PRACE ORYGINALNE. Celem obecnej pracy by³a ocena zmian naczyniowych w obu postaciach twardziny na podstawie okreœlenia stê-

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE Bo ena DZIANKOWSKA-BARTKOWIAK 1 Agnieszka EBROWSKA 2 Ma³gorzata W GROWSKA-DANIELEWICZ 3 Józef KOBOS 4 El bieta WASZCZYKOWSKA 1 Twardzina uk³adowa i ograniczona do skóry zaburzenia w stê eniu wybranych czynników w surowicy odpowiedzialnych za zmiany naczyniowe i ekspresja CD w chorobowo zmienionej skórze Systemic sclerosis and scleroderma circumscripta disturbances of selected serum parameters which are responsible for vascular changes and CD expression in involved skin 1 Zak³ad Immunodermatologii Katedry Dermatologii i Wenerologii Kierownik Zak³adu Immunodermatologii Katedry Dermatologii i Wenerologii UM w odzi: Prof. dr hab. med. El bieta Waszczykowska 2 Katedra Dermatologii i Wenerologii Kierownik Katedry Dermatologii i Wenerologii UM w odzi: Prof. dr hab. med. Anna Sysa-Jêdrzejowska 3 Pracownia Nefropatologii Zak³adu Patomorfologii 4 Zak³ad Immunopatologii Kliniki Dzieciêcej Uniwersytetu dycznego w odzi Dodatkowe s³owa kluczowe: twardzina elatynazy VEGF svegfr2 CD Additional key words: scleroderma gelatinases VEGF svegfr2 CD Praca zosta³a finansowana z funduszy pracy w³asnej Nr i statutowej Nr UM w odzi Adres do korespondencji: Bo ena Dziankowska-Bartkowiak Zak³ad Immunodermatologii Kliniki Dermatologii UM ódÿ, ul. Krzemieniecka 5 Tel./Faks: bozenadz@interia.pl Twardzina jest chorob¹ tkanki ³¹cznej, w której nadmierne w³óknienie w skórze (scleroderma circumscripta morphea) lub w skórze i w narz¹dach wewnêtrznych (twardzina uk³adowa, Systemic sclerosis, ) jest wynikiem z³o onych zaburzeñ naczyniowych, immunologicznych i wzmo onej syntezy kolagenu i innych sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej (extracellular matrix, ECM). Obie postacie twardziny maj¹ podobny obraz kliniczny i histopatologiczny w obrêbie zmian skórnych, jednak ich zwi¹zek patogenetyczny pozostaje nadal dyskutowany. Celem obecnej pracy by³a ocena zmian naczyniowych w obu postaciach twardziny na podstawie okreœlenia stê- enia w surowicy: elatynaz metaloproteinazy -2 i -9 oraz naczyniowoœródb³onkowego czynnika wzrostu (vascular endothelial growth factor VEGF) i 2 rozpuszczalnego receptora (svegfr2) a tak e ekspresji antygenu CD w chorobowo zmienionej skórze. Do badañ zakwalifikowano chorych z i 31 z morphea. Stê enie badanych czynników okreœlano metod¹ immunoenzymatyczn¹ ELISA natomiast ekspresjê CD metod¹ immunohistochemiczn¹. Wykazano znamiennie wy sze stê enie MMP-9 w surowicy chorych na twardzinê uk³adow¹ i morphea w porównaniu do wyników uzyskanych w grupie kontrolnej (848,6 ng/ml; 844,4 ng/ml vs 535,9 ng/ ml p<0,05). Stwierdzono znamiennie (p<0,05) wy sze œrednie stê enie MMP- 2 w surowicy chorych z w stosunku do wyników uzyskanych w morphea i grupie kontrolnej (240,4 ng/ml vs 208,1 ng/ml vs 211,9 ng/ml) oraz VEGF w surowicy chorych z morphea w porównaniu do wyników uzyskanych w grupie kontrolnej (422,2 pg/ml vs. 188,7 pg/ml). Wykazano statystycznie znamienn¹ ró nicê stosunku œrednich stê- Scleroderma is a connective tissue disease characterized by fibrosis confined only to skin (scleroderma circum- -scripta, morphea) or to skin and internal organs (systemic sclerosis, ) as a result of vascular changes, immune dysfunction and increased production of collagen and other extracellular matrix (ECM) components. Both types of scleroderma present clinical and histological similarities in skin changes but their pathogenic relationship is still not elucited. The aim of our study was to evaluate vascular changes in both types of scleroderma on the basis of: serum levels of gelatinases - MMP-2 and MMP-9, vascular endothelial growth factor (VEGF) and its soluble receptor 2 (svegfr2) and expression of CD antigen in skin changed samples. The following patients were involved in the study: patients with, 31 with morphea and healthy controls. Serum levels of selected parameters were estimated by ELISA method; whereas CD antigen immunoexpression was performed by immunohistochemistry. Serum level of MMP-9 was statistically significantly higher in and morphea patients compared to the control group (848.6 ng/ml; ng/ ml vs ng/ml; p<0.05). Statistical analysis revealed that mean serum levels of MMP-2 was significantly (p<0.05) higher in group compared to morphea and control group (240.4 ng/ ml vs ng/ml; ng/ml) and VEGF was higher in morphea group compared to the control group (422.2 pg/ml vs pg/ml). Statistically significant difference between ratio VEGF/ svegfr2 of mean serum levels in patients and the control group (0.038 pg/ml vs pg/ml) and positive correlation between serum levels of MMP-9 and svegfr2 only in control 40 Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 12 B. Dziankowska-Bartkowiak i wsp.

