MIKROSKOP I TECHNIKA MIKROSKOPOWANIA Budowa i działanie mikroskopu Jednym z podstawowych urządzeń w laboratorium mikrobiologicznym jest mikroskop. SłuŜy on do obserwacji drobnoustrojów, ich wielkości, kształtu, naturalnego ułoŝenia komórek czy zdolności ruchu. W konstrukcji mikroskopu sa połączone dwa układy: optyczny i mechaniczny. Układ optyczny składa się z dwóch połączonych ze soba części: oświetleniowej i powiększającej. Pierwsza słuŝy do optymalnego oświetlenia obserwowanego obiektu (preparatu), natomiast druga do dwustopniowego powiększenia jego obrazu. Układ mechaniczny zapewnia właściwe połoŝenie poszczególnych elementów układu optycznego. W mikroskopie powstający obraz jest prosty, powiększony i pozorny. Budowa
Technika mikroskopowania przy uŝyciu obiektywów immersyjnych WyróŜniamy obiektywy suche (powietrzne) i mokre (immersyjne, zanurzeniowe). Obiektywy suche powiększają do 60 razy, immersyjne 90 do 150 razy. Obiektyw immersyjny jest oznaczony jako OIL lub IMMERSION OIL. Imersja polega na wypełnieniu cieczą (olejkiem immersyjnym) przestrzeni pomiędzy szkiełkiem podstawowym (preparatem) a obiektywem. W przypadku obiektywów suchych we wspomnianej przestrzeni, na drodze światła znajduje sie powietrze. Instrukcja ustawienia preparatów: 1) Ustawić mikroskop 10-15 cm od krawędzi stołu, sprawdzić czystość mikroskopu, optyczne części (obiektyw, okular) przetrzeć miękką, sucha ściereczką. 2) Włączyć źródło światła (z tyłu obudowy), otworzyć przysłonę kondensora znajdującą sie pod stolikiem. 3) Przekręcając śrubą makrometryczna podnieść tubus tak, aby obiektywy znalazły sie do 5 cm nad stolikiem. 4) Włączyć w os optyczna mikroskopu obiektyw immersyjny o powiększeniu 100x (poprzez obrót rewolweru). 5) Na preparat nanieść krople olejku immersyjnego. Przygotowany preparat umieścić na stoliku i docisnąć zaciskami. 6) Patrząc z boku zbliŝyć maksymalnie stolik z preparatem do soczewki obiektywu tak, aby koniec soczewki zanurzył sie w naniesionej kropli olejku immersyjnego. 7) Następnie patrząc w okular, przy uŝyciu śruby makrometrycznej, bardzo wolno opuszczać stolik aŝ do ujrzenia konturu badanego obiektu. Ostrość obrazu nastawić za pomocą śruby mikrometrycznej. 8) Przeprowadzić korektę oświetlenia. W przypadku zbyt słabego oświetlenia naleŝy podwyŝszyć połoŝenie zespołu oświetlającego (kondensora). Regulować kontrast i ostrość obrazu za pomocą przysłony. 9) Szukać nowych obrazów mikroskopowych przy uