PIWet Zakład Chorób Ryb Zastosowanie molekularnych metod do diagnostyki wirusowych chorób ryb, wirusa krwotocznej posocznicy łososiowatych o (VHS), wirusa zakaźnej a martwicy układu krwiotwórczego (IHN) i herpeswirusa koi karpia (KHV). Mgr inż. Ewa Borzym
Wirusy, mikroorganizmy zawierające materiał genetyczny, namnażające się wyłącznie wewnątrz żywej komórki gospodarza, którym mogą być bakterie, rośliny i zwierzęta wirusy RNA Wirusy DNA
Głównym zadaniem wirusów w żywej komórce jest odtwarzanie ich informacji genetycznej (replikacja genomowego kwasu nukleinowego). Replikacja dotyczy procesu powielania kwasów nukleinowych Namnażanie określa mechanizm tworzenia nowych cząstek wirusowych (synteza białek strukturalnych, składanie cząstek potomnych, opuszczanie komórki przez cząstki potomne)
Rabdowirusy (Rhabdoviridae, z gr. rhabdos -pałeczka) Symetria: złożona, wirion ma kształt pocisku Otoczka lipidowa: id itij istnieje, pod nią znajduje j się białko M, które otacza dopiero nukleokapsyd Kwas nukleinowy: ssrna(-), wirusy z pojedynczą nicią o ujemnej polaryzacji Replikacja: zachodzi w cytoplazmie zakażonej komórki Wielkość: 180 x 70 nm
Krwotoczną posocznicę łososiowatych (VHS) oraz zakaźną martwicę układu krwiotwórczego (IHN) wywołują rhabdowirusy. L- polimeraza, G- glikoproteina, N-nukleoproteiny, P-fosfoproteiny, M-białka matriksu,
Diagnostyka molekularna wirusów VHS i IHN to: oczyszczanie i izolacja RNA PCR cdna-pcr (RT-PCR), Sekwencjonowanie Filogeneza Real-Time PCR Tworzenie baz danych Dyskusja o metodach wykorzystywanych w diagnostyce wirusów ryb
EPC kontrola po 24 godzinach EPC po 48 godzinach od zakażenia zmiany cytopatyczne
Izolacja RNA Pracując z RNA: warunki jałowe i nitrylowe rękawiczki używaj wolnych od RNAz odczynników, probówek i końcówek używaj końcówek z filtrem (sterylnych, bez autoklawowania) trzymaj probówki i wyizolowane RNA na lodzie jeżeli to możliwe
PCR Założenia ł ż reakcji 1. Technika enzymatycznej amplifikacji określonych sekwencji DNA 2. Specyficzność reakcji zapewniają dwa stertery komplementarne do matrycy yy 3. Reakcja umożliwia amplifikację ponad 1.000.000 razy DNA pojedynczych genów mimo obecności innych sekwencji 4. Możliwość amplifikacji pojedynczych matryc
PCR Przebieg reakcji 1. Denaturacja wstępna 92-95⁰C 2. Cykle Denaturacja 25-35 ⁰C Wiązanie starterów 40-55 ⁰C Synteza 68-72 ⁰C 3. Synteza końcowa 68-72 ⁰C 4. Przechowywanie 4⁰C(-20⁰C)
Mieszanina reakcyjna: Matryca Startery dntp MgCl 2 Polimeraza Taq Bufor
Wizualizacja produktów PCR
RT-PCR IHN Różna koncentracja starterów Czułość metody
Przygotowanie produktów do sekwencjonowania
Sekewncjonowanie DNA Metoda enzymatyczna Zwana metodą dideoksy, opracowana przez Sangera w 1977 roku Zasada sekwencjonowania- zdolność polimerazy DNA do wbudowania substratów reakcji 2,3 - dideoksynukleozydo trifosforanów (ddntp). Wbudowanie ddntp teminatora, powoduje zatrzymanie elongacji w miejscu A, C, G lub T Stosunek ddntp:dntp jest tak dobrany, że tylko część syntetyzowanych fragmentów DNA ulega terminacji. Postaje populacja fragmentów DNA o tym samym końcu 5 i zmienionym końcu 3.
