PRACE ORYGINALNE Ma³gorzata GACKA 1 Dorota BEDNARSKA-CHABOWSKA 1 Tadeusz DOBOSZ 2 Stanis³aw SZYMANIEC 3 Urszula JAKOBSCHE 1 Arleta LEBIODA 2 Rajmund ADAMIEC 1 Polimorfizm genu receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów g a procesy immunologiczne w cukrzycy typu 2 wik³anej insulinoopornoœci¹. Doniesienie wstêpne The polymorphism of the peroxisome proliferator-activated receptor g and immunological processes in patients with type 2 diabetes and insulin resistance 1 Katedra i Klinika Angiologii, Nadciœnienia Têtniczego i Diabetologii AM we Wroc³awiu Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Rajmund Adamiec 2 Zak³ad Technik Molekularnych Kierownik: Dr hab. Tadeusz Dobosz prof. nadz. 3 Instytut Immunologii i Terapii Doœwiadczalnej PAN we Wroc³awiu Dodatkowe s³owa kluczowe: PPARg polimorfizm cukrzyca Additional key words: PPARg polymorphism diabetes Adres do korespondencji: Dr n. med. Ma³gorzata Gacka Katedra i Klinika Angiologii, Nadciœnienia Têtniczego i Diabetologii AM 50-326 Wroc³aw, Poniatowskiego 2 e-mail: magacka@poczta.onet.pl Wstêp: Receptor aktywowany przez proliferatory peroksysomów g (PPA Rg), jako czynnik transkrypcyjny, reguluje procesy immunologiczne oraz przemiany metaboliczne istotne dla gospodarki wêglowodanowej i lipidowej. Ró norodne polimorfizmy jego genu mog¹ odgrywaæ decyduj¹c¹ rolê w osobniczej aktywnoœci tego receptora, a tym samym warunkowaæ genetyczn¹ podatnoœæ na rozwój cukrzycy i powik³añ naczyniowych choroby. Cel: Ocena ekspresji genu TNFa w monocytach krwi obwodowej i stê enia TNFa w surowicy krwi oraz autoprzeciwcia³ ICA i anty-gad u osób z rozpoznan¹ cukrzyc¹ typu 2 w zale noœci od polimorfizmu. Pacjenci i metody: U 32 chorych z rozpoznan¹ cukrzyc¹ typu 2 (œrednia wieku 59,0 ± 11 lat) i u 18 osób zdrowych (œrednia wieku 56,5 ± 9,1 lat) okreœlono w monocytach krwi obwodowej polimorfizm [technika badania mutacji punktowych SnaPshot; analizator genetyczny ABI+PRISM310] oraz oceniono ekspresjê genu TNFa metod¹ realtime PCR [Applied Biosystems]. Z kolei we krwi ylnej ponadto oznaczono TNFa [Quantikin Immunoassay, R&D Systems] oraz przeciwcia³a ICA i anty- GAD [metod¹ immunofluorescencyjn¹, DRG]. Wyniki: W grupie 32 chorych z cukrzyc¹ typu 2 stwierdzono u 11 osób heterozygotyczny genotyp, a u 21 homozygotyczny genotyp Pro12Pro. W grupie pacjentów z rozpoznan¹ cukrzyc¹ typu 2 tylko u 6 chorych stwierdzono dodatnie miano przeciwcia³ GAD, a tak e u 6 pacjentów dodatnie miano przeciwcia³ ICA. Stê enia TNFa w surowicy krwi, a tak- e ekspresja genu tej cytokiny w monocytach nie wykazywa³a zwi¹zku z ustalonymi wariantami polimorficznymi PPARg oraz obecnoœci¹ autoprzeciwcia³. Wnioski: 1) Monocytarna eks- Introduction: The peroxisome proliferator-activated receptor g (PPARg), a transcriptor factor, regulates immunological and metabolic processes, which are important for carbohydrate and lipid metabolism. Various polymorphic forms of PPARg may promote diabetes mellitus and diabetic complications. Aim of the work: The assessment of TNFa gene expression in peripheral blood monocytes, serum TNFa concentration and anti-gad and ICA antibodies in relation to the polymorphism in patients with 2 diabetes. Patients and methods. 58 patients with type 2 diabetes (average age 59.0 ± 11 years) and 18 healthy people were examined. The polymorphism of PPARg gene were assessed using mini-sequence technic SnaPshot [ABIPRISM- 310]. The TNFa gene expression were estimated using real-time PCR [Applied Bio-systems]. The TNFa concentration [Quantikin Immunoassay, R&D Systems] and ICA and GAD antibodies [immunofluorescence method, DRG] were evaluated in venous blood. Results: A heterozygotous genotype was estimated in 32 patients and a homozygotous genotype Pro12Pro in 21. Only 6 patients were positive for GAD antibodies and only 6 patients for ICA antibodies. The TNFa concentration in serum and the TNFa gene expression in monocytes did not refer to the Pro12ala polymorphism of PPARg and neither to antibodies. Conclusion: 1) The TNFa concentration in serum and the TNFa gene expression in monocytes do not refer to the Pro12ala polymorphism of PPARg in patients with type 2 diabetes. 2) The genotype do not influence autoimmunologic processes of diabetes. 393