2 eñ VEGF/sVEGFR2 w grupie chorych na twardzinê uk³adow¹ w porównaniu do wyników uzyskanych w grupie kontrolnej (0,038 pg/ml v.s. 0,018 pg/ml) oraz dodatni¹ korelacjê pomiêdzy stê eniem MMP-9 a svegfr2 jedynie w grupie kontrolnej (r=0,143). Immunoekspresjê CD stwierdzono w cytoplazmie komórek œródb³onka naczyñ. Œrednia wartoœæ nasilenia immunoekspresji CD u chorych na twardzinê uk³adow¹ wynios³a 1,59 ± 0,69, w morphea 1,42 ± 0,50 i by³a znamiennie ni sza ni w grupie kontrolnej 2,8 ± 0,42 (p<0,001); nie wykazano znamiennej ró nicy immunoekspresji w wycinkach od chorych na obie postacie twardziny uk³adow¹ i morphea (p=0,27). Uzyskane wyniki wskazuj¹ na podobieñstwa patogenetyczne obu postaci twardziny uk³adowej i ograniczonej do skóry dotycz¹ce uszkodzenia komórek œródb³onka naczyñ krwionoœnych. group (r=0.143) were obtained. Possitive CD expression was found in vascular endothelial cells cytoplasm. an value of immunoexpression of CD was statistically significantly higher in the control group (2.8 ± 0.42) compared to group (1.59 ± 0.69) and morphea (1.42 ± 0.50) (p<0.001). There was no statistically significant difference between immunoexpression of CD in skin samples of both types of scleroderma (p=0.27). The obtained results seem to confirm pathogenic similarities in endothelial cells disturbances in both types of scleroderma and morphea. Wstêp Twardzina (scleroderma) jest chorob¹ tkanki ³¹cznej, która w postaci ograniczonej do skóry (morphea, scleroderma circumscripta) mo e dotyczyæ tylko skóry, tkanki podskórnej, niekiedy miêœni w okolicy zmian skórnych, lub w postaci uk³adowej (Systemic sclerosis, scleroderma ) zajmuje skórê i narz¹dy wewnêtrzne. Twardzina ograniczona ró ni siê od twardziny uk³adowej brakiem objawu Raynauda, zmian w narz¹dach wewnêtrznych oraz odmiennym przebiegiem i rokowaniem [20]. Zwi¹zek pomiêdzy postaci¹ ograniczon¹ a uk³adow¹ twardziny wynika z jednakowego charakteru stwardnieñ i zaników skóry a tak e zbli- onego obrazu histologicznego i mikroskopowoelektronowego []. chanizm powstawania stwardnieñ skóry w przebiegu twardziny pozostaje nadal niedok³adnie poznany. Podkreœlana jest miêdzy innymi istotna rola zaburzeñ autoimmunologicznych i metabolizmu kolagenu [3,30]. Zaniki naczyñ krwionoœnych w miejscach stwardnia³ej skóry s¹ widoczne nie tylko w badaniu histotologicznym, ale równie u chorych z postaci¹ uk³adow¹ w badaniu kapilaroskopowym, gdzie obserwuje siê zanikanie w³oœniczek i obecnoœæ pêtli Raynauda. Jednak e mechanizm zaburzeñ naczyniowych nie jest dok³adnie poznany. Postulowany jest wp³yw uszkodzenia komórek œródb³onka a tak e zaburzeñ powstawania nowych naczyñ krwionoœnych angio- i waskulogenezy []. Spowolnienie przep³ywu krwi, adhezja leukocytów do komórek œródb³onka a nastêpnie ich przenikanie przez œciany naczyñ do tkanek otaczaj¹cych wp³ywa na wzbudzenie stanu zapalnego i pobudzenie fibroblastów do nadmiernej produkcji kolagenu i innych sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej (extracellular matrix ECM) [7,21]. Dotychczasowe badania wskazuj¹, e wœród wielu czynników odpowiedzialnych za zmiany w naczyniach, istotne znaczenie odgrywaj¹ miêdzy innymi: naczyniowo-œrób³onkowy czynnik wzrostu (vascular endothelial growth factor VEGF) i jego receptory oraz enzymy degraduj¹ce ECM metaloproteinazy a zw³aszcza elatynazy, które u³atwiaj¹ diapedezê leukocytów poza naczynia krwionoœne [11,16]. Stwierdzono równie, e zaburzenia ekspresji antygenu CD w komórkach œródb³onka mog¹ byæ jednym z czynników stymuluj¹cych fibroblasty do nadmiernej produkcji ECM [1,28]. Celem obecnej pracy by³a ocena zaburzeñ naczyniowych w obu postaciach klinicznych twardziny na podstawie okreœlenia stê- enia VEGF, jego receptora (soluble vascular endothelial growth factor 2 svegfr2, a tak e dwóch elatynaz metaloproteinazy -2 i -9 (MMP-2 i MMP-9) w surowicy oraz oceny ekspresji antygenu CD w chorobowo zmienionej skórze. Materia³ i metodyka Do badañ zakwalifikowano chorych spe³niaj¹cych kryteria American College of Rheumatology (ACR) dla twardziny uk³adowej [12] (33 kobiety i 1 mê czyzna w wieku od lat œredni wiek 54,4 lata), 31 chorych (30 kobiet i 1 mê czyzna w wieku od do 50 lat œredni