Co zrobić, aby zsekwencjonować DNA? uzyskać właściwą matrycę wybrać startery reakcję i rozdział zlecić wyspecjalizowanemu laboratorium przeanalizować uzyskane wyniki
Filogeneza
Analiza filogenetyczna wirusa VHS
Bazy danych o szczepach wirusów
PCR w czasie rzeczywistym Real-Time PCR Reakcja PCR monitorowana przez wzrost fluorescencji, brak rozdziału elektroforetycznego produktów PCR intensywność fluorescencji jest bezpośrednio związana z wyjściową liczbąą matryc DNA; im więceję kopii tym mniej cykli dla wykrycia y fluorescencji Metoda detekcji nieswoista, TaqMan, SybrGreen, LightCycler itp..
Herpeswirus koi karpia (KHV) Herpeswirusy ( Herpesviridae) Symetria: ikosaedralna Otoczka lipidowa: występuje, wywodzi się z otoczki jądrowej komórki gospodarza Kwas nukleinowy: dsdna, forma liniowa Replikacja: jądro komórkowe, zachodzi poprzez stadium kolistego DNA Wielkość: sam nukleokapsyd ma 100 nm średnicy, kompletny wirion z osłonką wykazuje zaś Wielkość: sam nukleokapsyd ma 100 nm średnicy, kompletny wirion z osłonką wykazuje zaś średnicę 120-200 nm
Transmisja wirusa KHV: 1. Ryba ryba 2. Bezkręgowce ryba 3. środowisko d i k ryba, poza organizmem ryby od 4 tygodni do kilku lat
Wywołanie objawów klinicznych jest możliwe, kiedy w organizmie ryby dojdzie do powielenia kopii wirusa do takiej ilości, której nie jest w stanie zwalczyć system odpornościowy. Jeżeli ryba wchłania wirusa ze środowiska zewnętrznego, a nie dochodzi u niej do namnażania, staje się bardzo groźnym wektorem (ogniwem pośrednim) odgrywającym dużą rolę w rozprzestrzenianiu się DNA wirusa. Obecna w organizmie ilość kopii wirusa nie jest w stanie wywołać u takiej ryby wybuchu choroby, i nie powoduje śnięć.
Warunki reakcji PCR- KHV Gilad TK Sekwencja primerów 5' GACGACGCCGGA GACCTTGTG 3' 5' CACAAGTTCAGTCT GTTCCTCAAC 3' 5' GGGTTACCTGTACGAG 3' 5' CACCCAGTAGAT TATGC 3' Wielkość 484 bp 409 bp 1 unit Taq DNA polymerase 1 unit Taq DNA polymerase Enzymy platinum (Invitrogen) platinum (Invitrogen) Primers / dntp's 30 pmole /reakcję 400 μm 0.4 μg/reakcję 200 μm Koncentracja DNA 1 µg/reakcję 1 µg/reakcję Ilość mieszaniny reakcyjnej Program 50 μl 50 μl 95 C przez 5 min 95 C przez 5 min 94 C przez 1 min 95 C przez 30 sec 68 C przez 1 min 52 C przez 30 sec 72 C przez 30 sec 72 C przez 1 min 39 cykli 35 cykli 72 C przez 7 min 72 C przez 10 min
Gilad TK Czułość 10 6 Czułość 10 8 Czułość wyznaczona przy 1000 ng DNA na reakcję PCR
Produkty amplifikacji reakcja PCR na KHV z kontrolą wewnętrzną.
Produkty amplifikacji reakcja PCR na KHV bez kontroli wewnętrznej
P d kt lifik ji kj PCR KHV k t l t Produkty amplifikacji reakcja PCR na KHV z kontrolą wewnętrzną, wynik niepewny w rządku A, D i E.