cy jonowymiennej Chelex 100 (SIGMA). Amplifikacjê fragmentów DNA obejmuj¹cych oznaczane polimorfizmy typu SNP przeprowadzono przy u yciu zestawu odczynników QIAGEN PCR Mulitplex Kit (QIAGEN). U ywano nastêpuj¹cych par starterów: PPARG P12A F5'-ACT CTG GGA GAT TCT CCT ATT GAC -3' PPARG P12A R5'-ACC CTT CAA GTC TAA AAA GCC CT-3'. Miejsca polimorficzne oznaczano na dwóch niciach DNA technipresja syntezy TNFa oraz stê enie tej cytokiny w surowicy krwi nie wykazuje zwi¹zku z polimorfizmem genu receptora PPARg u chorych na cukrzycê typu2. 2) Wariant polimorficzny nie usposabia do autoimmunologicznej aktywacji choroby. Wstêp W populacji doros³ych wiod¹c¹ chorob¹ metaboliczn¹ jest cukrzyca typu 2. W jej rozwoju kluczow¹ rolê spe³niaj¹ dwa zasadnicze zaburzenia: i) nieadekwatna odpowiedÿ tkanek na insulinê (insulinoopornoœæ) oraz ii) upoœledzona synteza i wydzielanie insuliny przez komórki beta trzustki. U niewielkiego odsetka doros³ych, u których stwierdza siê obecnoœæ autoprzeciwcia³ przeciwko antygenom wysp trzustkowych, za autodestrukcjê trzustki i niedobór insuliny jest odpowiedzialny proces immunologiczny [9,12]. Publikacje ostatnich lat wskazuj¹, i zmieniona aktywnoœæ receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów g (PPARg) mo e byæ jednym z wa - niejszych czynników wp³ywaj¹cych na rozwój cukrzycy i jej powik³añ naczyniowych [7]. PPARg, kontroluj¹c transkrypcjê wielu bia³ek istotnych dla gospodarki wêglowodanowej i lipidowej, moduluje nie tylko insulinowra liwoœæ, lecz równie szeroko wp³ywa na aktywnoœæ uk³adu immunologicznego. Zastosowanie agonistów tych receptorów w cukrzycy typu 2 powodowa³o obni enie w surowicy stê enia markerów prozapalnych, np. CRP, bia³ych komórek krwi, rozpuszczalnego CD40, MMP-9, amyloid A czy TNFa [6]. Ponadto w modelu zwierzêcym obserwowano zahamowanie nacieku zapalnego limfocytów T wysp trzustkowych pod wp³ywem tej grupy preparatów, co przemawia za ich bezpoœrednim wp³ywem na funkcjê komórek trzustki. [2]. Potwierdzeniem wa nej roli analizowanego receptora w patomechanizmie cukrzycy jest zakoñczony sukcesem terapeutycznym pilota owy program leczenia cukrzycy typu LADA przy ³¹cznym zastosowaniu roziglitazonu (agonist¹ PPARg) i insuliny [17]. Od kilku lat tkanka t³uszczowa jest postrzegana jako Ÿród³o wielu aktywnych substancji, w tym cytokin [15]. Za kontrolê ekspresji g³ównie cytokin prozapalnych wydaje siê byæ odpowiedzialna izoforma 2 recepotora PPARg, zlokalizowana w tkance t³uszczowej [7]. Obecnoœæ form polimorficznych PPARg2, ró ni¹cych siê aktywnoœci¹, mo e we wczesnych etapach, bo ju na poziomie genów wp³ywaæ na osobnicze predyspozycje do rozwoju cukrzycy, zw³aszcza z udzia- ³em procesów autoimmunologicznych. Celem podjêtych badañ by³a ocena stê- enia TNFa w surowicy krwi i ekspresji jego genu w monocytach krwi obwodowej oraz autoprzeciwcia³ ICA i GAD w surowicy krwi chorych na cukrzycê typu 2 w kontekœcie ustalonego polimorfizmu genu receptora PPARg. Tabela I Analiza porównawcza badanych parametrów pomiêdzy grup¹ chorych a grup¹ kontroln¹. Comparison analysis of studied parameters of the study and control group. Grupa kontrolna Grupa chora na cukrzycê typu 2 ] 24,78 ± 3,34 32,71 ± 5,66 0,024 0,81 ± 