Streszczenie Zarówno w komórkach prawidłowych, jak i nowotworowych wielonienasycone kwasy tłuszczowe (WNKT) pełnią funkcję wewnątrzkomórkowych, drugorzędowych przekaźników sygnału w procesach proliferacji oraz śmierci komórki. WNKT wykazują selektywne działanie przeciwnowotworowe i mogą wpływać na wrażliwość komórek nowotworowych na naświetlanie i chemioterapię. Komórki nowotworowe często wykazują pierwotną lub nabytą oporność na cisplatynę (CPT), powszechnie stosowany cytostatyk. Celem pracy było zbadanie zdolności egzogennych kwasów tłuszczowych: linolowego (LA, 18:2 n-6), α-linolenowego (ALA, 18:3 n-3), arachidonowego (AA, 20:4 n-6), eikozapentaenowego (EPA, 20:5 n-3) i dokozaheksaenowego (DHA, 20:6 n-3) do zwiększenia wrażliwości ludzkich komórek glejaka wielopostaciowego SNB-19 i glejaków 8-MG-BA oraz 42-MG-BA na CPT. Spośród badanych WNKT w testowanym zakresie stężeń, tylko EPA (100 μm) oraz DHA (100 μm) zmniejszały przeżywalność komórek glejaków linii 8-MG-BA i 42-MG-BA. Komórki glejaka wielopostaciowego SNB-19 nie wykazały wrażliwości na WNKT. AA, EPA i w szczególności DHA, w wyższych stężeniach, zwiększały cytotoksyczność CPT wobec wszystkich testowanych linii glejaków. Zwiększenie aktywności przeciwnowotworowej CPT w obecności AA, EPA lub DHA wskazuje na korzystne efekty suplementacji WNKT podczas terapii przeciwnowotworowej z zastosowaniem CPT mogące poprawić skuteczność leczenia. Abstract In normal and tumour cells, polyunsaturated fatty acids (PUFAs) act as intracellular second messengers, which play a role in signalling, proliferation and cell death. PU- FAs have selective tumouricidal action and may alter sensitivity of tumour cells to radiation and chemotherapy. Tumour cells are often characterised by primary or acquired resistance to cisplatin (CPT), a commonly used anticancer agent. This led us to investigate of the ability of exogenous linoleic acid (LA, 18:2 n-6), α-linolenic acid (ALA, 18:3 n-3), arachidonic acid (AA, 20:4 n-6), eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5 n-3), and docosahexaenoic acid (DHA, 22:6 n-3) to modulate sensitivity of human glioblastoma (SNB-19), and human gliomas (8-MG-BA, 42-MG-BA) to CPT. Among the PUFAs, tested in the wide concentration range, only EPA (100 μm) and DHA (100 μm) inhibited viability of 8-MG-BA and 42-MG-BA glioma cells. SNB-19 glioblastoma cells remained resistant to PUFAs. At higher concentrations, AA, EPA and, in particular DHA, added to the culture medium, increased CPT cytotoxicity in the tested glioma cells. The observed increase of CPT cytotoxicity in the presence of AA, EPA or DHA indicates plausible beneficiary effect of PUFAs supplementation during anticancer therapy involving CPT, which may improve treatment. Key words: cisplatin, polyunsaturated fatty acids, glioma cells Słowa kluczowe: cisplatyna, wielonienasycone kwasy tłuszczowe, komórki glejaków Wstęp Cisplatyna (cis-diaminodichloroplatyna II; CPT) jest charakteryzującym się dużą skutecznością, powszechnie stosowanym lekiem w terapii wielu nowotworów, chociaż jej użycie jest często ograniczone z powodu efektów niepożądanych takich jak nefrotoksyczność, ototoksyczność, czy neurotoksyczność. Ponadto, istotny problem kliniczny stosowania CPT w terapii nowotworów stanowi pierwotna lub nabyta podczas leczenia oporność komórek nowotworowych na działanie tego leku. Obniżona wrażliwość nowotworów na CPT wymaga stosowania zwiększonych dawek
