MYCOPLASMA DUO 62739-62740 WYKRYWANIE I OZNACZANIE MIANA MYKOPLAZM UROGENITALNYCH 1 - ZNACZENIE KLINICZNE Mykoplazmy są drobnoustrojami saprofitycznymi, kolonizującymi błony śluzowe dróg moczowo-płciowych, w niektórych warunkach zdolnymi do wywoływania rożnych stanów chorobowych: Ureaplasma urealyticum (Uu), najczęściej odpowiedzialna za zapalenie cewki moczowej u mężczyzn (jest drugim co do częstości występowania czynnikiem etiologicznym nierzeżączkowego uretritis), powoduje także zapalenie gruczołu krokowego lub najądrza (12). U kobiet ciężarnych zakażenie U.urealyticum może prowadzić do zapalenia błon płodowych (13), z uszkodzeniem ich ciągłości, co z kolei stwarza ryzyko zakażenia płodu. Ponadto zakażenia w układzie moczowopłciowym mogą prowadzić do niepłodności (3, 4, 5). Mycoplasma hominis (Mh) jest czynnikiem etiologicznym zapalenia błony śluzowej macicy i zapalenia jajowodów (12), ponadto powoduje nieswoiste stany zapalne pochwy (8). Oba gatunki mogą być odpowiedzialne za: (9) (10) (12) Zakażenia okołoporodowe noworodków (zapalenie opon mózgowych, infekcje układu oddechowego, posocznica) (13). Posocznicę poporodową (6) (12). Zapalenie stawów Ponieważ mykoplazmy mogą być zarówno komensalami jak i patogenami, należy przyjąć ilościowe kryteria interpretacji wyników hodowli z próbek urogenitalnych od osób dorosłych (1,2,11). Decyzja o wprowadzeniu leczenia zależna jest od miana mykoplazm oraz objawów klinicznych. Test MYCOPLASMA DUO umożliwia: Hodowlę, identyfikację i oznaczenie miana mykoplazm urogenitalnych (UU i MH) Sporządzenie wystandaryzowanego inokulum do oznaczenia wrażliwości na antybiotyki 2 - ZASADA METODY Studzienka X o właściwościach wybiórczych zawiera czynnik przeciwgrzybiczy i mieszaninę antybiotyków. Identyfikację / oznaczenie miana mykoplazm urogenitalnych oparto na charakterystycznych cechach metabolicznych poszczególnych drobnoustrojów, jakimi jest zdolność hydrolizy: - mocznika przez Ureaplasma urealyticum (UU). - argininy przez Mycoplasma hominis (MH). z uwolnieniem amoniaku, który powoduje alkalizację podłoża (bez jego zmętnienia). O zajściu reakcji świadczy zmiana barwy wskaźnika ph (czerwieni fenolowej) z żółtej na czerwoną: Żółta studzienka: brak mykoplazm Czerwona studzienka: obecność mykoplazm Oznaczenie miana polega na metodzie kolejnych rozcieńczeń: poprzez rozcieńczanie w podłożu do zawiesin, w studzience D (rozcieńczenie 10-1 ), a następnie w studzienkach U 10 4 i H 10 4 (rozcieńczenie 10-2 ). Miano odpowiada liczbie studzienek, które zmieniły barwę na czerwoną w ciągu 24 do 48 godzin; każda czerwona studzienka zawiera co najmniej jedną CCU (jednostkę zmiany barwy) patrz diagram odczytu. Test wrażliwości na antybiotyki. Wybiórcze warunki w studzience X umożliwiają namnożenie drobnoustrojów i sporządzenie wystandaryzowanego inokulum (10 3 do 10 5 CCU/ml; Colour Changing Units = jednostki zmiany barwy) do oznaczenia wrażliwości na antybiotyki po 24-godzinnej inkubacji. 1
3 - SKŁAD ZESTAWU PRZECHOWYWANIE TRWAŁOŚĆ Postać testu: Mycoplasma Duo, nr kat. 62740 20 mikropłytek składających się z następujących studzienek: 6 studzienek, które zawierają: - odwodnione substraty do identyfikacji gatunku - czynniki wzrostowe dla mykoplazm - czynniki hamujące wzrost flory towarzyszącej studzienki U i U 10 4 : do identyfikacji i oznaczenia miana UU (zawierają mocznik) H i H 10 4 : do identyfikacji i oznaczenia miana MH (zawierają argininę) D: studzienka do rozcieńczeń X: namnażające podłoże wybiórcze dla mykoplazm, do przygotowania wystandaryzowanego inokulum do testu wrażliwości 20 fiolek po 2 ml podłoża do sporządzania zawiesin/transportowego 1 fiolka z kroplomierzem, zawiera 15 ml rozcieńczalnika. 40 plastikowych mikropipet (po 2 na każdą próbkę). 20 sztuk folii adhezyjnej. Mycoplasma Duo suspension medium (nr kat. 62739) 40 fiolek po 2 ml podłoża do sporządzania zawiesin; jednocześnie jest to podłoże transportowe. Przechowywanie: w temp. +2-8 C. Trwałość: zgodnie z datą ważności, podaną na opakowaniu. 4 - PRÓBKI 1) Materiały pobrane z dróg moczowo-płciowych: Wymazy z cewki moczowej, szyjki macicy, pochwy (a także rzadziej pobierane wymazy z nosogardzieli i zeskrobiny ze spojówek u niemowląt). Ponieważ mykoplazmy przylegają ściśle do komórek nabłonkowych, do prawidłowego pobrania materiału zaleca się specjalne wymazówki (cytobrush lub Bactopick ), które następnie należy umieścić w 2 ml podłoża. 2) Płyny fizjologiczne: Mocz*: - pobrany z początkowego strumienia i zhomogenizowany, - z całej mikcji: odwirowany i osad zawieszony w 0.2 ml soli fizjologicznej Nasienie i rzadsze materiały: supernatant z hodowli krwi, płyn mózgowo-rdzeniowy, płyn stawowy, popłuczyny oskrzelowe od noworodków. 0.2 ml materiału zawiesić w 2 ml podłoża do zawiesin. * Ze względu na przyleganie mykoplazm do komórek, najlepszymi materiałami z dróg moczowo-płciowych są materiały zawierające komórki nabłonkowe: wymazy z cewki moczowej, szyjki macicy i pochwy. Należy zapoznać się z zaleceniami dotyczącymi warunków przechowywania materiałów biologicznych (14). 3) Transport: Próbki należy transportować w podłożu do zawiesin; po inokulacji podłoże można przechowywać: 48 godzin w temp. pokojowej 72 godziny w temp. +2-8 C 6 miesięcy, zamrożone w temp. -20 C 5 - PROCEDURA A. INNE NIEZBĘDNE MATERIAŁY Cieplarka o temp. 37 C Pojemnik na odpady zakaźne B. PROCEDURA Inokulacja mikropłytki 1) Rozcieńczalnik Przy pomocy kroplomierza nanieść po 4 krople (200 μl) rozcieńczalnika do każdej z trzech studzienek dolnego rzędu mikropłytki: U 10 4, D, H 10 4. 2
2) Próbka Mikropipetą nanieść podłoże zaszczepione badanym materiałem: Po 4 krople (100 μl) do trzech studzienek górnego rzędu mikropłytki: U, X, H; 1 kroplę (25 μl) do studzienki D. 3) Rozcieńczenie Nową pipetą (jest to bardzo ważne, gdyż mykoplazmy przylegają do plastiku) dokładnie wymieszać zawartość studzienki D (3 x pobierając zawiesinę do pipety), a następnie rozcieńczyć zawiesinę, przenosząc po 1 kropli (25 μl) do studzienki U 10 4 i do studzienki H 10 4. Inkubacja Zakryć mikropłytkę folią adhezyjną. Inkubować przez 24 godziny w cieplarce, w temp. 37 C, o ile nie jest wymagane przedłużenie inkubacji przez kolejne 24 godziny (patrz p.7). 6 - ODCZYT - INTERPRETACJA WYNIKÓW 1) Odczyt Pierwszy odczyt wyników następuje po 24 godzinach inkubacji: uzyskuje się wtedy ostateczny wynik dla próbek zawierających mykoplazmy w wysokim mianie ( 10 4 CCU/ml); Kolejny odczyt po 48 godzinach jest niezbędny do: - Potwierdzenia wyniku ujemnego, - Wykrycia drobnoustrojów występujących w niskim mianie ( 10 3 CCU/ml), - Wykrycia drobnoustrojów występujących w wysokim mianie ( 10 4 CCU/ml), lecz w przypadku szczepu o wolniejszych procesach metabolicznych. 3
2) Interpretacja O obecności mykoplazm w badanej próbce świadczy zmiana barwy z żółtej na czerwoną studzienki z mocznikiem i/lub argininą, bez zmętnienia podłoża. Odczyt i interpretacja są takie same w przypadku obu gatunków: studzienki U i 10 4 są przeznaczone dla UU, studzienki H i H 10 4 są przeznaczone dla MH. MYCOPLASMA DUO umożliwia oznaczenie miana dwóch gatunków mykoplazm, obecnych w jednej próbce. Badane próbki można sklasyfikować jako: Ujemne: brak zmiany barwy (podłoże żółte) Dodatnie pod względem UU: zmiana barwy tylko w studzience/studzienkach U Dodatnie pod względem MH: zmiana barwy tylko w studzience/studzienkach H Dodatnie pod względem UU i MH: Zmiana barwy zarówno w studzienkach U, jak i H świadczy o obecności w próbce mykoplazm obu gatunków; należy odczytać miano każdego z nich. 4
Uwagi Po 48 godzinach wyniki nie ulegają zmianie, umożliwiając odczyt opóźniony (np. po weekendzie). Identyfikację można potwierdzić obserwując wzrost kolonii na agarze, przeznaczonym do hodowli mykoplazm. W przypadku zmętnienie podłoża, co wskazuje na zanieczyszczenie innymi bakteriami (występuje rzadko ze względu na wybiórczość podłoża do zawiesin), należy przesiać 3 krople hodowli z podłoża do zawiesin lub ze studzienki D na powierzchnię agaru i inkubować przez 48 godzin w temp. 37 C w atmosferze 10% CO 2. Metoda pozwala na oznaczenie miana mykoplazm na poziomie 10 3 i 10 4 /ml, uznanym za granicę stanu chorobowego (7). 7 - WYKORZYSTANIE STUDZIENKI X Studzienka X nie powinna być uwzględniana w interpretacji wyniku, zawiera podłoże wybiórcze dla mykoplazm i jest przeznaczona do namnożenia tych drobnoustrojów w celu przygotowania wystandaryzowanego inokulum do testu wrażliwości na antybiotyki (SIR MYCOPLASMA, nr kat. 62781). Zawartość studzienki należy rozcieńczyć w stosunku 1:100: w podłożu płynnym z mocznikiem (U 9, nr kat. 62762), dla UU w podłożu płynnym z argininą (Arginine, nr kat. 62763), dla MH Ze studzienki X należy pobrać 20 μl hodowli i przenieść do 2 ml podłoża z mocznikiem lub argininą, w zależności od gatunku mykoplazmy. Uzyskana w ten sposób, rozcieńczona 1:100 hodowla, posłuży następnie do inokulacji testu wrażliwości SIR MYCOPLASMA (po 100 μl do każdej studzienki). 5