0,11 0,93 0,048 têtnicze skurczowe [mmhg] têtnicze rozkurczowe [mhg] 129,72 ± 17,78 149,00 ± 19,26 0,001 80,00 ± 9,39 85,19 ± 10,42 0,097 moczowy ] 4,16 ± 1,02 5,24 ± 1,37 0,198 2,85 ± 0,57 3,30 ± 0,46 0,007 LDL ] 88,38 ± 20,73 110,71 ± 27,49 0,003 HDL ] 62,19 ± 14,34 43,09 ± 8,22 ] 143,51 ± 67,62 246,83 ± 168,12 0,006 4,85 ± 0,74 8,23 ± 2,82 7,48 ± 4,03 11,16 ± 6,38 0,019 HOMA-IR 1,58 ± 0,88 4,16 ± 3,06 14,16 ± 4,24 13,60 ± 4,76 0,636 Tabela II Analizowane parametry w zale noœci od obecnoœci przeciwcial ICA w grupie chorych na cukrzycê typu 2. Parameter analisis depending on the presence of antibodies ICA in the group of patients with diabetes 2. ICA (-) N=26 ICA (+) N= 6 Wiek chorych 56,31 ± 8,01 58,00 ± 8,44 0,493 Czas trwania cukrzycy 5,62 ± 4,71 12,67 ± 9,44 0,069 ] 33,14 ± 5,77 30,83 ± 5,15 0,377 0,89 ± 0,05 0,121 têtnicze skurczowe [mmhg] 149,88 ± 20,25 145,17 ± 15,11 0,795 têtnicze rozkurczowe [mhg] 86,15 ± 10,80 81,00 ± 8,00 0,282 moczowy ] 5,11 ± 1,38 5,77 ± 1,30 0,297 3,38 ± 0,47 2,96 ± 0,26 0,044 calkowity ] 208,98 ± 47,32 190,59 ± 3 0,374 LDL ] 111,96 ± 29,69 104,94 ± 14,28 0,614 HDL ] 43,47 ± 8,50 41,08 ± 7,01 0,560 254,56 ± 178,34 213,33 ± 120,63 0,654 8,27 ± 2,83 ± 3,04 0,869 w 2h OGTT [mmol/l] 14,96 ± 4,52 9,44 ± 4,20 0,011 10,59 ± 5,88 13,53 ± 8,35 0,291 w 2h OGTT [mmol/l] 59,96 ± 71,49 31,48 ± 17,44 0,268 3,92 ± 2,55 5,14 ± 4,86 0,864 7,64 8,47 0,206 TNFα [ pg/ml] 13,69 ± 5,14 13,19 ± 2,82 0,818 Pacjenci i metody Badaniami objêto 32 chorych na cukrzycê typu 2 (19 kobiet, 13 mê czyzn; w wieku od 40 do 65lat; œrednia wieku 56,63 ± 7,98 lat i czasem trwania choroby od 5 do lat 27. Chorzy byli leczeni doustnymi preparatami przeciwcukrzycowymi (metformina i/lub sulfonylomocznik i/lub akarboza). Grupê kontroln¹ stanowi³o 18 osób zdrowych (10 kobiet, 8 mê czyzn, œrednia wieku 56,5±9,09 lat ). Osoby z klinicznymi lub laboratoryjnymi (OB, fibrynogen) cechami zapalenia byli wykluczeni z badania. Metoda oznaczania polimorfizmu. Za pomoc¹ negatywnej izolacji magnetycznej na kolumnach LS VarioMacs [firma Miltenyi Biotec] uzyskano rozdzia³ monocytów od innych komórek jednoj¹drzastych. Z 1µl zawiesiny monocytów izolowano DNA przy u yciu ywi- 394 M. Gacka i wsp.
Tabela III Analizowane parametry w zale noœci od obecnosci przeciwcial anty GAD w grupie chorych na cukrzycê typu 2. Analysed parameters depending on the presence of antibodies GAD in the group of patients with diabetes type 2. Anty GAD (-) N=26 Anty GAD (+) N= 6 Tabela IV Analizowane parametry w zale noœci od polimorfizmu genu PPARg w grupie chorych na cukrzycê typu 2. Analysed parameters depending on polimorphism of gene PPARg in the study group with diabetes type 2. k¹ minisekwencjonowania, wykorzystuj¹c SnaPschot Multiplet Kit (Applied Biosystems). oznaczano tetrapleksowo w reakcji ze starterami: 4135303 SNP F 5'-TTA ATG CTT AGC TCG TTG -3' 4135303 SNP R 5'-AGG TTC TGA ACA TGT TTT TAA ATG AAC GCG ATA-3' P12A SNP F5'-(gact)4ACT CTG GGA GAT TCT CCT ATT GAC-3' P12A SNP R5'-(gact)6TGT ATC AGT GAA GGA ATC GCT TTC TG-3'. Rozdzia³ i detekcjê produktów reakcji przeprowadzono podczas elektroforezy Wiek chorych 55,77 ± 8,21 60,33 ± 6,12 0,212 Czas trwania cukrzycy 6,81 ± 6,70 7,50 ± 4,85 0,814 ] 33,52 ± 5,63 29,17 ± 4,62 0,089 0,92 ± 0,09 0,533 têtnicze skurczowe [mmhg] 151,96 ± 18,63 136,17 ± 17,89 0,069 têtnicze rozkurczowe [mhg] 86,58 ± 10,15 79,17 ± 10,21 0,118 moczowy ] 5,36 ± 1,36 4,70 ± 1,38 0,298 3,30 ± 0,40 3,29 ± 0,73 0,971 LDL ] 112,51 ± 29,17 102,40 ± 17,82 0,466 HDL ] 43,84 ± 7,93 39,95 ± 9,44 0,306 Trójglicerydy] 243,75 ± 167,67 260,17 ± 185,49 0,833 8,28 ± 2,23 8,03 ± 4,95 0,850 w 2h OGTT [mmol/l] 13,83 ± 4,44 13,96 ± 7,59 0,958 11,89 ± 6,54 7,34 ± 4,02 0,147 w 2h OGTT [mmol/l] 55,64 ± 