenia), podczas gdy inne reakcje zużywają go (przekształcają w inne związki; ewentualnie - usuwają poza komórkę). Ilustruje to następujący schemat: produkcja konsumpcja M W tak zwanym stanie stacjonarnym, typowym dla metabolizmu w organizmach żywych, który nie ulega żadnym zaburzeniom, spełnione są następujące warunki: a.) szybkość produkcji M równa jest szybkości jego zużycia i obie są stałe w czasie; b.) stężenie M również pozostaje stałe, co jest prostą konsekwencją punktu a.). W stanie stacjonarnym następuje zatem stały, jednokierunkowy przepływ strumienia metabolitów przez szlak metaboliczny (np. A B C). Odróżnia go to od stanu równowagi, w którym ma miejsce zerowy przepływ netto, ponieważ szybkość reakcji do przodu jest równa szybkości reakcji wstecz (A B). Stan równowagi właściwie nie występuje w organizmach żywych (które są z natury układami dynamicznymi, strukturami dyssypatywnymi rozpraszającymi energię), można go natomiast z łatwością otrzymać w probówce, kiedy reakcja zajdzie całkowicie, ustali się równowagowa proporcja stężeń substratów i produktów, i nic już się nie będzie działo.
Wracając jednak do stanu stacjonarnego, to ma on miejsce wtedy, kiedy zapotrzebowanie na metabolit M jest stałe, a substraty służące do jego syntezy nie ulegają wyczerpaniu. Z rozmaitych powodów może jednak wzrosnąć (lub zmaleć) zapotrzebowanie komórki na dany metabolit. Wtedy zaczyna on być zużywany z większą (mniejszą) szybkością, niż dotychczas, a więc, mówiąc innymi słowy, następuje aktywacja (lub obniżenie) jego konsumpcji. Oznacza to zaburzenie stanu stacjonarnego. Gdyby nie nastąpiła jednoczesna aktywacja (lub zahamowanie) produkcji M, zostałby on w krótkim czasie całkowicie wyczerpany, ponieważ synteza nie nadążałaby za zużyciem (albo też nagromadziłby się w wielkich ilościach, gdyż synteza przewyższałaby zużycie). Nie leży to oczywiście w interesie komórki, która potrzebuje M w stężeniu wystarczająco wysokim (aby mogły zachodzić reakcje dla których jest on substratem), ale niezbyt wielkim, bo zaburzyłoby to równowagę osmotyczną i doprowadziło do niepotrzebnego nagromadzenia w formie metabolitu M materii, która mogłaby być przekształcona w inne metabolity potrzebne komórce. Z tych powodów, w organizmach żywych występują mechanizmy, które aktywują (w sposób pośredni lub bezpośredni) także produkcję M, kiedy wzrasta jego konsumpcja, a obniżają szybkość syntezy M, kiedy zapotrzebowanie na ten metabolit spada. Tym samym, zapobiegają one wyczerpaniu M lub jego nadmiernemu nagromadzeniu, a także zapewniają dostosowaną do potrzeb komórki szybkość przepływu metabolitów przez szlaki metaboliczne. W ten sposób, mechanizmy te uczestniczą w zachowaniu stałości warunków wewnętrznych w komórce pomimo zaburzeń pochodzących z otoczenia (w tym wypadku: zmieniającego się zapotrzebowanie na poszczególne metabolity). Nazywamy to homeostazą. Po zaburzeniu danego stanu stacjonarnego, w rozpatrywanym przypadku po aktywacji procesu produkcji i/lub konsumpcji M, następuje krótkotrwały stan przejściowy, podczas którego szybkości poszczególnych reakcji oraz stężenia metabolitów ulegają zmianie dopóty, dopóki szybkości produkcji i konsumpcji poszczególnych metabolitów nie wyrównają się na nowym poziomie, a stężenia tych metabolitów nie ustabilizują się przy nowej wartości. Wtedy zostanie osiągnięty nowy stan stacjonarny. Zasadniczo istnieją dwa główne mechanizmy, które mogą aktywować produkcję M, dostosowując ją do szybkości zużycia tego metabolitu warunkowanej aktualnymi potrzebami komórki. Są to: A. Sprzężenie zwrotne ujemne. Szybkość konsumpcji M zostaje bezpośrednio aktywowana (następuje wzrost stałej szybkości tego procesu) przez jakiś sygnał zewnętrzny X. W miarę zużycia M jego stężenie spada. Ponieważ wysokie [M] hamuje blok reakcji prowadzących do jego syntezy (hamowanie przez produkt), spadek stężenia M powoduje aktywację (odblokowanie) procesu produkcji M. To z kolei prowadzi do wzrostu stężenia M, a więc do częściowej kompensacji spadku tego stężenia spowodowanego wzrostem konsumpcji M. Spadek [M] powoduje, iż
wzrost konsumpcji M (a więc także wzrost przepływu metabolitów przez drogę biochemiczną) jest mniejszy, niż wynikałoby to ze stopnia aktywacji konsumpcji M przez X. W przypadku mechanizmu sprzężenia zwrotnego ujemnego proces produkcji M nie jest aktywowany bezpośrednio przez zewnętrzny czynnik X, lecz jedynie pośrednio, poprzez spadek [M]. Mechanizm ten prowadzi zatem do częściowego przeciwdziałania spadkowi stężenia M na skutek zwiększonego zapotrzebowania na ten metabolit. Działanie sprzężenia zwrotnego ujemnego ilustruje poniższy schemat: B. Równoległa aktywacja. Czynnik X aktywuje bezpośrednio (zwiększa stałą szybkości reakcji) w takim samym stopniu (tyle samo razy) zarówno produkcję, jak i konsumpcję metabolitu M. W tym wypadku szybkość konsumpcji M, równa w nowym stanie stacjonarnym szybkości przepływu metabolitów przez dany szlak metaboliczny, rośnie w takim samym stopniu, w jakim procesy produkcji i konsumpcji M zostały aktywowane przez zewnętrzny efektor X. Natomiast stężenie M pozostaje niezmienione. Mechanizm równoległej aktywacji ilustruje poniższy schemat: Możliwy jest mechanizm pośredni pomiędzy sprzężeniem zwrotnym ujemnym a równoległą aktywacją, kiedy to produkcja M jest bezpośrednio aktywowana przez zewnętrzny czynnik X, ale w mniejszym stopniu, niż konsumpcja X.
Jednym z najistotniejszych metabolitów (M) produkowanych i konsumowanych w komórce jest uniwersalny nośnik energii, ATP. Zapotrzebowanie na ATP nie jest stałe w czasie. W spoczynkowym stanie stacjonarnym ATP jest zużywane na procesy niezbędne do podtrzymania komórki przy życiu, takich jak synteza białek, kwasów nukleinowych lub transport jonów przez błony komórkowe. Zapotrzebowanie na ATP może wzrosnąć kiedy komórka ma do wykonania jakąś pracę wymagającą energii. Komórka przechodzi wtedy (poprzez stan przejściowy) do aktywnego stanu stacjonarnego, charakteryzującego się zwiększoną konsumpcją i produkcją ATP. Spektakularnym przykładem jest skurcz komórki mięśniowej, podczas którego zużycie ATP może wzrosnąć 100-krotnie (mięśnie szkieletowe ssaków) lub nawet 1000-krotnie (mięśnie skrzydeł owadów) w stosunku do wartości spoczynkowej. Wewnątrz komórki mięśniowej, pobudzonej do skurczu impulsem nerwowym, sygnałem decydującym o przesuwaniu się wobec siebie filamentów miozyny i aktyny (proces zużywający ATP) jest wzrost stężenia jonów wapnia (pełniących rolę czynnika X). Z drugiej strony, ciągle pozostaje tematem debaty naukowej problem w jaki sposób proces fosforylacji oksydatywnej w mitochondriach dowiaduje się o tym, jak szybko powinien on produkować ATP w danej chwili. Zgodnie z powyższym, konkurują ze sobą dwie skrajne koncepcje: A. Sprzężenie zwrotne ujemne. Czynnik X (jony wapnia) aktywuje bezpośrednio jedynie konsumpcję ATP, produkcja ATP jest aktywowana pośrednio poprzez spadek stosunku [ATP]/[ADP], którego wysoka wartość hamuje fosforylację oksydacyjną w mitochondriach. B. Równoległa aktywacja. Czynnik X aktywuje bezpośrednio w podobnym stopniu zarówno konsumpcję, jak i produkcję ATP, zaś stężenie ATP (stosunek [ATP]/[ADP]) utrzymuje się na względnie niezmienionym poziomie. Problem który z powyższych mechanizmów odgrywa zasadniczą rolę, nie doczekał się jeszcze definitywnego rozwiązania na drodze eksperymentalnej. Można jednak rozważyć w sposób teoretyczny który z nich byłby korzystniejszy, czyli bardziej efektywny ze względu na zachowanie homeostazy w komórce. Do oceny efektywności obu mechanizmów mogą posłużyć 3 kryteria: 1. To, który z mechanizmów powoduje większy wzrost szybkości konsumpcji ATP przy tej samej aktywacji konsumpcji ATP (wzroście stałej szybkości konsumpcji ATP). Zakładamy dla potrzeb ćwiczenia, iż czynnik X (jony wapnia) zwiększa stałą szybkości konsumpcji ATP w komórce mięśniowej 80 razy. Oznacza to, iż w czasie skurczu komórka chciałaby zużywać 80 razy więcej ATP w jednostce czasu, niż w stanie spoczynkowym (np. u antylopy w czasie ucieczki przed gepardem). Zachodzi pytanie który z mechanizmów jej na to pozwoli.
2. To, który z mechanizmów powoduje mniejsze zmiany w stężeniu ATP (w stosunku [ATP]/[ADP]). Duży spadek w [ATP] zahamowałby reakcje utrzymujące komórkę przy życiu (synteza białek, kwasów nukleinowych, transport jonów), których przebieg sprzężony jest z hydrolizą ATP. Zahamowanie tych procesów mogłoby doprowadzić do uszkodzenia lub śmierci komórki; 3. To, w którym z mechanizmów występuje krótszy stan przejściowy pomiędzy spoczynkowym stanem stacjonarnym i aktywnym stanem stacjonarnym. Dla homeostazy komórki i całego zwierzęcia istotne jest dostosowanie się do nowych warunków tak szybko, jak to tylko możliwe. Powyższy problem można badać teoretycznie przy pomocy dynamicznego modelu kinetycznego, opisującego w sposób ilościowy procesy produkcji i konsumpcji ATP. W modelu kinetycznym szybkość wszystkich opisywanych procesów (np. reakcji enzymatycznych) jest wyrażona jako funkcja stężeń rozmaitych metabolitów (substratów, produktów, inhibitorów, aktywatorów itp.). Szybkości zmian stężeń poszczególnych metabolitów w czasie są wyrażone w postaci układu równań różniczkowych. Wartości poszczególnych parametrów (szybkości, stężeń) w kolejnych momentach czasowych obliczane są przy pomocy komputera - pozwala to na prześledzenie zmian tych parametrów w czasie. Możemy np. zobaczyć, co się z nimi stanie w momencie wzrostu zapotrzebowania na ATP. W niniejszym ćwiczeniu wykorzystany będzie bardzo uproszczony model produkcji i zużycia ATP w mięśniu. Cele ćwiczenia a. Nauka samodzielnej interpretacji wyników naukowych (w tym przypadku: symulacji komputerowych) oraz samodzielnego formułowania wniosków i rozwiązywania problemów badawczych. b. Pokazanie przydatności komputerowych modeli kinetycznych do rozwiązywania problemów biochemicznych I fizjologicznych. 5. Aparatura Jedyną używaną aparaturą będzie komputer. Symulacje zostaną przeprowadzone przy pomocy programu ATP2, napisanego na użytek ćwiczeń.