leku, którym towarzyszy wzrost toksyczności względem zdrowych tkanek, co może prowadzić do ciężkich powikłań wielonarządowych. Wśród przyczyn oporności komórek nowotworowych na CPT wymieniane są mechanizmy zapobiegające powstawaniu adduktów DNA-CPT przez zmniejszenie kumulacji CPT w komórce wskutek zmniejszonego wnikania leku do komórki, nasilonych procesów detoksykacyjnych powodujących zwiększone usuwanie leku z komórki oraz mechanizmy polegające na blokowaniu śmierci komórki przez intensyfikację procesów naprawczych DNA i wzrost tolerancji komórki na uszkodzony lub zmodyfikowany przez lek materiał genetyczny [1]. Obecnie poszukuje się skutecznych metod, które zapobiegałyby rozwojowi lekooporności lub ją znosiły. Jednym ze sposobów znoszenia oporności komórek nowotworowych jest użycie chemiouczulaczy lub modulatorów oporności wielolekowej. Interesującym zagadnieniem jest wykorzystanie suplementów diety w celu zwiększenia efektywności terapii przeciwnowotworowej przy jednoczesnym zminimalizowaniu toksyczności względem tkanek prawidłowych. Powszechnie znany jest pogląd, że długołańcuchowe, wielonienasycone kwasy tłuszczowe (WNKT) takie jak eikozapentaenowy (EPA, 20:5 n-3), czy dokozaheksaenowy (DHA, 20:6 n-3), nie tylko wykazują selektywne działanie cytotoksyczne względem komórek nowotworowych, ale także mogą zwiększać ich wrażliwość zarówno na chemioterapię, jak i radioterapię. Jednakże, zaledwie kilka prac traktuje o wpływie WNKT na skuteczność leczenia CPT [2-4]. W zależności od pozycji pierwszego podwójnego wiązania WNKT zostały podzielone na dwie rodziny n-6 oraz n-3. Prekursorami rodzin kwasów n-6 i n-3 są odpowiednio kwasy linolowy (LA, 18:2 n-6) i α-linolenowy (ALA, 18:3 n-3). Z powodu braku odpowiednich desaturaz w tkankach zwierzęcych, nie zachodzi synteza LA i ALA, a ponieważ muszą być one dostarczone w diecie określane są mianem niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych. Z LA w procesie desaturacji katalizowanym przez 6-desaturazę powstaje kwas γ-linolenowy (GLA, 18:3 n-6), który jest wydłużany do kwasu dihomo-γ-linolenowego (DGLA, 20:3, n-6), a ten jest konwertowany przez 5-desaturazę do kwasu arachidonowego (AA, 20:4 n-6). Te same enzymy uczestniczą w przekształceniu ALA do EPA, z którego powstaje DHA. Kwasy tłuszczowe z rodzin n-6 i n-3 konkurują o te same enzymy uczestniczące w syntezie metabolitów LA i ALA. Dlatego dieta zawierająca znaczne ilości LA powoduje zmniejszenie syntezy EPA i DHA z ALA i nasilenie powstawania AA. Odwrotnie, dieta bogata w ALA sprzyja syntezie EPA i DHA, a osłabia tworzenie się AA. Różnice w strukturze WNKT mają kluczowe znaczenie w determinowaniu ich właściwości biologicznych. Jednakże, do tej pory pozostają niewyjaśnione zależności pomiędzy strukturą WNKT, a ich przydatnością w prewencji i terapii nowotworów [2, 4-7]. Celem przedstawionej pracy było zbadanie zdolności egzogennych kwasów tłuszczowych rodziny n-3: ALA, EPA i DHA oraz rodziny n-6: LA i AA do modulowania wrażliwości na CPT ludzkich komórek glejaków. Wybrane do eksperymentów komórki glejaka wielopostaciowego (SNB-19) oraz ludzkich glejaków (8-MG-BA, 42-MG-BA) charakteryzuje różna wrażliwość na WNKT. Materiał i metody Hodowle komórkowe Materiał do badań stanowiły hodowane komórki ludzkich linii nowotworowych: glejaka wielopostaciowego SNB-19, glejaków 8-MG-BA oraz 42-MG-BA pochodzące z kolekcji German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ). Komórki SNB-19 hodowano w mieszaninie DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium, Sigma) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, PAA The Cell Culture Company), 100 μg /ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny (Sigma). Dla komórek 8-MG-BA oraz 42- MG-BA medium hodowlane stanowiła mieszanina MEM (Modified Eagle s Medium, Sigma) z dodatkiem 10% FBS (PAA The Cell Culture Company), 100 μg/ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny (Sigma). Hodowle komórkowe prowadzono w warunkach porównywalnych do fizjologicznych, zgodnie z wymogami hodowli in vitro, czyli w stałej temperaturze (35 C) i wilgotności powietrza (95%) oraz atmosferze wzbogaconej 5% CO 2. Warunki ekspozycji komórek Przed wykonaniem eksperymentów sporządzono 100 mm roztwory LA, ALA, AA, EPA i DHA (Sigma) w 99% etanolu (Merck), które przechowywano w temperaturze -20ºC w atmosferze azotu. Bezpośrednio przed każdym eksperymentem wyjściowe roztwory WNKT rozcieńczano za pomocą odpowiedniej dla danej hodowli pożywki, tak, aby otrzymać roztwory WNKT o stężeniach 25 μm; 50 μm; 100 μm oraz aby ilość dodawanego do każdej hodowli etanolu była jednakowa. Zawartość etanolu w każdej z pożywek nie przekraczała 0,1 %. Wcześniejsze eksperymenty pokazały, że takie stężenie etanolu w pożywce nie wpływa na hodowane komórki. Komórki hodowano na standardowych płytkach 96 dołkowych (5 x 10 3 komórek/dołek w 100 μl). Po 24 godzinach od założenia hodowli, medium hodowlane było zastępowane przez pożywki zawierające 0,1% etanolu (kontrola), WNKT (25 μm, 50 μm, 100 μm), CPT (3,7 nm) lub CPT (3,7 nm) i WNKT (25 μm, 50 μm, 100 μm). Wybór stężenia CPT został poprzedzony testami cytotoksyczności. Oznaczanie cytotoksyczności Cytotoksyczność testowanych związków oceniano na podstawie wyników testu WST-1 (Roche Diagnostics GmbH) postępując zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Za pomocą tego testu analizowana była ilość żywych komórek poprzez pomiar aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej. Tylko żywe komórki wykazują zdolność do rozkładu soli tetrazoliowej WST-1 (4,[3(4jodofenylo)-2(4-nitrofenylo- )2H-5-tetrazolo]-1,3-benzenodisiarczan) do barwnego formazanu, którego stężenie koresponduje z ilością aktywnych metabolicznie komórek. Absorbancję wytworzonego w każdym dołku formazanu mierzono przy długości fali 420 nm za pomocą czytnika płytek (UVM340, Biogenet). Przeżywalność komórek wyrażano jako % względem hodowli kontrolnych. Analiza statystyczna Wyniki badań otrzymane z 3-5 niezależnych serii eksperymentów poddano weryfikacji statystycznej stosując
Tab. I. Cytotoksyczność kwasu linolowego (LA), a-linolenowego (ALA), arachidonowego (AA), eikozapentaenowego (EPA) i dokozaheksaenowego (DHA) w komórkach glejaka wielopostaciowego (SNB-19) i ludzkich glejaków (8-MG-BA, 42-MG-BA) wyrażona jako procent przeżywalności komórek eksponowanych na WNKT względem komórek kontrolnych LA a - istotna statystycznie różnica w porównaniu z kontrolą; P<0.03 b - istotna statystycznie różnica w porównaniu z kontrolą; P<0.0003 c - istotna statystycznie różnica w porównaniu do komórek traktowanych EPA i DHA; P<0.0003 średnią arytmetyczną, odchylenie standardowe (SD) oraz jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA i test Tukey a. Za znamienne statystycznie przyjęto zmiany przy poziomie istotności p<0,03. Wyniki badań Wpływ WNKT na przeżywalność komórek Na podstawie spektrofotometrycznego pomiaru ilości barwnego produktu redukcji soli WST-1 obliczono przeżywalność komórek glejaka wielopostaciowego SNB-19, glejaków 8-MG-BA oraz 42-MG-BA po ekspozycji na WNKT w różnych stężeniach. W tabeli I zebrano wyniki przeżywalności komórek, którą wyrażono jako procent kontroli. Ekspozycja komórek 8-MG-BA oraz 42-MG-BA na LA, ALA i AA w testowanych stężeniach nie spowodowała zmian w ich przeżywalności. Obecność w medium hodowlanym DHA lub EPA w stężeniu 100 μm wywoływała w odniesieniu do hodowli kontrolnych istotny spadek przeżywalności komórek obydwu linii glejaków. EPA w stężeniu 100 μm zmniejszał przeżywalność komórek 8-MG-BA o ok. 20%, a komórek 42-MG-BA o ok. 43%. DHA wykazywał zdecydowanie większą toksyczność, w obydwu liniach glejaków przeżywalność wynosiła ok. 23%. Komórki glejaka wielopostaciowego SNB-19 okazały się oporne na działanie wszystkich WNKT w testowanym zakresie stężeń. WNKT ALA AA EPA DHA Stężenie WNKT [ M] Przeżywalność komórek [% kontroli] SNB-19 8-MG-BA 42-MG-BA 25 100.1 ± 4.14 89.27 ± 3.89 98.94 ± 2.34 50 105.8 ± 0.77 88.67 ± 4.16 92.70 ± 1.77 100 102.6 ± 0.52 101.52 ± 39.74 90.14 ± 1.65 25 105.3 ± 2.25 95.09 ± 5.81 100.85 ± 6.50 50 100.1 ± 4.09 95.33 ± 1.35 99.65 ± 5.60 100 100.7 ± 5.12 90.00 ± 1.90 95.05 ± 2.94 25 106.5 ± 4.85 103.88 ± 2.53 106.38 ± 1.76 50 107.9 ± 0.15 105.33 ± 2.27 102.91 ± 4.12 100 108.2 ± 1.02 110.30 ± 1.94 106.49 ± 2.02 25 106.5 ± 1.13 100.30 ± 4.68 106.81 ± 5.31 50 104.8 ± 3.82 116.18 ± 16.31 90.92 ± 5.65 100 102.8 ± 1.73 79.39 ± 4.66 a,c 56.52 ± 4.42 b,c 25 101.4 ± 2.98 102.91 ± 6.62 94.36 ±4.85 50 103.3 ± 0.79 89.48 ± 4.55 90.80 ± 23.80 100 99.68 ± 4.73 22.73 ± 1.40 b,c 22.55 ± 2.88 b,c Wpływ WNKT na cytotoksyczność CPT Komórki glejaka wielopostaciowego SNB-19 oraz glejaków 8-MG-BA i 42-MG-BA charakteryzuje różna wrażliwość na CPT (Tab. II). Obecność tego leku w medium hodowlanym w stężeniu 3,7 nm spowodowała zmniejszenie przeżywalności komórek 8-MG-BA i 42-MG-BA o ok. 47%. Najmniej wrażliwe okazały się komórki SNB-19, których przeżywalność zmniejszyła się o ok. 20%. Nie stwierdzono wpływu LA i ALA na cytotoksyczność CPT w żadnej testowanej linii komórek. Obecność AA w stężeniu 100 μm spowodowała wzrost toksyczności CPT tylko w przypadku komórek SNB-19. Gdy medium hodowlane zawierało DHA lub EPA w stężeniu 100 μm obserwowano wzrost toksyczności CPT względem wszystkich testowanych linii komórek, jednakże największy wzrost wrażliwości na ten lek zaobserwowano w przypadku komórek SNB-19, ich przeżywalność w obecności DHA, jak i EPA zmniejszyła się do ok. 10 % względem kontroli. Spośród testowanych WNKT, DHA w stężeniu 100 μm, w największym stopniu uwrażliwiał wszystkie rodzaje komórek na CPT. Dyskusja WNKT są istotnymi składnikami fosfolipidów błonowych determinującymi strukturę, płynność i przepuszczalność błon. Zarówno w komórkach prawidłowych, jak i nowotworowych WNKT oraz produkty ich utleniania pełnią funkcję wewnątrzkomórkowych, drugorzędowych przekaźników sygnału w procesach różnicowania, proliferacji oraz śmierci komórki. Komórki nowotworowe charakteryzuje niska zawartość WNKT, obniżony poziom cytochromu P-450, który uczestniczy w wytwarzaniu reaktywnych form tlenu (RFT), niskie stężenie NADPH oraz podwyższona aktywność antyoksydacyjna, co powoduje, że w komórkach tych w porównaniu z komórkami prawidłowymi mniej intensywnie zachodzą procesy wolnorodnikowe, co skutkuje niższą zawartością biologicznie aktywnych, pierwotnych i wtórnych produktów peroksydacji lipidów [2, 5]. Wiele rodzajów terapii nowotworów bazuje na indukowaniu stresu oksydacyjnego w komórkach nowotworowych, dlatego zbyt niskie poziomy wrażliwych na utlenianie WNKT są przyczyną mniejszej skuteczności tych terapii. Niski poziom WNKT w komórkach nowotworowych spowodowany jest
Tab. II. Wpływ kwasu linolowego (LA), a-linolenowego (ALA), arachidonowego (AA) eikozapentaenowego (EPA) i dokozaheksaenowego (DHA) na przeżywalność komórek glejaka wielopostaciowego (SNB-19) i ludzkich glejaków (8-MG-BA, 42-MG-BA) hodowanych w obecności cisplatyny (CPT; 3,7 nm). Zmiany w przeżywalności komórek traktowanych CPT oraz WNKT i CPT wyrażono w procentach względem komórek kontrolnych WNKT Stężenie WNKT [ M] Przeżywalność komórek [% kontroli] SNB-19 8-MG-BA 42-MG-BA CPT 0 80.12 ± 2.27 51.98 ± 2.59 55.05 ± 2.38 25 79.98 ± 3.45 50.94 ± 2.00 56.25 ± 2.62 LA + CPT 50 78.39 ± 2.9 51.97 ± 2.30 53.77 ± 3.43 100 81.69 ± 2.96 50.97 ± 2.35 55.16 ± 2.87 25 79.50 ± 3.64 49.88 ± 2.18 a 56.05 ± 2.93 ALA+ CPT 50 81.29 ± 1.58 50.70 ± 3.11 58.05 ± 3.50 100 81.95 ± 2.38 51.25 ± 2.39 57.32 ± 3.09 25 83.44 ± 2.59 50.24 ± 2.72 56.14 ± 1.26 AA+ CPT 50 84.39 ± 3.01 48.89 ± 4.14 57.92 ± 2.69 100 64.72 ± 3.76 a,b 51.88 ± 2.15 53.57 ± 2.51 25 80.36 ± 2.40 49.53 ± 3.86 54.84 ± 3.30 EPA+ CPT 50 75.59 ± 2.14 50.79 ± 1.73 56.34 ± 3.41 100 10.84 ± 0.95 a 38.03 ± 2.18 a,b 40.43 ± 2.94 a,b 25 81.66 ± 2.61 48.81 ± 1.72 56.07 ± 3.24 DHA+ CPT 50 73.69 ± 1.81 a,b 48.60 ± 1.93 53.91 ± 2.13 100 9.88 ± 0.85 a 13.93 ± 2.00 a,b 16.98 ± 1.02 a,b a - istotna statystycznie różnica w porównaniu z komórkami eksponowanymi na CPT; P<0.02 b - istotna statystycznie różnica w porównaniu do komórek traktowanych AA + CPT; EPA + CPT i DHA + CPT; P<0.0003 przede wszystkich utratą lub zmniejszoną aktywnością 6 i 5-desaturaz [8]. Kilka doniesień literaturowych opisuje możliwość modyfikacji profilu WNKT w błonach komórek nowotworowych przez zmianę składu pożywek hodowlanych w warunkach in vitro [9] lub przez zmianę diety zwierząt laboratoryjnych z wszczepionymi nowotworami [10]. Rezultaty licznych badań z użyciem różnych typów komórek nowotworowych wskazują na przeciwnowotworową aktywność WNKT rodzin n-3 oraz n-6 [6, 11, 12]. Nieliczne badania przeprowadzone na ludzkich komórkach glejaków udowodniły, że WNKT są zdolne do indukcji apoptozy tych komórek, jednakże efekty wywoływane przez te kwasy zależą od ich dawki i rodzaju komórek. Dowiedziono, że niskie stężenia WNKT i ich metabolitów mogą stymulować proliferację komórek nowotworowych [7, 12-14]. Wyniki naszych badań pokazują, że spośród testowanych kwasów WNKT, tylko EPA i DHA w stężeniu 100 μm zmniejszały proliferację komórek glejaków 8-MG-BA i 42-MG-BA, przy czym efektywność DHA była większa. Podobne rezultaty opisano w eksperymentach z zastosowaniem komórek glejaka C6, gdzie GLA, AA, EPA i DHA selektywnie zmniejszały przeżywalność komórek nowotworowych oddziałując w niewielkim stopniu lub wcale na komórki prawidłowe [7, 12]. Autorzy niektórych prac uważają, że przeciwnowotworowe działanie EPA i DHA jest związane z odmiennymi mechanizmami działania. EPA hamuje przede wszystkim proliferację komórek, natomiast DHA stymuluje ich apoptozę [7, 12, 14]. Niedawno opublikowane prace potwierdziły, że DHA jak i AA, w odróżnieniu od LA i kwasu oleinowego, są zdolne do indukcji apoptozy w różnych rodzajach komórek raka płuca, a obserwowane efekty zależą od stężenia kwasu i czasu ekspozycji [6, 11]. Żaden z testowanych w przedstawianej pracy WNKT w zakresie stosowanych stężeń nie spowodował zmian w przeżywalności komórek glejaka wielopostaciowego (SNB-19). Mechanizm przeciwnowotworowego działania WNKT nie został dotychczas w pełni poznany. Jedna z postulowanych hipotez przypisuje korzystne działanie WNKT w prewencji i terapii nowotworów ich zdolnościom do generowania RFT oraz ich podatności na wolnorodnikowe utlenianie, co skutkuje nagromadzeniem cytotoksycznych produktów utleniania lipidów i prowadzi do zmian mitochondrialnego metabolizmu, uwalniania cytochromu c, aktywacji kaspaz i w konsekwencji indukcji apoptozy [3, 7, 11-14]. Różnice w biologicznej aktywności pomiędzy WNKT n-6 i n-3 tłumaczy się głównie wpływem tych kwasów na powstawanie prostanoidów. Wydaje się, że przeciwnowotworowe działanie n-3 WNKT wynika przede wszystkim z redukcji proliferacji komórek nowotworowych na skutek zmniejszenia poziomu PGE 2 [2, 5]. Zarówno WNKT, jak i produkty ich metabolizmu, mogą zmieniać ekspresję niektórych genów i białek [10, 15, 16]. Jednym z głównych problemów związanych z progresją nowotworu jest angiogeneza, która jest związana nie tylko z odżywianiem guza, ale także z migracją komórek nowotworowych. Stwierdzono, że w glejakach nadekspresja VEGF koreluje ze wzrostem ich złośliwości. Udowodniono, że GLA, AA, EPA i DHA mogą wykazywać właściwości antyangiogenne [15, 16]. Egzogenne WNKT modyfikując właściwości błon komórek nowotworowych mogą zwiększać skuteczność terapii przeciwnowotworowej poprzez zwiększenie wnikania leków do wnętrza tych komórek. Ponadto, błonowe WNKT są substratami dla reakcji wolnorodnikowych, które często stanowią jeden z mechanizmów chemioterapii, radioterapii, czy terapii fotodynamicznej [4]. Cytotoksyczna aktywność CPT związana jest z tworzeniem inter- i intramolekularnych wiązań z DNA, co zaburza procesy replikacji, transkrypcji, translacji prowadząc do zatrzymania cyklu komórkowego i aktywacji ścieżek sygnałowych kierujących komórki no-
wotworowe na drogę apoptozy [1]. Dodanie EPA i DHA do hodowli komórek glejaków 8-MG-BA i 42-MG-BA oraz AA, EPA i DHA do hodowli komórek glejaka wielopostaciowego SNB-19 znacznie zwiększyło przeciwnowotworową aktywność CPT względem tych komórek, przy czym najsilniejszy efekt obserwowano w komórkach SNB-19. Rezultaty naszych badań są zgodne wynikami opisującymi wrażliwość komórek glejaków wielopostaciowych A-172 i U-87MG eksponowanych na doksorubicynę w obecności DHA. Udowodniono, że DHA bardziej uwrażliwia komórki glejaka wielopostaciowego na doksorubicynę wtedy, gdy komórki te są oporne na działanie tego kwasu [17]. Wśród zastosowanych w pracy linii komórek nowotworowych najmniejszą wrażliwością nie tylko na WNKT, ale także na CPT charakteryzowały się komórki glejaka wielopostaciowego SNB-19. Kilka badań in vitro oraz in vivo opisuje wzrost przeciwnowotworowej aktywności CPT w obecności DHA. Inkubacja CPT-wrażliwych (GLC-4) i opornych (GLC-4- CP) komórek drobnokomórkowego raka płuca z nietoksycznymi stężeniami DHA skutkowała zwiększonym wbudowywaniem się DHA w błony komórek nowotworowych i 3 krotnym spadkiem oporności na CPT tylko komórek GLC-4-CP. W przypadku komórek GLC-4 nie obserwowano zmian cytotoksyczności tego leku. Stwierdzono, że DHA w obydwu liniach zwiększał wewnątrzkomórkowe poziomy CPT, całkowite jej wiązanie do DNA oraz tworzenie interi intramolekularnych wiązań z DNA [9]. Podobne efekty obserwowano w przypadku ekspozycji na EPA opornych i wrażliwych na CPT komórek raka jajnika. EPA uwrażliwiał na działanie CPT tylko komórki oporne na ten lek [18]. Yam i wsp. [19] obserwowali korzystniejszy efekt terapeutyczny CPT u myszy z rakiem płuca karmionych dietą wzbogaconą 4 % oleju rybnego w porównaniu z grupą myszy karmionych dietą zawierającą 5 % oleju sojowego. Olej rybny obfituje w EPA i DHA, a olej sojowy stanowi bogate źródło LA. Korzystną rolę kwasów omega-3 w hamowaniu powstawania komórek nowotworowych i zwiększeniu skuteczności CPT potwierdzili Elmesary i wsp. [20], którzy stosując model zwierzęcy badali przeciwnowotworowe właściwości DHA w połączeniu lub nie z CPT. Wyniki tych eksperymentów pokazały, że DHA redukował wielkość guza i zwiększał pozytywne efekty chemioterapii CPT. Jednocześnie DHA ochraniał przed niepożądanymi efektami wywoływanymi przez CPT oraz znosił letalną nefrotoksyczność indukowaną przez ten lek. Brak oddziaływania LA lub ALA na komórki glejaków 8-MG-BA i 42-MG-BA oraz glejaka wielopostaciowego SNB-19 można tłumaczyć krótszą długością łańcucha węglowego, niższym stopniem nienasycenia tych kwasów oraz zmniejszoną aktywnością desaturaz w komórkach nowotworowych, co hamuje przekształcanie tych kwasów w bardziej aktywne AA, EPA, czy DHA. Wnioski 1. Spośród testowanych WNKT, tylko EPA i DHA w stężeniu 100 μm zmniejszały proliferację komórek glejaków 8-MG-BA i 42-MG-BA, przy czym większą cytotoksyczność wykazywał DHA. Komórki glejaka wielopostaciowego SNB-19 były niewrażliwe na wszystkie testowane WNKT w zakresie stosowanych stężeń. 2. Komórki glejaka wielopostaciowego SNB-19 charakteryzowały się mniejszą wrażliwością na CPT niż komórki 8-MG-BA i 42-MG-BA. Dodanie EPA i DHA do hodowli komórek glejaków 8-MG-BA i 42-MG-BA oraz AA, EPA i DHA do hodowli komórek glejaka wielopostaciowego SNB-19 zwiększyło przeciwnowotworową aktywność CPT. Największy wzrost wrażliwości na CPT zaobserwowano w przypadku komórek SNB-19. 3. Zwiększenie aktywności przeciwnowotworowej CPT w obecności AA, EPA lub DHA wskazuje na korzystne efekty WNKT podczas terapii przeciwnowotworowej z zastosowaniem CPT mogące poprawić skuteczność leczenia. Praca finansowana z tematu badań własnych SUM nr KNW-2-005/10. Piśmiennictwo 1. Siddik ZH. Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance. Oncogene 2003; 22: 7265-7279. 2. Berquin IM, Edwards IJ, Chen YQ. Multi-targeted therapy of cancer by omega-3 fatty acids. Cancer Lett 2008; 269: 363-377. 3. Siddiqui RA, Harvey K, Stillwell W. Anticancer properties of oxidation products of docosahexaenoic acid. Chem Phys Lipids 2008; 153: 47-56. 4. Pardini RS. Nutritional intervention with omega-3 fatty acids enhances tumor response to anti-neoplastic agents. Chem Biol Interact 2006; 162: 89-105. 5. Eynard AR. Potential of essential fatty acids as natural therapeutic products for human tumors. Nutrition 2003; 19: 386-387. 6. Trombetta A i wsp. Arachidonic and docosahexaenoic acids reduce the growth of A549 human lung-tumor cells increasing lipid peroxidation and PPARs. Chem Biol Interact 2007; 165: 239-50. 7. Leaver HA i wsp. Antitumour and pro-apoptotic actions of highly unsaturated fatty acids in glioma. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2002; 66: 19-29. 8. Slagsvold JE i wsp. Regulation of desaturase expression in HL60 cells. Scand J Clin Lab Invest 2007; 67: 632-642. 9. Timmer-Bosscha H i wsp. Influence of docosahexaenoic acid on cisplatin resistance in a human small cell lung carcinoma cell line. J Natl Cancer Inst 1989; 81: 1069-1075. 10. Nasrollahzadeh J i wsp. The influence of feeding linoleic, gamma-linolenic and docosahexaenoic acid rich oils on rat brain tumor fatty acids composition and fatty acid binding protein 7 mrna expression. Lipids Health Dis 2008; 7: 45. 11. Serini S i wsp. Dietary polyunsaturated fatty acids as inducers of apoptosis: implications for cancer. Apoptosis 2009; 14: 135-152. 12. Leonardi F i wsp. Effect of arachidonic, eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids on the oxidative status of C6 glioma cells. Free Radic Res 2005; 8: 865-874.
13. Leaver HA i wsp. Intracellular oxidation by human glioma cell populations: effect of arachidonic acid. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2004; 70: 449-453. 14. Leonardi F i wsp. Docosahexaenoic acid supplementation induces dose and time dependent oxidative changes in C6 glioma cells. Free Radic Res 2007; 41: 748-756. 15. Spencer L i wsp. The effect of omega-3 FAs on tumour angiogenesis and their therapeutic potential. Eur J Cancer 2009; 45: 2077-2086. 16. Miyake JA, Benadiba M, Colquhoun A. Gamma-linolenic acid inhibits both tumour cell cycle progression and angiogenesis in the orthotopic C6 glioma model through changes in VEGF, Flt1, ERK1/2, MMP2, cyclin D1, prb, p53 and p27 protein expression. Lipids Health Dis 2009; 8: 8. 17. Rudra PK, Krokan HE. Cell specific enhancement of doxorubicin toxicity in human tumor cells by docosahexaenoic acid. Anticancer Res 2001; 21: 29-38. 18. Plumb JA, Luo W, Kerr DJ. Effect of polyunsaturated fatty acids on the drug sensitivity of human tumor cell lines resistant to either cisplatin or doxorubicin. Brit J Cancer 1993; 67: 728-733. 19. Yam D, Peled A, Shinitzky M. Suppression of tumor growth and metastasis by dietary fish oil combined with vitamins E and C and cisplatin. Cancer Chemother Pharmacol 2001; 47: 34-40. 20. El-Mesery M i wsp. Chemopreventive and renal protective effects for docosahexaenoic acid (DHA): implications of CRP and lipid peroxides. Cell Div 2009; 4: 6. data otrzymania pracy: 01.07.2010r. data akceptacji do druku: 14.07.2010r. Adres do korespondencji: dr n. farm. Alicja Zajdel Katedra i Zakład Biofarmacji SUM ul. Narcyzów 1 41-200 Sosnowiec tel. +48 32 364 10 63 e-mail: azajdel@sum.edu.pl