70,39 48,22 ± 31,64 0,821 4,38 ± 2,99 3,03 ± 3,56 0,376 7,81 ± 1,77 7,75 0 13,75 ± 4,84 12,94 ± 4,72 0,712 N=11 Pro12Pro N=21 ] 32,14 ± 4,41 33,00 ± 6,29 0,690 0,93 ± 0,08 0,767 têtnicze skurczowe [mmhg] 148,64 ± 14,85 149,19 ± 21,55 0,601 têtnicze rozkurczowe [mhg] 85,91 ± 7,67 84,81 ± 11,76 0,782 moczowy ] 5,26 ± 1,22 5,22 ± 1,47 0,950 3,26 ± 0,35 3,32 ± 0,52 0,731 calkowity ] 207,92 ± 38,77 204,28 ± 48,62 0,831 LDL ] 113,68 ± 25,15 109,30 ± 29,09 0,702 HDL ] 44,89 ± 6,44 42,23 ± 8,96 0,409 238,17 ± 115,52 251,36 ± 192,55 0,565 8,58 ± 2,17 ± 3,15 0,311 w 2h OGTT [mmol/l] 14,50 ± 4,60 13,48 ± 5,20 0,593 10,25 ± 6,47 11,65 ± 6,44 0,444 w 2h OGTT [mmol/l] 43,24 ± 30,95 60,61 ± 78,27 0,869 4,26 ± 3,85 4,11 ± 2,64 0,508 8,80 ± 1,92 7,27 ± 1,41 0,018 13,62 ± 5,55 13,59 ± 4,43 0,991 na kapilarnym analizatorze genetycznym ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Wyniki analizowano wobec wewnêtrznego standardu wielkoœci LIZ-120 korzystaj¹c z programu Analysis Software v.3.1.2. Badanie ekspresji genu TNFa metod¹ real-time PCR. Za pomoc¹ negatywnej izolacji magnetycznej na kolumnach LS VarioMacs [firma Miltenyi Biotec] uzyskano rozdzia³ monocytów od innych komórek jednoj¹drzastych. Ca³kowite RNA izolowano z monocytów za pomoc¹ zestawu E.Z.N.A. Blood RNA Kit (Omega Biotek). Reakcjê odwrotnej transkrypcji wykonywano z u yciem zestawu ThermoScriptTM RT-PCT System (Invitrogen). Uzyskane w ten sposób cdna pos³u y³o do badania ekspresji genów metod¹ real-time PCR, która umo liwia iloœciow¹ ocenê specyficznych sekwencji kwasu nukleinowego w oparciu o detekcjê produktu PCR w czasie rzeczywistym. Iloœæ badanego genu normalizowano w oparciu o gen referencyjny (kontrola endogenna), a nastêpnie odnoszono do kalibratora. Badanie ekspresji genów receptora TNFa metod¹ relative quantification przeprowadzono na aparacie ABI Prism 7900HT Sequence Detection System. Do przeprowadzenia reakcji u yto: cdna jako matrycê, TaqMan Universal PCR Master Mix zawieraj¹cy polimerazê AmliTaq Gold DNA Polymerase, mix dntp, bufor, specyficzne primery i sondê TaqMan MGBTM dla genu receptora TNFa i GAPDH firmy Applied Biosystems: TNFa (Hs00174128m1). Otrzymane wyniki analizowano za pomoc¹ programu SDS 2.1. Wzglêdn¹ ekspresjê genu wyra a wartoœæ DCT. Metoda oznaczanie TNFa w surowicy. Dodatkowo w surowicy pobranym od pacjentów oznaczono za pomoc¹ gotowych zestawów metod¹ immunoenzymatyczn¹ stê enie TNFa [Quantikin Immunoassay ; R&D Systems)]. Metoda oznaczania wybranych autoprzeciwcia³. Przeciwcia³a antygad [EIA-1910, DRG] i ICA [EIA-1594; DRG] badano metod¹ immunofluorescencji poœredniej. Pozosta³e parametry (glikemia, insulinemia, HbA1c, gospodarka lipidowa, fibrynogen, kwas moczowy) oznaczano rutynowymi metodami laboratoryjnymi. U wszystkich chorych i pacjentów dokonano pomiarów antropomtrycznych (, ) oraz ciœnienia têtniczego krwi. Obliczenia statystyczne: Wyniki przedstawiono jako œrednie z odchyleniem standardowym. Do weryfikacji normalnoœci rozk³adu cech wykorzystano test W Shapiro-Wilk. Do oceny ró nic rozk³adu cech pomiêdzy analizowanymi grupami zastosowano t-test Welch'a dla zmiennych niepowi¹zanych oraz test Wilcoxona dla sumy rang. Niezale noœæ cech weryfikowano testem niezale noœci Chi-kwadrat. Si³ê wspó³zale noœci dwóch zmiennych o rozk³adzie normalnym wyra ono wspó³czynnikiem liniowym Pearsona, a istotnoœæ za pomoc¹ wartoœci statystyki t. Dla cech nie wykazuj¹cych rozk³adu normalnego wykorzystano wspó³czynnik korelacji Spearman'a. Wyniki Zestawienie wybranych parametrów antropometrycznych badanej grupy chorych i grupy kontrolnej, wskazuje na istotnie wy- sze u chorych na cukrzycê typu 2 wartoœci (32,71 ± 5,56 vs 24,78 ± 3,34 kg/ m 2 ; p=0,024) i (0,93 vs 0,81 ± 0,11; p=0,048). Ponadto