wiek 43,8 lat) z klinicznym rozpoznaniem morphea potwierdzonym badaniem histopatologicznym i zdrowych osób ( kobiet i 5 mê czyzn, w wieku lat œredni wiek 38 lata) (tabela I). Oznaczenia stê eñ MMP-2 i MMP-9 oraz VEGF i svegfr2 przeprowadzono u chorych z i z morphea metod¹ immunoenzymatyczn¹ (ELISA) stosuj¹c zestawy odczynników Quantikine firmy R&D Systems Mineapolis USA. Próg czu³oœci ustalono dla: MMP-2 0,16 ng/ml; MMP-9 0,6 ng/ml; dla VEGF 9,0 pg/ ml; svegfr2 4,6 pg/ml. Stê enie badanych parametrów w surowicy zdrowych osób okreœlono w granicach: MMP-2 166,6-269,1 ng/ml; MMP ng/ml; VEGF ,5 pg/ ml; svegfr pg/ml. Badania tkankowe Wycinki ze skóry chorobowo zmienionej, okolicy grzbietu rêki u 27 chorych z i okolicy zmian u 31 chorych z morphea, utrwalono w formalinie i zatopiono w bloczkach parafinowych. Pobrano ponadto wycinki ze skóry od zdrowych osób, z okolicy niezmienionej chorobowo skóry otaczaj¹cej usuwane chirurgicznie znamiona barwnikowe. Immunohistochemia Skrawki parafinowe o gruboœci 3-4 mikrometrów pos³u y³y do sporz¹dzenia rutynowych preparatów barwionych hematoksylin¹ i eozyn¹ (H+E) oraz do badañ immunohistochemicznych w systemie detekcyjnym DAKO EnVision wed³ug metody immunoperoksydazowej, z u yciem pierwotnego, mysiego przeciwcia³a monoklonalnego przeciwko CD firmy Novocastra. Do badañ immunohistochemicznych skrawki parafinowe, po na³o eniu na szkie³ka adhezyjne i wysuszeniu w cieplarce o temperaturze 56 C przez 24 godziny, poddawane by³y odparafinowaniu w szeregu sk³adaj¹cym siê z ksylenów i alkoholi o zmniejszaj¹cych siê stê- eniach (96%, 80%, 70%, 60%). Nastêpnie hamowano aktywnoœæ endogennej peroksydazy, przy u yciu 3% roztworu perhydrolu w metanolu, przez 5 minut. W celu odzyskania antygenowoœci tkanki i otworzenia drogi dla przeciwcia³a przeciwko CD skrawki poddawano trawieniu enzymatycznemu przy u yciu roztworu trypsyny o stê eniu 1 mg/ml w 1 mm HCL, o ph 7,8, w temperaturze 37 C, przez 20 minut. Po trypsynizacji skrawki p³ukano najpierw w wodzie destylowanej, potem w 0,05 M buforze TRIS (TBS) o ph 7,6 przez 5 min. i poddawano je 60 min. inkubacji, w temperaturze pokojowej, w komorze wilgotnej, z odpowiednio rozcieñczonym przeciwcia³em CD 1: 50. Po inkubacji, dwukrotnie p³ukano skrawki w buforze TBS i stosowano dwuetapowy system wizualizacji DAKO EnVision, aby uwidoczniæ reakcjê antygen przeciwcia³o. Pierwszy etap reakcji polega na 30 minutowej inkubacji w w/w warunkach z polimerem znakowanym peroksydaz¹ i zwi¹zanym z wtórnymi, kozimi przeciwcia³ami skierowanymi przeciwko u ytym przeciwcia³om monoklonalnym (mysim). Ostatni etap detekcji jest przyk³adem reakcji enzymatycznej, w której przy zastosowaniu substratu dla peroksydazy tetrachlorku 3,3`diaminobenzydyny (DAB) powstaje barwny produkt (czas inkubacji z roztworem DAB - 5 min.). Po uzyskaniu pozytywnej reakcji immunohistochemicznej podbarwiano j¹dra komórkowe hematoksylin¹ yera (2 min.), a nastêpnie odwadniano skrawki w szeregu alkoholi o rosn¹cych stê eniach (70%, 80%, 96%) i przeprowadzano przez szereg acetonów i ksylenów. Tak przygotowane zatapiano w balsamie kanadyjskim. Kontrolê negatywn¹ metody stanowi³y skrawki, w których zastêpowano pierwotne przeciwcia³a buforem TBS, stosuj¹c dalej opisan¹ procedurê immunohistochemiczn¹. Kontrol¹ pozytywn¹ by³y skrawki daj¹ce znan¹ wczeœniej, silnie pozytywn¹ reakcjê w kierunku badanego antygenu. Ekspresjê oceniano przy u yciu mikroskopu Nikon Microfob FXA (Nikon LTD, Japonia). todyka badañ pó³iloœciowych Nasilenie immunoekspresji CD w wycinkach skóry pobranych od chorych na twardzinê uk³adow¹ i ograniczon¹ oraz w grupie kontrolnej oceniono pó³iloœciowo stosuj¹c nastêpuj¹c¹ skalê: 0 brak odczynu, 1 odczyn s³aby, 2 odczyn mierny, 3 odczyn silny. Dla ka - dej jednostki chorobowej i grupy porównawczej obliczono œrednie wartoœci nasilenia immunoekspresji CD, a wyniki poddano analizie statystycznej. todyka badañ statystycznych Wszystkie dane przedstawiono jako œrednie ± odchylenie standardowe (SD). Korelacje zosta³y ustalone na podstawie testu Manna-Whitney'a i okreœlenia wspó³czynnika rang Spearmana (r). Ró nice pomiêdzy grupami zbadano za pomoc¹ testu t-studenta poprzedzonego ocen¹ rozk³adu i jednorodnoœci wariancji. Wyniki uznano za statystycznie znamienne przy wspó³czynniku istotnoœci statystycznej p<0,05. Wszyscy badani pacjenci oraz osoby zdrowe zosta³y poinformowane o celu badania, wyrazili zgodê na udzia³ w nim. Badania przeprowadzono po uzyskaniu zgody lokalnej Komisji Bioetyki. Wyniki W surowicy chorych na twardzinê uk³adow¹ stê enie badanych parametrów waha³o siê w nastêpuj¹cych granicach: MMP ,6-3,5 ng/ml; MMP ng/ml; VEGF 18, pg/ml; svegfr pg/ml. Natomiast w surowicy Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 12 41