8 - CHARAKTERYSTYKA / KONTROLA JAKOŚCI SZCZEPY WZORCOWE Ureaplasma urealyticum ref UU 80 Mycoplasma hominis ref MH 31 Enterococcus faecalis CIP 76117 Proteus mirabilis ATCC 25933 Staphylococcus aureus CIP 52148 KONTROLA AKTYWNOŚCI Satysfakcjonująca identyfikacja, oznaczenie miana i namnożenie KONTROLA SELEKTYWNOŚCI MIKROPŁYTKI Zahamowanie wzrostu Zahamowanie wzrostu KONTROLA SELEKTYWNOŚCI PODŁOŻA Zahamowanie wzrostu 9 - KONTROLA JAKOŚCI PRODUCENTA Odczynniki zostały przygotowane zgodnie z Systemem Jakości, poczynając od materiałów wyjściowych, aż do ostatecznego produktu komercyjnego. Odczynniki każdej serii podlegają oznaczeniu kontrolnemu i są dopuszczane do użytkowania, jeśli spełniają wymagane kryteria. Bio-Rad posiada protokoły produkcji i kontroli jakości każdej serii. 10 - OGRANICZENIA METODY W przypadku moczu można uzyskać wyniki fałszywie ujemne z powodu zbyt małej liczby komórek w próbce lub fałszywie dodatnie przy zasadowym ph. 11 - REFERENCJE 1) EB F. and ORFILA J., Les Mycoplasmes génitaux: rôle pathogène et diagnostic, Méd. Mal. infect, 1985, 9bis, 491-494 2) SCHIEFFER H.G., Urethral syndrome in women: etiologic, cytologic and clinical studies, (abstract) June 1988: 7 th Congress InternationalOrganization for Mycoplasmology - Vienna 3) QUINN P.A. and coll. Incidence of late loss and U. urealyticum in women with recurrent pregnancy loss, Abstract of the 1987 ICAAC 4) LAMONT R.F. TAYLOR ROBINSON D. and coll. The role of mycoplasmas, ureaplasmas and chlamydia in the genital tract of women presenting spontaneous early preterm labor., J. Med. Microbiol., 1987,- 24, 253-257 5) WAITES K.B. and coll. Ureaplasma pneumonia and sepsis associated with persistent pulmonary hypertension in the newborn, (abstract) June 1988: 7 th Congress International Organization for Mycoplasmology - Vienna 6) PHILLIPS L.E. and coll., Post cesarean wound infection by Mycoplasma hominis in a patient with persistent post partum fever, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1987, 7, 193-197 7) BEBEAR C. and RENAUDIN H., Les mycoplasmes génitaux : principe d isolement et d identification, Feuil. Biol., 1986, 27,19-23 8) MARDH P.A. and coll., Mycoplasma hominis in women with bacterial vaginosis and their consorts, (abstract) June 1988: 7 th Congress International Organization for Mycoplasmology - Vienna 9) WAITES K.B. and coll., Chronic Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis infections of central nervous system in preterm infants. Lancet, 1988, 2/9, 17-21 10) MADOFF S. & HOOPER D.C., Non genitourinary infections caused by Mycoplasma hominis in Adults. Rev. Infect. Dis., 1988, 3, 602-612 11) BONISSOL CH., Isolement et identification des mycoplasmes urogénitaux, Méd. Mal. infect., 1980, 10, 640-646 12) COPIN E. and LEBRUN L., Infections à mycoplasmes urogénitaux, Feuil. Biol, 1991, 32, (181), 9-15 13) CASSELL G.H., WAITES K.B., WATSON H.L., CROUSE D.T. and HARASAWA R., Ureaplasma urealyticum intra-uterine infection: role in prematurity and disease in newborns, Clin. Microbiol, Rew., 1993, 6 (1), 69-87 14) Basic Laboratory Procedures Clinical Bacteriology. World Health Organization. Geneva. 1991. 1 st edition. Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 881055 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 02/2010 6