u zakwalifikowanych do badañ pacjentów zarejestrowano znamiennie wy sze œrednie wartoœci ciœnienia skurczowego w porównaniu z grup¹ osób zdrowych (149,00 ± 19,26 vs 129,72 ± 17,78 mmhg; p=0,001). Œrednie wartoœci ciœnienia rozkurczowego w obu grupach nie ró ni³y siê istotnie (85,19 ± 10,42 vs 80,00 ± 9,39 mmhg; p=0,097). Dodatkowo grupa osób chorych na cukrzycê charakteryzowa³a siê wy szym stê eniem triglicerydów (246,83 ± 168,12 vs 143,51 ± 67,62 mmhg; p=0,006), cholesterolu LDL (110,71±27,49 vs 88,38 ± 20,73 mmhg; p=0,003), ni szym HDL (43,09 ± 8,22 vs 62,19 ± 14,34 mmhg; p<0,001) oraz wy szym wskaÿnikiem insulinoopornoœci HOMA-IR (4,16 ± 3,06 vs 1,58 ± 0,88 mmhg; p<0,001). Stê enie TNFa w surowicy krwi nie ró ni³o siê pomiêdzy grupami (14,16 ± 4,24 vs 13,60 ± 4,76 pg/ml; p=0,636) (tabela I). W grupie pacjentów z cukrzyc¹ typu 2 tylko u jednej osoby stwierdzono obecnoœæ przeciwcia³ ICA oraz anty GAD, u 5 pacjen- 395
tów (16% badanych) wykazano wy³¹cznie obecne przeciwcia³a anty GAD oraz u 5 pacjentów (16% badanych) wy³¹cznie przeciwcia³a ICA. Warto podkreœliæ, i tylko jeden pacjent nie spe³nia³ kryteriów zespo³u metabolicznego wg IDF [1]. By³a to osoba, u której wykryto oba rodzaje przeciwcia³ i co ciekawsze przyjmowa³a doustne leki przeciwcukrzycowe od 15 lat. W grupie kontrolnej dodatnie miano przeciwcia³ GAD i ICA stwierdzono odpowiednio u 5 i 2 osób. Pacjenci z cukrzyc¹ typu 2 i obecnymi przeciwcia³ami ICA charakteryzowali siê ni szym stê eniem glukozy w 2h OGTT. Ró nice w stê eniu fibrynogenu pozostawa- ³y w zakresie referencyjnych norm laboratoryjnych. Pozosta³e analizowane parametry nie ró ni³y siê istotnie pomiêdzy podgrup¹ chorych z obecnymi przeciwcia³ami a chorymi, u których tych przeciwcia³ nie wykazano (tabela II). Obecnoœæ przeciwcia³ anty-gad nie wp³ywa³a na analizowane parametry (tabela III). W grupie 32 chorych na cukrzycê typu 2, u 21 osób ustalono heterozygotyczny genotyp, a u 11 homozygotyczny genotyp Pro12Pro. W grupie kontrolnej odpowiednio u 9 osób genotyp i u 9 genotyp Pro12Pro. W obu badanych grupach nie wystêpowa³y homozygoty Ala12Ala. Obecnoœæ polimorficznego wariantu receptora PPRAg wi¹za³a siê z wy szym stê eniem hemoglobiny glikowanej (HbA1c), natomiast ten typ polimorfizmu nie wykazywa³ zwi¹zku ze stê eniem analizowanych parametrów (tabela IV). Czêstoœæ wystêpowania przeciwcia³ ICA i anty GAD wœród pacjentów nie by³a zale - na od wariantów polimorficznych (dla ICA c 2 =1; p=0,952; dla anty GAD c 2 =0,032; p=0,311). Stê enie TNFa w surowicy krwi pacjentów nie zale a³o od ustalonego genotypu ( 13,62 ± 5,55 vs Pro12Pro 13,59 ± 4,43 [pg/ml]; p=0,991), obecnoœci autoprzeciwcia³ anty-gad (anty-gad(-) 13,69 ± 5,14 vs anty-gad(+) 13,19 ± 2,82; p=0,818) czy ICA ICA (-)13,75±4,84 vs ICA(+)12,94 ± 4,72; p=0,712). Wœród badanych pacjentów u 19 (59% badanych) stwierdzono ekspresjê TNFa w monocytach krwi obwodowej, natomiast u pozosta³ych chorych ekspresja genu tej cytokiny by³a nieoznaczalna. Stopieñ ekspresji TNFa w monocytach nie zale a³ od ustalonego genotypu (DCT dla TNFa u pacjentów: z 8,35 ± 1,33 vs Pro12Pro 6,15 ± 1,93; p=0,271), obecaoœci przeciwcia³ anty-gad (DCT dla TNFa u pacjentów: z antygad(-) 6,90±2,09 vs antygad(+) 7,27 ± 1,89; p=0,374), czy ICA (DCT dla TNFa u pacjentów: z ICA (-) 6,740 ± 2,24 vs 7,57 ± 1,12; p=0,4589). U pacjentów z obecn¹ ekspresj¹ genu TNFa w monocytach nie stwierdzono, aby stopieñ ekspresji tej cytokiny korelowa³ ze stê eniem TNFa w surowicy (p=0,538; r-0,13) (rycina1). W grupie kontrolnej ekspresjê genów dla TNFa uzyskano jedynie u dwóch osób (DCT TNFa 6,91 ± 1,53). Zatem, zbyt ma³a liczebnoœæ tej grupy nie zezwala na przeprowadzenie analizy porównawczej z grup¹ chorych na cukrzycê. Tabela V