3 Tabela I Charakterystyka kliniczna badanych. Clinical characteristic of examined groups. Tabela II Stê enie MMP-2, MMP-9, VEGF, svegfr2 w surowicy badanych chorych z, morphea i grupie kontrolnej. Serum concentration of MMP-2, MMP-9, VEGF, svegfr2 in, morphea and control group. N - liczba badanych; - mediana; ŒR - œrednia; SD - odchylenie standardowe * - porównanie w stosunku do grupy kontrolnej statystycznie znamienne p<0,05 # - porównanie twardziny uk³adowej do morphea statystycznie znamienne p<0,005 Tabela III. Stosunek MMP-2/MMP-9 i VEGF/sVEGFR2 w twardzinie uk³adowej, morphea i grupie kontrolnej. Ratio of MMP-2/MMP-9 and VEGF/sVEGFR2 in systemic sclerosis, morphea and control group. Badana grupa Twardzina uk³adowa N= N= N= chorych z rozpoznaniem morphea: MMP-2 168,8-296,6 ng/ml; MMP ng/ ml; VEGF 96, pg/ml a svegfr pg/ml (tabela II). Analiza statystyczna uzyskanych wyników wykaza³a, e œrednie stê enie MMP-9 by³o statystycznie wy sze w surowicy chorych na twardzinê uk³adow¹ w porównaniu do wyników uzyskanych w grupie kontrolnej (848,6 ng/ml vs. 535,9 ng/ml; p<0,05) jak równie w surowicy chorych z rozpoznan¹ twardzin¹ ograniczon¹ do skóry ni w grupie kontrolnej (844,4 ng/ml vs. 535,9 ng/ ml; p<0,05). Stwierdzono, e œrednie stê- enie MMP-2 by³o znamiennie wy sze w surowicy chorych z w stosunku do wyników uzyskanych w morphea oraz w grupie kontrolnej (240,4 ng/ml vs. 208,1 ng/ml; 211,9 ng/ml; p<0,05) (tabela II). Œrednie stê- enie VEGF by³o znamiennie statystycznie Dane statystyczne MMP-2/MMP-9 VEGF/sVEGFR2 ŒR ± SD ŒR ± SD ŒR ± SD Twardzina uk³adowa () 0,1188-2,195 0,303 0,431 ± 0,4071 0,173-0,505 0,249 0,286 ± 0,127 0,9-1,511 0,478 0,5712 ± 0,3827 N - liczba badanych; ME - mediana; ŒR - wartoœæ œrednia; SD - odchylenie standardowe * - porównanie w stosunku do grupy kontrolnej statystycznie znamienne p<0,05 badanych 31 P³eæ K/M 33/ 1 30/ 1 / 5 Wiek Œrednia (lata) 38-72; 54, 4-50; 43, ; 38 Czas trwania choroby; Œrednia (lata) 1-20; 1-3; 1, 5 - Total Skin Score (TSS) (pkt) -28; - - Badana grupa Twardzina uk³adowa; N= N= N= ognisk ANA 4 0 Dane statystyczne ŒR±SD ŒR±SD ŒR±SD Badany parametr M MP-2 (ng/ml) M MP-9 (ng/ml) V EGF (pg/ml) svegfr2 (pg/ml) 179,6-3,5 240,4 240,4* ± 35,16 168,8-296,6; 199,5; 208,1# ± 42,7 166,6-269,1 206,7 211,9 ± 29,7 130,0-2140,0 825,5 848,6* ± 455,75 3,0-1191,0; 969,0; 844,4* ± 329,4 174,0-19,0 426,0 535,9 ± 327,9 18,3-1311,0 289,9 367,2 ± 321,9 96,6-1125,0; 4,9; 422,9* ± 8,8 23,0-571,5 1,3 188,7 ± 177,1 5650, ,0 0,0 056,9 ± 1788,7 6270, ,0 9112,5 9022,5 ± 21,5 6730,0-0065,0 9735,0 532,3 ± 264,6 0,0020-0,143 0,028 0,038* ± 0,06 0,009-0,179 0,044 0,054 ± 0,058 0,001-0,051 0, ,018 ± 0,016 wy sze w surowicy chorych z morphea w porównaniu do wyników uzyskanych w grupie kontrolnej (422,2 pg/ml vs. 188,7 pg/ml; p<0,05). Nie stwierdzono ró nic statystycznie istotnych surowiczego stê enia svegfr2 w badanych grupach (tabela II). Dalsza analiza statystyczna wykaza³a statystycznie znamienn¹ ró nicê stosunku œrednich stê eñ VEGF/sVEGFR2 w grupie chorych na twardzinê uk³adow¹ w porównaniu do wyników uzyskanych w grupie kontrolnej (0,038 pg/ml vs. 0,018 pg/ml; p<0,05) (tabela III). Analiza statystyczna wykaza³a istotn¹, dodatni¹ korelacjê pomiêdzy stê eniem MMP-9 a svegfr2 jedynie w grupie kontrolnej (r=0,143; p<0,05). Stwierdzono równie, e zale noœæ pomiêdzy stê eniem VEGF a svegfr2 mia³a dodatni charakter w grupie chorych z i zdrowych osób, natomiast w morphea mia³a ujemny charakter, jednak wyniki te nie by³y statystycznie znamienne (p>0,05) (tabela IV). Wyniki badañ pó³iloœciowych nasilenia immunoekspresji CD przedstawiono w tabeli