6. Opis modelu Model układu produkcji i konsumpcji ATP Równania kinetyczne max [ ADP] vprod = VPROD [ ADP] + K v = k [ ATP] KONS max V PROD KONS Parametry = 10 k KONS = 001. K m = 9 A = 101 [ ATP ] Zmienna niezależna Zmienna zależna m szybkość produkcji ATP szybkość konsumpcji ATP szybkość maksymalna produkcji ATP stała szybkości konsumpcji ATP stała Michaelisa-Menten procesu produkcji ATP ze względu na [ADP] suma stężeń nukleotydów adeninowych: [ATP] + [ADP] stężenie ATP [ ADP] = A [ ATP] stężenie ADP Równanie różniczkowe (szybkość zmiany stężenia ATP w czasie) d[ ATP]/ dt = v v PROD KONS Aktywacja produkcji i konsumpcji ATP konsumpcja * n oznacza, że stała szybkości konsumpcji została zwiększona przez X n razy; produkcja * n oznacza, że szybkość maksymalna produkcji została zwiększona przez X n razy. 7. Wykonanie ćwiczenia a. Włączyć komputer. Wejść do katalogu ATP. Uruchomić program atp2.exe. Po wprowadzeniu stopnia aktywacji produkcji i konsumpcji (podanego dla poszczególnych symulacji w następnych podpunktach) ukaże się wykres przedstawiający zależność wartości szybkości produkcji ATP oraz stosunku [ATP]/[ADP] (oś Y) od czasu (oś X). Umowne jednostki na osi Y odnoszą się zarówno do szybkości konsumpcji ATP, jak i stosunku [ATP]/[ADP]. Końcowe wartości szybkości (ang. rate) oraz stosunku [ATP]/[ADP] są przedstawione w okienkach w górnej części monitora komputera. Aktywacja następuje (o ile w ogóle ma miejsce) w punkcie czasowym 2 (w jednostkach umownych).
b. Przeprowadzić symulację spoczynkowego stanu stacjonarnego, w którym brak jakiejkolwiek aktywacji. Zatem, zarówno konsumpcja, jak i produkcja ATP jest aktywowana 1-krotnie ( * 1) (to właśnie odpowiada brakowi aktywacji). Przerysować otrzymany wykres i zanotować spoczynkowe wartości szybkości zużycia ATP oraz stosunku [ATP]/[ADP]. Opisać, z jakim stanem mamy do czynienia. c. Przeprowadzić symulację aktywacji układu (przejścia do aktywnego stanu stacjonarnego) przy użyciu mechanizmu sprzężenia zwrotnego ujemnego. Aktywujemy konsumpcję ATP 80 razy, natomiast produkcja nie jest bezpośrednio aktywowana (= aktywacja 1 raz). Przerysować otrzymany wykres. Zanotować, jak zmieniły się w wyniku aktywacji: szybkość konsumpcji ATP oraz stosunek [ATP]/[ADP]. Opisać spoczynkowy stan stacjonarny, aktywny stan stacjonarny oraz stan przejściowy. Zmierzyć przybliżoną długość trwania (w jednostkach umownych) stanu przejściowego. d. Przeprowadzić symulację aktywacji układu (przejścia do aktywnego stanu stacjonarnego) przy użyciu mechanizmu równoległej aktywacji. Aktywujemy zarówno konsumpcję, jak i produkcję ATP 80 razy. Przerysować otrzymany wykres. Zanotować, jak zmieniły się w wyniku aktywacji: szybkość konsumpcji ATP oraz stosunek [ATP]/[ADP]. Opisać spoczynkowy stan stacjonarny, aktywny stan stacjonarny oraz stan przejściowy. Zmierzyć przybliżoną długość trwania (w jednostkach umownych) stanu przejściowego. e. Przeprowadzić symulację aktywacji układu (przejścia do aktywnego stanu stacjonarnego) przy użyciu jakiegoś mechanizmu pośredniego pomiędzy sprzężeniem zwrotnym ujemnym i równoległą aktywacją. Wymyślić, ile może wynosić (ilokrotna ma być) aktywacja konsumpcji i produkcji ATP przy takim mechanizmie. Przerysować otrzymany wykres i opisać go analogicznie do dwóch poprzednich wykresów. 8. Opracowanie wyników a. Opisać, jakie zmiany w szybkości konsumpcji ATP oraz w stosunku [ATP]/[ADP] zaszły na czterech powyższych wykresach w czasie trwania symulacji i dlaczego (co spowodowało te zmiany, o ile one zaszły). Skorzystać z kinetycznego opisu modelu przedstawionego powyżej. b. W oparciu o trzy przedstawione wcześniej kryteria zdecydować i uzasadnić, który z analizowanych mechanizmów (sprzężenie zwrotne czy równoległa aktywacja) jest bardziej korzystny ze względu na zachowanie homeostazy oraz funkcjonowanie komórki i dlaczego. UWAGA: Sprawozdania będą oddawane i oceniane w trakcie ćwiczeń.
9. Słowniczek terminów angielskich użytych w programie ATP2 activation - aktywacja arbitrary units - jednostki umowne concentration - stężenie consumption - konsumpcja production - produkcja rate - szybkość