Analizowane parametry w zale noœci od ekspresji TNFalfa w monocycie w grupie chorych na cukrzycê typu 2. Analysed parameters depending on expression of TNFa in monocytes in the group of patients with type 2 diabetes. Rycina 1 Zale noœæ pomiêdzy stê eniem TNFa w surowicy a ekspresj¹ TNFa (DCt) w monocycie. Correlation between the serum concentration of TNFa and expression of TNFa (DCt) in monocytes. Dyskusja Jedn¹ z izoform receptora PPARg jest izoforma-2, wystêpuj¹ca w tkance t³uszczowej. Polimorfizm PPARg2 w sposób istotny wp³ywa na transkrypcjê wielu bia³ek syntetyzowanych w adipocytach. Przyk³adowo u osób obci¹ onych zmutowanym allelem stwierdzono obni on¹ aktywnoœæ oksydazy acyl-coa, a tak e lipazy lipoproteinowej w porównaniu z badanymi o ustalonym genotypie Pro12Pro [11]. Adipocyty s¹ równie ród³em cytokin prozapalnych. Z tego wzglêdu wydawa³oby siê, i równie stê enie tych parametrów mog³oby zale eæ od wariantów polimorficznych Pacjenci z ekspresj¹ TNFalfa w nieoznaczaln¹ monocycie oznaczalna ] 31,00 ± 6,34 33,87 ± 4,98 0,145 0,91 ± 0,06 0,272 têtnicze skurczowe [mmhg] 151,54 ± 23,66 147,26 ± 16,05 0,832 têtnicze rozkurczowe [mhg] 87,69 ± 10,13 83,47 ± 10,53 0,514 Stê enietnfa TNFalfa w surowicy w surowicy [pg/ml] [pg/ml] moczowy ] 4,62 ± 1,01 5,66 ± 1,44 0,036 3,33 ± 0,41 3,27 ± 0,51 0,788 LDL ] 120,82 ± 27,62 103,13 ± 25,65 0,104 HDL ] 43,71 ± 9,06 42,64 ± 7,80 0,483 Trójglicerydy] 215,31 ± 125,40 268,40 ± 192,31 0,388 9,09 ± 3,38 7,65 ± 2,29 0,227 w 2h OGTT [mmol/l] 16,33 ± 4,91 12,21 ± 4,32 0,587 1 ± 7,66 11,32 ± 5,50 0,617 w 2h OGTT [mmol/l] 59,38 ± 70,79 50,88 ± 62,98 0,873 24 22 20 18 16 14 12 10 8 4,36 ± 3,18 4,01 ± 3,06 0,659 7,43 ± 1,40 ± 1,93 0,328 11,99 ± 5,55 14,71 ± 3,90 0,199 y = 16,5171-0,2604*x p=0,538; r=-0,13 6 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ekspresja Ekspresja TNFa TNFalfa w monocycie w monocycie PPARg2. Czêœciowo te przepuszczenia potwierdzi³y badanie Yao i wsp. [14]. W pracy wykazano, i wariant polimorficzny Pro12Pro izoformy PPARg2 wi¹ e siê z wy- szymi wartoœciami wskaÿników zapalnych (CRP, TNFa) u osób ze schy³kow¹ niewydolnoœci¹ nerek. Przeciwnie, w badaniach w³asnych nie wykazano, aby polimorfizm genu PPARg wp³ywa³ istotnie na stê enie TNFa w surowicy krwi. Ponadto nie ustalono zwi¹zku badanego polimorfizmu z obecnoœci¹ autoprzeciwcia³ przeciw antygenom trzustki. St¹d rodzi siê pytanie, sk¹d ta rozbie - noœæ? Nale y rozwa yæ kilka mechanizmów. 396 M. Gacka i wsp.
Pierwszym prostym wyt³umaczeniem jest z pewnoœci¹ specyficzna grupa badanych w pracy Yao i wsp.[14]. W tym programie z badañ zostali wykluczeni chorzy z niewydolnoœci¹ nerek schorzeniem, które w sposób istotny mo e zmieniaæ przebieg wielu procesów metabolicznych w organizmie. Po drugie, nale y zastanowiæ siê nad Ÿród³em badanych cytokin w surowicy krwi jaki odsetek tych cytokin faktycznie pochodzi z tkanki t³uszczowej. Byæ mo e brak istotnych zmian w stê eniu cytokin zale - nych od polimorfizmu wynika z kompensacyjnej aktywnoœci pozosta³ych izoform PPARg, zlokalizowanych w tkance t³uszczowej, miêœniach czy innych tkankach. Brak wp³ywu wariantów polimorficznych na stê enie cytokin prozapalnych mo e stanowiæ wyt³umaczenie nie potwierdzonego przez Blüher i wsp. [3] wp³ywu powy szego polimorfizmu na ryzyko chorób sercowonaczyniowych u osób z cukrzyc¹. Warto podkreœliæ, i jedynym parametrem, który ró ni³ siê pomiêdzy wariatami polimorficznymi we w³asnych badaniach by³o stê enie hemoglobiny glikowanej. Osoby ze zmutowanym allelem () cechowa³o gorsze wyrównanie cukrzycy - wy- sze stê eniem HbA1c. Warto w tym miejscu przytoczyæ interesuj¹ce wyniki pracy Mori i wsp. [10]. Autorzy tego du ego badania japoñskiego (ponad 2000 chorych na cukrzyc¹ typu 2 i ponad 1000 osób zdrowych), poddaj¹c analizie stopieñ wyrównania metabolicznego chorych z dzikim allelem i pacjentów z obecnym zmutowanym allelem Ala stwierdzili równie gorsze wyrównanie metaboliczne u osób z allelem Ala. Jednoczeœnie wykazano rzadsze wystêpowanie allelu Ala u osób z cukrzyc¹. Wci¹ nie wyjaœniony jest mechanizm, w jaki sposób zmutowany allel z jednej strony chroni przed rozwiniêciem cukrzycy, a z drugiej -wp³ywa w momencie wyst¹pienia na jej gorszy przebieg? Bierze siê pod uwagê ochronny wp³yw allelu zmutowanego na komórki trzustkowe w okresie przedcukrzycowym. Tymczasem w etapie rozwiniêtej cukrzycy, byæ mo e z powodu pojawienia siê dodatkowych czynników zwi¹zanych z t¹ chorob¹, allel ten nie chroni, ale nawet sprzyja bardziej chwiejnemu przebiegowi cukrzycy. W³asne wyniki zwracaj¹ uwagê na niewystarczaj¹c¹ wartoœæ jednorazowych oznaczeñ na czczo i poposi³kowych glikemii czy insulinemii. Pomimo istotnej ró nicy stê eñ HbA1c pomiêdzy grupami, nie wykazano istotnych zmian w zakresie glikemii na czczo i poposi³kowej. Z pewnoœci¹ w przysz³oœci nale a³oby porównaæ pomiêdzy obiema grupami ca³odobowy profil glikemii oraz oceniæ rezerwê trzustkow¹ oceniaj¹c C-peptyd na czczo i po obci¹ eniu glukagonem czy insulinê po argininie [5]. Oceniaj¹c grupê badanych pacjentów z obecnymi autoprzeciwcia³ami anty-gad i ICA, nale y podkreœliæ, i nie spe³niali oni kryteriów klinicznych cukrzycy typu LADA - nie ró nili siê od pozosta³ych pacjentów stê- eniem insuliny na czczo i 2 h po posi³ku,,, ciœnieniem têtniczym, HbA1c, gospodark¹ lipidow¹, czasem trwania cukrzycy czy wiekiem ujawnienia siê cukrzycy. Brak zwi¹zku obecnoœci autoprzeciwcia³ z w/w parametrami, jak równie ze stê eniem TNFa w surowicy krwi i ekspresj¹ genu TNFa w monocycie, przemawia za niewielk¹ ich rol¹ w procesach destrukcji komórek trzustki w tej grupie chorych. Byæ mo e jest to wynikiem dominuj¹cego wp³ywu w badanej grupie nadwagi/oty³oœci na stê enie analizowanych cytokin w surowicy krwi, co uniemo liwia uwidocznienie zmian stê enia tych cytokin w zale noœci od procesów autoimmunologicznych w trzustce. Z tego wzglêdu stê enie TNFa, jako marker destrukcji trzustki, mog³oby byæ tylko u yteczne u osób szczup³ych z LADA i cukrzyc¹ typu1. Powy sz¹ tezê zdaj¹ siê potwierdzaæ badania Vatay i wsp. [13], w których wykazano, i wolniejszy przebieg destrukcji trzustki, a tym samym cukrzycy, u pacjentów z LADA w porównaniu z cukrzyc¹ typy 1 mo e byæ zale ny od ni szego stê- enia TNFa. Z kolei wartoœci stê enia tej cytokiny by³y uwarunkowane wariantami polimorficznymi genu dla TNFa. Natomiast w innych badaniach porównuj¹cych osoby z LADA z pacjentami z cukrzyc¹ typu 2 takich zale noœci nie stwierdzano [16]. Analizuj¹c w³asne wyniki zwraca uwagê fakt, e nie stwierdzono korelacji wskaÿnika insulinoopornoœci wg HOMA ze stê eniem w surowicy TNFa u pacjentów z cukrzyc¹ typu 2. Na dodatek stê enie TNFa w surowicy nie odbiega³o od wartoœci w zdrowej grupie kontrolnej. Stawia to pod znakiem zapytania, wiarygodnoœæ i przydatnoœæ kliniczn¹ oceny stê enia tej cytokiny w potwierdzeniu zespo³u insulinoopornoœci. Publikacje ostatnich lat coraz czêœciej podwa aj¹ rolê tej cytokiny jako markera insulinoopornoœci zwi¹zanej z oty³oœci¹ i cukrzyc¹. Przyk³adowo w badaniu Kern i wsp. [8] stwierdzono, i jedynie miejscowa produkcja TNFa oraz stê enie IL-6 w surowicy wykazuj¹ zwi¹zek z inulinoopornoœci¹ u osób oty³ych. Natomiast Carey i wsp. [4] wrêcz uwa aj¹, i zarówno w surowicy stê enie TNFa, jak i Il-6 nie maj¹ zwi¹zku z insulinoopornoœci¹. Aczkolwiek przyznaj¹, i na stê enie IL-6 wp³ywa masa tkanki t³uszczowej chorego. Wnioski 1. Monocytarna ekspresja syntezy TNFa oraz stê enie tej cytokiny w surowicy krwi nie wykazuje zwi¹zku z polimorfizmem genu receptora PPARg u chorych na cukrzycê typu 2. 2. Wariant polimorficzny nie usposabia do autoimmunologicznej aktywacji choroby. Piœmiennictwo 1. Alberti KG., Zimmet P., Shaw J. et al.: The metabolic syndrome-a new worldwide definition. Lancet 2005, 366, 1059. 2. Beales P.E., Pozzilli P.: Thiazolidinediones for the prevention of diabetes in the non-obese diabetic (NOD) mouse: implications for human type 1 diabetes. Diabetes Metab. Res. Rev. 2002, 18, 114. 3. Blüher M., Klemm T., Gerike T. et al.: Lack of association between peroxisome proliferator-activated receptor g-2 gene variants and the occurence of coronary heart disease in patients with diabetes mellitus. Eur. J. Endocrinol. 2002, 146, 545. 4. Carey A.L., Bruce C.R., Sacchetti M. et al.: Interleukin-6 and tumor necrosis factor-a are not increased in patients with Type 2 diabetes: evidence that plasma interleukin-6 is related to fat mass and not insulin responsiveness. Diabetologia 2004, 47, 1029. 5. Carlsson A., Sundkvist G., Groop L. et al.: Insulin and glucagon secretion in patients with slowly progressing autoimmune diabetes (LADA). J. Clin. Endocrinol. Metab. 2000, 85, 76. 6. Chinetti-Gbaguidi G., Fruchart J-C. and Staels B.: Role of the PPAR family of nuclear receptors in the regulation of metabolic and cardiovascular homeo-stasis: new approaches to therapy. Cur. Opin. Pharmacol. 2005, 5, 177. 7. Gacka M., Adamiec R., Dobosz T. i wsp.: Rola receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów g w patogenezie cukrzycy i mia - d ycy. Przegl. Lek. 2004,61, 1436. 8. Kern PA., Ranganathan S., Li C. i wsp.: Adipose tissue tumor necrosis factor and interleukin-6 expression in human obesity and insulin resistance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2001, 280, E745. 9. Matejkova-Behanova M.: Latent autoimmune diabetes in adults (LADA) and autoimmune thyroiditis (minireview). Endocrine regulations 2001, 35, 167. 10. Mori H., Ikegami H., Kawaguchi Y. et al.: The Pro12 -->Ala substitution in PPAR-g is associated with resistance to development of diabetes in the general population: possible involvement in impairment of insulin secretion in individuals with type 2 diabetes. Diabetes 2001, 50, 891. 11. Sanchez J., Rios M., Perez C. et al.: : Effect of the polymorphism of the peroxisome proliferator-activated receptor g-2 gene on adiposity, insulin sensitivity and lipid profile in the Spanish population. Eur. J. Endocrinol. 2000, 147, 495. 12. Schernthaner G., Hink S., Kopp HP. et al.: Progress in the characterization of slowly progressive autoimmune diabetes in adult patients (LADA or type 1,5 diabetes). Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 2001, 109, S94. 13. Vatay A., Rajczy K., Pozsonyi E. et al.: Differences in the genetic background of latent autoimmune diabetes in adults (LADA) and type 1 diabetes mellitus. Immunol Lett. 2002, 84, 109. 14. Yao Q., Nordfors L., Axelsson J. et al.: Peroxisome proliferator-activated receptor g polymorphisms affect systemic inflammation and survival in end-stage renal disease patients starting renal replacement therapy. Atherosclerosis 2005, 182, 105. 15. Trayhurn P., Wood I.S.: Signalling role of adipose tissue: adipokines and inflammation in obesity. Biochem. Soc. Trans. 2005, 33, 1078. 16. Tsiavou1 A., Hatziagelaki E., Chaidaroglou1 A. et al.: TNF-a, TGF-1, IL-10, IL-6, gene polymorphisms in latent autoimmune diabetes of adults (LADA) and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Metab. Res. Rev. 2005, 21, 203. 17. Zhou Z., Li X., Huang G. et al.: Rosiglitazone combined with insulin preserves islet beta cell function in adult-onset latent autoimmune diabetes (LADA). Diabetes Metab. Res. Rev. 2005, 21, 203. 397