V. Immunoekspresjê CD stwierdzono w cytoplazmie komórek œródb³onka naczyñ. W wycinkach skóry pobranych od chorych na twardzinê uk³adow¹ nasilenie immunoekspresji CD by³o s³abe w wiêkszoœci preparatów, mierne w skrawkach, a jedynie w 2 przypadkach silne. Œrednia wartoœæ nasilenia immunoekspresji CD u chorych na twardzinê uk³adow¹ wynios³a 1,59 ± 0,69. Badanie immunohistochemiczne wykaza³o u wiêkszoœci chorych w tej grupie obecnoœæ nielicznych naczyñ o w¹skim œwietle. W tkance ³¹cznej podnaskórkowej ogniskowo nie wykazano dodatniej reakcji z przeciwcia³em CD (rycina1). W wycinkach skóry pobranych od chorych na twardzinê ograniczon¹ nasilenie immunoekspresji CD by³o s³abe w wiêkszoœci skrawków, a mierne w 13 przypadkach. W adnym wycinku ze skóry pobranym od chorych na twardzinê ograniczon¹ nie stwierdzono silnego odczynu z przeciwcia³em CD. Œrednia wartoœæ nasilenia immunoekspresji CD u chorych na twardzinê ograniczon¹ wynios³a 1,42 ± 0,50. W skrawkach skóry pobranych od chorych na twardzinê ograniczon¹ stwierdzano naczynia o w¹skim œwietle zatopione w skolagenizowanej skórze. Na doœæ znacznych obszarach odczyn z przeciwcia³em CD nie wykaza³ obecnoœci naczyñ, szczególnie w warstwie podnaskórkowej (rycina 2). Przeprowadzona analiza statystyczna nie wykaza³a znamiennej ró nicy (p=0,27) w nasileniu immunokspresji CD u chorych na twardzinê uk³adow¹ i morphea (tabela V). W skrawkach pochodz¹cych z grupy kontrolnej odczyn by³ silny i wykaza³ obecnoœæ licznych naczyñ o doœæ szerokim œwietle (rycina 3). Jedynie w 2 przypadkach nasilenie odczynu okreœlono jako mierne. Œrednia wartoœæ nasilenia immunoekspresji CD w grupie porównawczej wynios³a 2,8 ± 0,42. Wyniki analizy statystycznej wykaza³y, e w skrawkach z grupy kontrolnej nasilenie immunoekspresji CD by³o znamiennie wiêksze w porównaniu ze skrawkami pobranymi od chorych na twardzinê uk³adow¹ (p<0,001) i ograniczon¹ (p<0,001) (tabela V). Omówienie Patogeneza w³óknienia, które jest zasadniczym objawem twardziny pozostaje niedok³adnie poznana. Wyniki badañ Chunga i wsp. sugeruj¹ udzia³ wielu ró norodnych czynników w tym genetycznych i infekcyjnych [8]. W obu odmianach twardziny uk³adowej i ograniczonej do skóry wykazano równie aktywacjê uk³adu immunologicznego [30]. Stwierdzono, e ograniczony charakter zmian skórnych w morphea mo e wynikaæ z ró nic w zakresie genów odpowiedzialnych za w³óknienie i ró nic w aktywnoœci cytokin [18,19]. Wojas-Pelc i wsp. przedstawiaj¹ dane œwiadcz¹ce o podobnym pod³o u zmian w morphea i twardzinie uk³adowej [31]. Zasadniczymi zjawiskami obserwowanymi w twardzinie s¹ zmiany w ma³ych naczyniach krwionoœnych, 42 Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 12 B. Dziankowska-Bartkowiak i wsp.

4 Tabela IV Zale noœci pomiêdzy VEGF, svegfr2 i MMP-2, MMP-9 w badanych grupach. Correlations between VEGF, svegf, svegfr2 and MMP-2, MMP-9 in examined groups. Badana grupa przewlek³y stan zapalny oraz wzmo ona aktywnoœæ fibroblastów prowadz¹ca do nadmiernego gromadzenia w tkankach kolagenu i innych sk³adników ECM [27]. W obecnej pracy podjêto próbê porównania zaburzeñ naczyniowych w twardzinie uk³adowej i ograniczonej do skóry na podstawie okreœlenia stê enie w surowicy badanych chorych dwóch elatynaz A i B - metloproteinazy -2 i -9 oraz VEGF i svegfr2, a tak e oceny ekspresji antygenu CD na komórkach endotelium w chorobowo zmienionej skórze. taloproteinaza 2 wydzielana jest przez fibroblasty, neutrofile, makrofagi i monocyty, natomiast metaloproteinaza 9 przez monocyty, makrofagi, neutrofile, keratynocyty, fibroblasty, osteoklasty, chondrocyty i komórki œródb³onka [5]. Wskazuje siê, e mog¹ one wp³ywaæ na migracjê komórek miêœni g³adkich i neointimy lub degradacji proteolitycznej blaszki elastycznej [22]. badanych r p VEGF-sVEGFR2 0,059 0,738-0,321 0,482 0,357 0,191 VEGF-MMP-2-0,231 0,189 0,393 0,383 0,043 0,189 VEGF-MMP-9 0,325 0,060 0,179 0,702 0,0 0,702 svegfr2-mmp-2-0,221 0,2-0,071 0,879-0,471 0,076 svegfr2-mmp-9 0,130 0,143 0,143 * - zale noœæ statystycznie znamienna p<0,05 0,463 0,760 0,041* Tabela V Œrednie wartoœci nasilenia immunoekspresji CD w wycinkach skóry w twardzinie uk³adowej i ograniczonej oraz w grupie kontrolnej. an values