PROBLEMATYKA: Oznaczanie substancji czynnej w próbce z zastosowaniem spektroskopii rozproszenia Ramana TEMAT ĆWICZENIA: OZNACZANIE GLUKOZY W PREPARATACH FARMACEUTYCZNYCH I PŁYNACH USTROJOWYCH METODA: Spektroskopia rozproszenia Ramana WPROWADZENIE Spektroskopia optyczna jest nauką zajmującą się badaniem oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego z materią. Oddziaływanie to polega na absorpcji, emisji, bądź rozpraszaniu promieniowania. Do tych ostatnich metod należy spektroskopia rozproszenia Ramana, będąca metodą umożliwiającą badania przejść pomiędzy poziomami rotacyjnymi i oscylacyjnymi cząsteczek zachodzącymi na skutek nieelastycznego rozproszenia światła. Obserwowanym efektem owego nieelastycznego rozproszenia światła przez cząsteczki jest widmo ramanowskie. Widmo ramanowskie umożliwia detekcję substancji badanej i analizę jej struktury. W przypadku kalibracji metody - spektroskopia ramanowska służyć może także do ilościowego oznaczania substancji w próbce. Spektroskopia rozproszenia Ramana Efekt nieelastycznego rozpraszania światła został opisany przez A. Smekala w 1923 roku i rozwinięty w postaci kwantowomechanicznej teorii rozpraszania przez Diraca w roku 1927. W roku 1928 hinduski fizyk C.V. Raman potwierdził doświadczalnie jego istnienie w oparciu o wyniki badań benzenu. Za to odkrycie przyznano mu w 1930 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki. U podstaw rozproszenia Ramana leży wzbudzenie rotacji lub oscylacji molekuły poprzez oświetlenie próbki światłem ( 0 ) z zakresu ultrafioletowego, widzialnego lub bliskiej podczerwieni. W wyniku oddziaływania molekuła fala elektromagnetyczna obserwuje się rozproszone światło o tej samej energii (rozproszenie Rayleigha) oraz dyskretne składowe o innej, niż wzbudzające promieniowanie, liczbie falowej (rozproszenie Ramana) (Rys. 1). A zatem w widmie oscylacyjnym obecne są położone symetrycznie względem pasma Rayleigha nowe linie o częstości równej 0 vib (pasma ramanowskie), gdzie vib odpowiada częstości przejść pomiędzy oscylacyjnymi poziomami danej molekuły. Należy podkreślić, iż wielkość przesunięcia pasm ramanowskich względem rayleighowskiego nie zależy od częstości promieniowania wzbudzającego, a wynika wyłącznie z właściwości cząsteczek rozpraszających. Pasma ramanowskie o częstości mniejszej 0 - vib niż ta dla światła wzbudzającego, nazywane są pasmami stokesowskimi, a te przy 0 + vib pasmami antystokesowskimi. Intensywność rozpraszania Rayleigha jest ok. 10 3, a Ramana 10 6-10 7 razy mniejsza od intensywności promieniowania wzbudzającego. Dodatkowo, jak wynika z rozkładu Boltzmana, pasma antystokesowskie są mniej intensywne w porównaniu z pasmami stokesowskimi. Stąd, w większości metod spektroskopii rozproszenia Ramana, pomiar dotyczy jedynie części stokesowskiej widma ramanowskiego przedstawionej w skali 1
względnych wartości częstości (wyrażonych w cm 1, tzw. przesunięcie ramanowskie) w zakresie od 4000 do 0 cm -1. Tak wyrażone widmo ramanowskie odpowiada skali częstości widma absorpcyjnego w podczerwieni, co ułatwia z kolei porównanie tych komplementarnych względem siebie metod spektroskopowych. E wzbudzony stan elektronowy stany wirtualne padający foton rozproszenie Ramana (stokesowskie ) h 0 - h vib rozproszenie Rayleigha h 0 rozproszenie Ramana (antystokesowskie) h 0 + h vib 1 0 h vib podstawowy stan elektronowy Rys. 1. Diagram energetyczny przejść pomiędzy oscylacyjnymi poziomami dla rozproszenia Rayleigha i Ramana. Metodą rozproszenia Ramana można badać związki we wszystkich stanach skupienia, a więc gazy, ciecze, roztwory (w tym wodne), pasty, ciała stałe jako proszki mikrokrystaliczne, czy też monokryształy w szerokim przedziale temperatur i ciśnień. Pomiar widm ramanowskich nie wymaga zastosowania skomplikowanych procedur przygotowania próbek, jak również nie wymagane są również specjalnego rodzaju naczyńka pomiarowe. W technikach, gdy nie używa się mikroskopu, badane substancje mogą być umieszczane w ilości około miligrama w kapilarach (najczęściej szklanych) przeźroczystych dla promieniowania wzbudzającego lub bezpośrednio eksponowane na działanie promieniowania w dowolnie zaprojektowanym naczyńku. Niewątpliwą zaletą spektroskopii ramanowskiej jest możliwość jej zastosowania dla próbek w roztworach wodnych (szczególnie przydatne dla próbek biologicznych). Metody spektroskopowe pozwalają na identyfikację związków w oparciu o ich charakterystyczne pasma widoczne w widmach ramanowskich i w widmach absorpcji w podczerwieni. W przypadku próbek biologicznych, czy mieszanin identyfikację substancji można przeprowadzać przez porównanie otrzymanego widma z widmem standardu. Spektroskopia Ramana jako metoda ilościowa W dwuwiązkowych spektrometrach FT-IR i UV/vis intensywność pasm w widmie jest zdefiniowana prawem Beera-Lamberta-Bouguera, z którego wynika, iż intensywność pasma, określona przez całkę jego powierzchni, jest wprost proporcjonalna do stężenia i grubości badanej próbki. Wynika z tego, iż intensywności pasm dla próbek o założonej grubości i danym stężeniu, analizowanych na różnych spektrometrach FT-IR lub UV/vis, są takie same (zakładając tą samą rozdzielczość, anodyzację i inne podstawowe parametry pomiaru). Oznacza to, iż intensywność pasma jest w spektroskopii IR lub UV/vis funkcją próbki niezależną od innych parametrów pomiarowych, a na osi rzędnych znajduje się absorbancja/transmitancja, opisana w jednostkach bezwzględnych. W spektroskopii 2
ramanowskiej detekcji podlega ilość rozproszonych fotonów, zależna od licznych czynników, co sprawia, iż intensywność rozpraszania musi być wyrażona w jednostkach bezwzględnych. Intensywność rozproszenia zależy np. od mocy lasera, jej fluktuacji, długości fali wzbudzającej, orientacji próbki i nie jest prostą funkcją stężenia i grubości próbki. W ramanowskiej spektroskopii dyspersyjnej intensywność pasma zależy także od czasu skanowania próbki. W tym sensie zastosowanie spektroskopii Ramana do pomiarów ilościowych jest utrudnione i wymaga każdorazowej kalibracji metody na instrumencie, używanym do pomiaru próbki badanej oraz zachowania tych samych parametrów pomiarowych (mocy lasera, zogniskowania lasera na próbce, rozdzielczości widmowej, orientacji próbki, długości drogi optycznej) i wówczas intensywność rozpraszania staje się liniową funkcją stężenia próbki. Znacznie prostsze jest także przeprowadzenie analiz ilościowych dla próbek homogenicznych, np. w postaci roztworów, gdyż eliminowane są wówczas efekty związane z wielkością i kształtem ziaren w ciele stałym. Wzmiankowaną już ogromną zaletą spektroskopii ramanowskiej jest możliwość pomiaru próbek w postaci roztworów wodnych ze względu na fakt, iż woda słabo rozprasza promieniowanie na sposób ramanowski. Umożliwia to oznaczanie związków w płynach ustrojowych np. leków oraz ich metabolitów. Fourierowski spektrometr ramanowski Zasadniczymi elementami Fourierowskiego spektrometru ramanowskiego są: laser, komora pomiarowa, interferometr oraz detektor. Wyraz laser jest skrótem pełnej angielskiej nazwy mechanizmu jego działania: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation - wzmocnienie światła przez wymuszoną emisję promieniowania. Ośrodkiem czynnym lasera może być kryształ (np. rubin), półprzewodnik (arsenek galu), czy gaz (np. krypton). Ośrodek czynny lasera jest aktywowany ( pompowany ) przez zewnętrzne źródło promieniowania. W ośrodku czynnym lasera wytwarzany jest w ten sposób stan inwersji obsadzeń i następuje emisja spontaniczna (we wszystkich kierunkach). Fotony o pewnym kierunku biegu są wzmacniane w efekcie wielokrotnego odbicia przez układ dwóch zwierciadeł, z których jedno jest nieprzepuszczalne (współczynnik odbicia R 100%), drugie częściowo przepuszczalne (R 95 %). Wzmocnione promieniowanie jest wyprowadzane na zewnątrz przez częściowo przepuszczalne zwierciadło. Takie promieniowanie cechuje się dużą monochromatycznością, dużą gęstością promieniowania i jest spolaryzowane, tzn. składowa elektrycznej fali elektromagnetycznej jest falą płaską. W spektrometrach fourierowskich stosuje się najczęściej laser Nd:YAG (granat itrowo-glinowy z domieszką jonów neodymu Nd 3+ ; Y 3 Al 5 O 12 +Nd 2 O 3 ) chłodzony powietrzem lub wodą, o mocy rzędu jednego wata, pracujący w sposób ciągły w zakresie bliskiej podczerwieni, =1064 nm. Badana próbka może mieć dowolny stan skupienia, zazwyczaj umieszczana jest w szklanej lub kwarcowej kapilarze. Monokryształ można umieścić bezpośrednio na drodze wiązki promieniowania wzbudzającego. Minimalna ilość próbki jest rzędu mg. W typowych rozwiązaniach 50% promieniowania jest odbijane przez płytkę, a 50% przechodzi przez nią. Interferometr Michelsona (Rys. 2) jest urządzeniem, które dzieli wiązkę promieniowania na dwie wiązki o prawie równej mocy, a następnie rekombinuje je w taki sposób, że zmiany intensywności wiązki kombinowanej mogą być mierzone jako funkcja różnicy dróg optycznych obu wiązek. Wiązka promieniowania rozproszonego (P) pada na tzw. płytkę dzieląca (BS, ang. beam splitter), która transmituje w przybliżeniu połowę promieniowania, odbijając pozostałą cześć pod katem 90. Powstałe w ten sposób bliźniacze wiązki są odbijane od luster, w których jedno jest nieruchome (LN), a drugie 3
ruchome (LR). Wiązki spotykają się znów na płytce dzielącej, która kieruje promieniowanie na próbkę i detektor (D). Poziomy ruch ruchomego zwierciadła umożliwia zarejestrowanie interferogramu, a rejestrowane natężenie promieniowania zależy od różnicy dróg optycznych wiązek (maksymalne jest gdy zwierciadła znajdują się w takiej samej odległości od płytki dzielącej). L N L R B S P R D Rys. 2. Schemat budowy interferometru Michelsona. W spektrometrach fourierowskich stosuje sie detektory InGaAs pracujące w temperaturze pokojowej lub bardzo czułe detektory germanowe działające w temperaturze ciekłego azotu. Intensywność rozpraszania ramanowskiego zależy od czwartej potęgi częstości promieniowania padającego 0. Oznacza to, że najsilniejsze rozpraszanie ramanowskie uzyskujemy stosując do wzbudzeń lasery z zakresu UV (krótkie fale = wysokie częstości), zaś najsłabsze dla zakresu IR (długie fale = niskie częstości). Zastosowanie w spektrometrach fourierowskich laserów Nd:YAG pracujących w zakresie podczerwieni powoduje ucieczkę od fluorescencji (w tym zakresie promieniowania nie obserwuje się przejść elektronowych), ale intensywność światła rozproszonego jest zredukowana poprzez wspomniany czynnik 0 4. Zastosowanie interferometru powoduje jednak częściową kompensację tego zjawiska, gdyż brak szczeliny daje wzmocnienie sygnału o około 2 rzędy wielkości w porównaniu do spektrometrów dyspersyjnych. Stosowanie lasera Nd:YAG w spektrometrach fourierowskich implikuje też możliwości detekcji promieniowania rozproszonego. Dla tego zakresu widmowego nie mogą być stosowane wielokanałowe, czułe detektory CCD (używane często w spektrometrach dyspersyjnych), wykorzystuje się natomiast detektory Ge lub InGaAs, które niestety charakteryzują się wyższym szumem i niższą czułością. Glukoza Glukoza jest monosacharydem (cukrem prostym), zawierającym sześć atomów węgla w cząsteczce (heksoza) i ugrupowanie aldehydowe (aldoza). Wzór strukturalny D-glukozy przedstawiony jest na rys. 3. 4
1 2 3 4 5 6 H O CH 2 OH CH 2 OH H O H H O OH HO H H H OH H OH H HO OH HO H CH 2 OH a b c Rys. 3. Wzory strukturalne D-glukozy: forma łańcuchowa otwarta (a) oraz formy pierścieniowe: -Dglukopiranoza (b) oraz -D-glukopiranoza (c). W roztworze, także wodnym, glukoza występuje głównie w postaci hemiacetalu, tj. struktury pierścieniowej (Rys. 3b, c). Hemiacetal powstaje w wyniku reakcji grupy aldehydowej atomu węgla C 1 z grupą hydroksylową atomu węgla C 5. W przypadku D-glukozy w wyniku takiej reakcji powstają dwa produkty: - i -D-glukopiranoza, które w roztworze wodnym występują w równowadze z formą otwartą. Cukrzyca (diabetes mellitus) jest schorzeniem, charakteryzującym się zwiększonym wydzielaniem glukozy przez wątrobę i jej zmniejszonym pobieraniem przez inne organy. Rozróżnia się dwa podstawowe typy tej choroby: typ I, oraz typ II. W przypadku cukrzycy typu I, w rezultacie uszkodzenia komórek beta wysepek Langerhansa trzuski, następuje defekt produkcji insuliny. Cukrzyca typu II, o niejasnej etiologii, jest związana z nabywaniem odporności na insulinę (insulinoodporność). W pierwszej fazie choroby następuje wzrost wydzielania insuliny, a następnie jej wydzielanie maleje na skutek zniszczenia nadmiernie obciążonych komórek beta wysepek Langerhansa. W obu przypadkach charakterystycznym objawem jest hiperglikemia, a podstawowym sposobem leczenia jest insulinoterapia, polegająca na podawaniu chorym preparatów insuliny. Niewłaściwe dawki tego leku, lub innych środków powodujących wydzielanie insuliny, a także inne przyczyny np. spożycie alkoholu lub znaczny wysiłek mogą prowadzić do hipoglikemii, czyli stanu w którym ilość glukozy we krwi (poza żyłą wrotną) spada poniżej 55 mg dl -1 (3,0 mmol L -1 ). W przypadku lekkiej hipoglikemii stan ten można znieść przez podanie choremu słodkiego napoju (np. sok, naturalnie słodzony napój) lub glukozy/sacharozy w formie krystalicznej (5-20 g). W przypadkach ciężkiej hipoglikemii (w stanach utraty przytomności) podaje się 20% roztwór glukozy dożylnie, a następnie wlewnie 10% roztwór glukozy. Ponadto glukoza jest związkiem wspomagającym w wielu preparatach, np. Gastrolit, Litorsal, Orgalit, Glucardiamid. ZAGADNIENIA DO OPRACOWANIA 1. Omów rozpraszanie światła na sposób Rayleigha. 2. Omów rozpraszanie światła na sposób Ramana. 3. Omów krótko sposób oznaczenia glukozy w kroplówce. 4. Omów różnicę między cukrzycą typu I i II. 5. Naszkicuj i wyjaśnij diagram energetyczny przejść między oscylacyjnymi poziomami energetycznymi dla elastycznego i nieelastycznego rozproszenia światła. 6. Określ, jakie wielkości znajdują się na osi odciętych i rzędnych w widmie ramanowskim. W jakich najczęściej podaje się je jednostkach? 7. Wymień i krótko omów części składowe fourierowskiego spektrometru ramanowskiego. 5
8. Omów zasadę identyfikacji glukozy w widmie ramanowskim mieszaniny glukozy z wodą. Wymień po dwa charakterystyczne pasma mogące służyć do identyfikacji wody i glukozy. 9. Omów trzy istotne różnice między ramanowskim spektrometrem dyspersyjnym, a spektrometrem fourierowskim. 10. W wyniku kalibracji oznaczenia glukozy otrzymano następujące dane: Stężenie (mol L -1 ) 0.0 0.0 0.2 12 0.4 23 0.6 35 0.8 43 1.0 51 Intensywność integralna (j.wzg.) W wyniku oznaczenia otrzymano intensywność integralną pasma glukozy równą 28 jednostek względnych. Używając jedynie kalkulatora prostego, oblicz stężenie glukozy w badanym roztworze. Podaj kolejne kroki obliczeń. 11. Wymień dwie najważniejsze zalety i dwie wady spektroskopii ramanowskiej jako metody ilościowej. 12. Wyobraź sobie, ze badasz roztwór glukozy w wodzie z użyciem spektroskopii ramanowskiej. Wymień cztery czynniki zewnętrzne od których istotnie zależy intensywność pasm w otrzymanym widmie ramanowskim. LITERATURA 1. Z. Kęcki: Podstawy spektroskopii molekularnej, PWN, Wa-wa, 1992, rozdz. 3.4, 92-107. 2. A. Cygański: Metody spektroskopowe w chemii analitycznej, WNT, W-wa 2009, rozdz. 3.7, 264-266. 3. F.J. Holler, A.D. Skoog, S.R. Crouch: Principles of experimental analysis, Brooks/Cole Cengage Learning, Belmont, USA, 2007, rozdz. 18, 481-493. 6
CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA CEL ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest detekcja i oznaczenie glukozy w farmaceutykach lub płynach ustrojowych, a także utrwalenie wiedzy o spektroskopii Ramana i możliwości stosowania tej techniki jako metody ilościowej. PRZYRZĄDY, NACZYNIA I ODCZYNNIKI a) kolbki miarowe b) tryskawki c) pipety automatyczne d) kuweta pomiarowa e) waga analityczna f) spektrometr FT-ramanowski, np. Bruker MultiRAM oraz odpowiednie oprogramowanie, np. OPUS Bruker g) glukoza cz. d. a h) tabletki/kroplówki zawierające glukozę np. Gastrolit, Litorsal, Orgalit, Glucardiamid lub płyny ustrojowe. SPOSÓB WYKONANIA 1. Przygotowanie roztworów i wykonanie pomiarów Ćwiczenie polega na pomiarze widm ramanowskich roztworów wodnych glukozy o znanych stężeniach, a następnie pomiarze widma badanego płynu ustrojowego bądź roztworu wodnego badanego leku. Widma zostaną zarejestrowane przy pomocy spektrometru Bruker MultiRAM. Spektrometr jest wyposażony w laser Nd:YAG emitujący promieniowanie o długości 1064 nm oraz detektor germanowy chłodzony ciekłym azotem. 1. Włączyć komputer i odpowiednie oprogramowanie (Opus). 2. Uruchomić laser. 3. W naczyńku pomiarowym umieścić glukozę. 4. Ustawić (dobrać) parametry pomiarowe: moc lasera, rozdzielczość oraz liczbę skanów. 5. Zogniskować laser na próbce wzorca, zaobserwować interferogram dla glukozy. 6. Wykonać pomiar widma ramanowskiego glukozy. 7. Na wadze analitycznej odważyć około 1,2 grama glukozy. 8. Przenieść ilościowo odważkę do zlewki i rozpuścić w 4 ml wody destylowanej. 9. Pobrać 2 ml tak przygotowanego roztworu, przenieść ilościowo do czystej kolby i rozcieńczyć wodą destylowaną w stosunku 2:1 10. Czynność opisaną w punkcie 9 powtórzyć czterokrotnie, aby otrzymać ostatecznie pięć roztworów glukozy w wodzie destylowanej. 11. Zmienić przystawkę pomiarową na przystawkę służącą do pomiaru cieczy. 12. Dwukrotnie przemyć kuwetę pomiarową niewielką ilością roztworu glukozy. 13. Przenieść 500 µl roztworu do kuwety pomiarowej. 14. Umieścić kuwetę pomiarową w spektrometrze. 7
15. Dobrać odpowiednie parametry pomiarowe: moc lasera, rozdzielczość widmową, liczbę skanów oraz zogniskować laser na próbce. 16. Wykonać widmo Ramana roztworu glukozy. 17. Punkty 12-16 powtórzyć dla wszystkich roztworów. 18. W przypadku farmaceutyku w postaci ciała stałego należy rozpuścić go w niewielkiej, ale ściśle określonej ilości wody destylowanej. 19. Przemyć trzykrotnie kuwetę pomiarową wodą destylowaną, a następnie trzykrotnie niewielką ilością badanego roztworu (farmaceutyku w postaci roztworu, rozpuszczonego w wodzie farmaceutyku lub płynu ustrojowego). 20. Powtórzyć punkty 13-16. 2. Obróbka otrzymanych danych W drugiej części ćwiczenia zostanie przeprowadzona analiza otrzymanych wyników. W czasie pomiaru otrzymano zestaw widm ramanowskich roztworów kalibracyjnych oraz widm roztworów badanych. Wartość intensywności integralnej wybranego pasma w roztworach kalibracyjnych zostanie wykreślona w funkcji stężenia roztworów, i tak wykonana krzywa kalibracyjna posłuży następnie do obliczenia stężenia glukozy w roztworze (roztworach) badanych. 1. Znaleźć odpowiednie pasmo markerowe dla glukozy i przeprowadzić całkowanie jego powierzchni we wszystkich otrzymanych widmach, stosując we wszystkich przypadkach tę samą metodę i te same granice całkowania. 2. Wykreślić zależność I int (c) i obliczyć parametry prostej I int = ac+b stosując metodę regresji liniowej. 3. Obliczyć błędy oszacowania parametrów a i b oraz współczynnik korelacji prostej. 4. Na podstawie otrzymanego równania obliczyć stężenie glukozy w badanym roztworze (roztworach). OPRACOWANIE WYNIKÓW 1. Na podstawie otrzymanych widm odczytać położenia pasm charakterystycznych dla glukozy. 2. W oparciu o dane literaturowe, szczególnie tabele charakterystycznych częstości, dokonać przypisania głównych pasm w widmie glukozy (należy podać odnośniki do źródeł literaturowych z jakich korzystano). 3. Przedstawić otrzymane dane w postaci tabeli: Tabela 1. Przypisanie drgań harmonicznych do pasm ramanowskich glukozy. Przesunięcie ramanowskie (cm -1 ) Przypisanie 4. Zamieścić obliczenia konieczne do określenia stężenia glukozy w badanej próbce/próbkach (patrz ANALIZA OTRZYMANYCH DANYCH): a. przedstawić dane pomiarowe w postaci tabeli: 8
Tabela 2. Zależność intensywności integralnej pasma markerowego glukozy od stężenia roztworu. Stężenie (mol L -1 ) Intensywność integralna (j. wzg.) b. zamieścić wykres I int (c) c. podać parametry wykresu a i b, błędy ich oszacowania oraz współczynnik korelacji prostej d. zanotować obliczoną wartość stężenia badanego roztworu (roztworów). 5. Porównać stężenie glukozy z wartością odniesienia, podaną przez asystenta. 6. Obliczyć błąd względny pomiaru. 7. Na podstawie otrzymanych wyników przedyskutować użyteczność metody do oznaczania substancji czynnej w próbce rozważając zarówno wady, jak i zalety zastosowanej metody. 9