of intensity of CD immunoexpression in systemic slcerosis, morphea and control group skin samples. Twardzina uk³adowa () badanych C D (ŒR±SD) 1,59 ± 0,69* 1,42 ± 0,50* 2,8 ± 0,42 ŒR - wartoœæ œrednia; SD - odchylenie standardowe * - ró nica statystycznie znamienna w porównaniu do grupy kontrolnej p<0,001 Znane s¹ jednak e wyniki badañ wskazuj¹ce, e wœród endopeptydaz, elatynazy -2 i -9 w szczególny sposób wp³ywaj¹ na degradacjê zdenaturowanego kolagenu. Obie metaloproteinazy trawi¹ równie kolagen typu I, IV g³ówny sk³adnik b³ony podstawnej i agrekany [12]. Niektórzy autorzy stwierdzili, e w fibroblastach pochodz¹cych od chorych na twardzinê uk³adow¹ obserwowano ni sz¹ ekspresjê niektórych kolagenaz [4]. Bogaczewicz i wsp. wykazali jednak wy sze stê enia pro-mmp-9 i MMP-9 w surowicy chorych na twardzinê uk³adow¹ w porównaniu do wyników w grupie zdrowych osób [6]. Yu i wsp. potwierdzili, e obie elatynazy MMP-2 i MMP-9 mog¹ braæ udzia³ w aktywacji latentnej formy TGFb jak te w procesie angiogenezy [32]. Zarówno w twardzinie uk³adowej jak i w morphea udowodniono kluczow¹ funkcjê autokrynnej stymulacji fibroblastów przez Tumor Growth Factor b (TGFb) [2]. Wœród ró norodnych efektów dzia³ania tej cytokiny wykazano równie jej hamuj¹cy wp³yw na proliferacjê komórek œródb³onka, co mo e byæ jedn¹ z wielu przyczyn zanikania kapilarów. W przeciwieñstwie do danych innych autorów [31] w obecnej pracy stwierdzono, e œrednie stê enie MMP-9 by³o znamiennie wy sze w surowicy chorych na twardzinê uk³adow¹ i ograniczon¹ do skóry w porównaniu do wyników uzyskanych w grupie osób zdrowych. Wykazano tak e wy sze œrednie stê enie metaloproteinazy 2 w surowicy chorych na twardzinê uk³adow¹ w stosunku do wyników uzyskanych w grupie badanych chorych z morphea i w grupie kontrolnej. Obserwacja ta wskazuje na istnienie wiêkszych zaburzeñ w sekrecji metaloproteinazy 2 w uk³adowej postaci twardziny. Zwiêkszone wydzielanie obu badanych metaloproteinaz w porównaniu z wynikami uzyskanymi w grupie zdrowych osób potwierdza ich znacz¹c¹ rolê w patogenezie obu postaci twardziny. Wyniki naszych wczeœniejszych badañ przeprowadzone u chorych na twardzinê uk³adow¹ wykaza³y wyraÿn¹ ekspresjê MMP-2 i MMP-9 w porównaniu z wycinkami pochodz¹cymi od osób zdrowych, zlokalizowan¹ w okolicy nielicznych naczyñ krwionoœnych [13]. Uzyskane wyniki potwierdzaj¹ znacz¹cy udzia³ obu elatynaz w powstawaniu zmian naczyniowych, w³óknieniu tkankowym a tak e w nowotworzeniu naczyñ krwionoœnych. Jednym z najsilniejszych czynników proangiogennych jest naczyniowo-œródb³onkowy czynnik wzrostu, który spe³nia wa n¹ rolê zarówno w fizjologicznej jak i patologicznej skórnej angiogenezie [14]. VEGF zwiêksza przepuszczalnoœæ naczyñ dla bia³ek osocza. W ten sposób umo liwia powstawanie w przestrzeni pozakomórkowej elu fibrynowego, co uznano za prawdopodobnie pierwszy element rozpoczynaj¹cy tworzenie nowych naczyñ [11]. Ta pro-angiogenna cytokina zwiêksza równie ekspresjê enzymów proteolitycznych na komórkach œródb³onka [16]. Efekt dzia³ania VEGF na komórki œródb³onka odbywa siê poprzez wi¹zanie ze specyficznymi receptorami kinazy tyrozynowej (VEGFR1 i VEGFR2), które prawie wy³¹cznie znajduj¹ siê na tych komórkach. Receptory te po zwi¹zaniu z cytokin¹ ulegaj¹ fosforylacji, wywo³uj¹c nastêpnie wzrost ró nicowania, proliferacji i migracji komórek endotelium do nowotworzonego naczynia krwionoœnego [26]. W morphea podobnie jak w twardzinie uk³adowej zmiany w komórkach endotelialnych i naczyniach krwionoœnych s¹ najwczeœniejszymi cechami stwierdzanymi w badaniu histopatologicznym [31]. W obecnej pracy stwierdzono, e stê- enie naczyniowo-œródb³onkowego czynnika wzrostu by³o znamiennie statystycznie wy sze w surowicy chorych z morphea i nieznamiennie wy sze w grupie w porównaniu do wyników uzyskanych w grupie kontrolnej. Natomiast stê enie svegfr2 by³o nieznamiennie statystycznie ni sze w obu postaciach twardziny, ni w grupie osób zdrowych. Odmienne wyniki uzyska³ Distler i wsp., wykazano wy sze stê enie svegfr w surowicy chorych z w stosunku do wyników uzyskanych w grupie kontrolnej [9]. Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 12 43

5 Rycina 1 S³aba immunoekspresja CD w komórkach œródb³onka w twardzinie uk³adowej (400x). Weak immunoexpression of CD in endothelial cells in systemic sclerosis (400x). Rycina 2 S³aba immunoekspresja CD w komórkach œródb³onka w morphea (200x). Weak immunoexpression of CD in endothelial cells in morphea (200x). W badaniach w³asnych stwierdzono ponadto zale noœæ pomiêdzy wy szym stê- eniem VEGF i svegfr2 w surowicy chorych z. U pacjentów z morphea wy sze stê enie VEGF wi¹za³o siê z ni szym stê- eniem badanego receptora. Wykazano tak- e znamienny statystycznie stosunek wartoœci badanej cytokiny proangiogennej do jej rozpuszczalnego receptora jedynie w grupie chorych z twardzin¹ uk³adow¹ w porównaniu do wyników uzyskanych w grupie kontrolnej. Wiadomo, e angiogeneza stymulowana jest przez proces niedotlenienia tkankowego, natomiast w twardzinie badaniem histopatologicznym stwierdza siê zanik naczyñ krwionoœnych. Uzyskane wyniki wskazuj¹, i prawdopodobnie jednym z czynników odpowiedzialnych za zahamowanie angiogenezy w twardzinie uk³adowej mo e byæ zaburzona funkcja naczyniowo-œródb³onkowego czynnika wzrostu lub jej 2 receptora, a w morphea zmniejszona ekspresja receptora na komórkach œródb³onka. Analiza statystyczna uzyskanych wyników, w której porównywano stosunek wartoœci badanych parametrów w surowicy wykaza- ³a, e jedynie w grupie chorych na twardzinê uk³adow¹ istnieje znamienny stosunek stê enia VEGF/sVEGFR2 w porównaniu do wyników uzyskanych w grupie kontrolnej. Podobne wyniki uzyskano w badaniach przeprowadzonych przez Mackiewicza i wsp., które wykaza³y wzrost ekspresji VEGF i jego receptorów w skórze chorych na twardzinê uk³adow¹ [23]. Autorzy uznali zaburzenia w równowadze pomiêdzy tymi parametrami za decyduj¹cy czynnik hamuj¹cy proces angiogenezy w. Jednym z zasadniczych czynników stymuluj¹cych proces angiogenezy jest niedotlenienie. Jednak e w twardzinie pomimo w³óknienia skóry nie stwierdza siê wzrostu tworzenia nowych naczyñ krwionoœnych. Wy sze stê enia VEGF i 2 receptora tej cytokiny, które w warunkach fizjologicznych mog³yby wzbudzaæ angiogenezê, w twardzinie wskazywaæ mog¹ na zaburzenie funkcji samej cytokiny lub jej receptora. Wykazana statystycznie znamienna zale noœæ pomiêdzy stê eniem w surowicy VEGF i MMP-9 jedynie w grupie kontrolnej wskazuje, e tylko u osób zdrowych stymuluj¹ce dzia³anie VEGF na komórki œródb³onka wzbudza w nich miêdzy innymi produkcjê kolagenazy u³atwiaj¹cej podjêcie angiogenezy. Takiej zale noœci nie stwierdzono u badanych chorych na twardzinê, zarówno uk³adow¹ jak i morphea. Potwierdza to podobny charakter zmian w komórkach endotelium w obu postaciach twardziny. Uzyskane wyniki u chorych na twardzinê ograniczon¹ do skóry i uk³adow¹ wykaza³y obecnoœæ zaburzeñ w wydzielaniu metaloproteinaz (MMP-2 i MMP-9) oraz VEGF i svegfr2 potwierdzaj¹c ich podobieñstwa patogenetyczne. Tak e stwierdzony statystycznie znamienny stosunek VEGF/ svegfr2 w surowicy chorych na twardzinê uk³adow¹ wskazywaæ mo e na zaburzenie ich funkcji prowadz¹c¹ do zaburzeñ procesu angiogenezy. Rola komórek CD+ w powstawaniu zmian skórnych w przebiegu twardziny pozostaje nadal niedok³adnie poznana. Wiadomo, e dendrocyty, na powierzchni których obecny jest antygen CD, spe³niaj¹ wa ne funkcje immunologiczne w skórze [17,24]. Zmniejszenie iloœci komórek CD+ w skórze mo e powodowaæ rozwój zjawisk autoimmunologicznych lub niekontrolowane w³óknienie w przebiegu twardziny [24,28]. Antygen CD jest przezb³onow¹ glikoprotein¹, obecn¹ na powierzchni komórek œródb³onka i komórek hematopetycznych. Stwierdzono, e zwiêkszona jego ekspresja odgrywa znacz¹c¹ rolê w powstawaniu nowych naczyñ krwionoœnych zarówno w yciu p³odowym jak i doros³ym [1,25,28]. Badania wykonane przez Aiwa i wsp. wykaza³y, e komórki œródb³onka CD+ obecne by³y w póÿnym okresie w³óknienia w skórze zajêtej przez twardzinê [1]. W obecnej pracy wykazano, podobnie jak inni autorzy [1,28], znamiennie statystycznie zmniejszenie liczby komórek endotelium CD+ w skórze chorych zarówno na twardzinê uk³adow¹ i ograniczon¹ do skóry w porównaniu do wyników uzyskanych w wycinkach grupy kontrolnej. 44 Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 12 B. Dziankowska-Bartkowiak i wsp.

6 Rycina 3 Silny odczyn CD w okolicy naczyñ krwionoœnych skóry w grupie kontrolnej (200x) Strong reaction with CD in surrounding of skin`s vessels in the control group (200 x).. Piœmiennictwo 1. Aiba S., Tabata N., Ohtani H. et al.: CD+ spindleshaped cells selectively disappear from the skin lesion of scleroderma. Arch. Dermatol. 1994, 130, Asano Y., Ihn H., Kubo M. et al.: Clinical significance of serum matrix metalloproteinase-13 levels in patients with localized scleroderma. Clin. Exp. Rheumatol. 2006, 24, Asano Y., Ihn H., Jinnin M. et al.: Involvement of avb5 integrin in the establishment of autocrine TGFb signaling in dermal fibroblasts derived from localized scleroderma. J. Invest. Dermatol. 2006, 126, Bogaczewicz J., Chodorowska G., Krasowska D.: Rola metaloproteinaz macierzy i tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w twardzinie uk³adowej. Przegl. Dermatol. 2003, 5, Bogaczewicz J., Chodorowska G., Krasowska D.: Rola metaloproteinaz macierzy i tkankowych inhibitorów metaloproteinaz w gojeniu siê ran skóry. Przegl. Dermatol. 2004, 3, Bogaczewicz J., Krasowska D., Stryjecka-Zimmer M., Chodorowska G.: Wysokie ca³kowite stê enie metaloproteinazy macierzy 9 (pro-mmp-9 i MMP-9) w surowicy krwi chorych na twardzinê uk³adow¹. Przegl. Dermatol. 2005, 3, Carmichael D.F., Stricklin G.P., Stuart J.M.: Systemic administration of TIMP in the treatment of collagen -induced arthritis in mice. Agents Actions 1989, 27, Chung L., Lin J., Furst D.E., Fiorentino D.: Systemic and localized scleroderma. Clin. Dermatol. 2006, 24, Distler O., Distler J.H.W., Scheid A. et al.: Uncontrolled expression of vascular endothelial growth factor and its receptors leads to insufficient skin angiogenesis in patients with systemic sclerosis. Circ. Res. 2004, 95, 9.. Distler J.H., Kalden J.R., Gray S., Distler O.: Vascular changes in the pathogenesis of systemic sclerosis. Z. Rheumatol. 2004, 63, Dvorak H.F.: Tumors: Wounds that do not heal. NEJM 1986, 3, Dziankowska-Bartkowiak B., Waszczykowska E., Sysa-Jêdrzejowska A.: Rola metaloproteinaz macierzy i ich tkankowych inhibitorów w procesach w³óknienia. Przegl. Dermatol. 2001, 5, Dziankowska-Bartkowiak B., ebrowska A., Joss- Wichmann E. et al.: Stê enie metaloproteinazy 2 i 9 (MMP-2 i MMP-9) w surowicy chorych na twardzinê uk³adow¹ - porównanie z ich ekspresj¹ w chorobowo zmienionej skórze - badania wstêpne. Postêpy Dermatologii i Alergologii 2007, 2, Felmeden D.C., Blann A.D., Lip G.Y.H.: Angiogenesis: basic pathophysiology and implications for disease. Eur. Heart. J. 2003, 24, Fleischmajer R., Perlish J.S., Krieg T. et al.: Variability in collagen and fibronectin synthesis by scleroderma fibroblasts in primary culture. J. Invest. Dermatol. 1981,76, Gerber H.P., Ferrara N.: The role of VEGF in normal and neoplastic hematopoiesis. J. Mol. d. 2003, 81, Glimour T.K., Wilkinson B., Breit S.N., Kossard S.: Analysis of dendritic cell populations using a revised histological staging of morphoea. Br. J. Dermatol. 2000, 143, Higley H., Persichitte K., Chu S. et al.: Immunocytochemical localization and serologic detection of transforming growth factor b1. Arthritis Rheum. 1994, 37, Izumi T., Tajima S., Nishikawa T.: Stimulated expression of deocorine and the deocorine gene in fibroblasts cultured from patients with localized scleroderma. Arch. Dermatol. Res. 1995, 287, Jab³oñska S., Rodnan G.P.: Localized forms of scleroderma. Clin. Rheum. Dis. 1979, 5, Lee M.M., Yoon B.J., Osiewicz K. et al.: Tissue inhibitor of metalloproteinase 1 regulates resistence to infection. Infect. Immun. 2005, 73, Lijnen H.R.: talloproteinases in development and progression of vascular disease. Pathophysiol. Haemost. Thromb. 2003, 33, Mackiewicz Z., Sukura A., Povilenaite D. et al.: Increased but imbalanced expression of VEGF and its receptors has no positive effect on angiogenesis in systemic sclerosis. Clin. Exp. Rheumatol. 2002, 20, McNiff J.M., Glusac E.J., Lazova R.Z. et al.: limited to the superficial reticular dermis: an underrecognized histologic phenomenon. Am. J. Dermatol. 1999, 21, Norton W.L., Huro E.R., Lewis D.C., Ziff M.: Evidence of microvascular injury in scleroderma and systemic lupus erythematosus: quantitative study of the microvascular bed. J. Lab. Clin. d. 1968, 71, Odoriso T., Failla C.M., Zambruno G.: Mollecular control of physiological skin angiogenesis. Eur. J. Dermatol. 2002, 12, VII. 27. Peltonem J., Kahari L., Jaakkola S. et al..: Evaluation of transforming growth factor b and type I procollagen gene expression in fibrotic skin diseases by in situ hybridization. J. Invest. Dermatol. 1990, 94, Skobieranda K., Helm K.F.: Decreased expression of the human progenitor cell antigen (CD) in morphea. Am. J. Dermatol. 1995, 17, Subcommittee for Scleroderma Criteria of the American Rheumatism Association Diagnostic and Therapeutic Criteria Committee: Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis (scleroderma). Arthritis. Rheum. 1980, 23, Takehara K., Sato S.: Localized scleroderma is an autoimmune disorder. Rheumatology 2005, 44, Wojas-Pelc A., Lipko-Godlewska S.: Pathogenesis of skin scleroderma-literature revivew. Przegl. Lek. 2005, 62, Yu Q., Stamenkovic I.: Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGFbeta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes. Dev. 2000, Przegl¹d Lekarski 2009 / 66 / 12 45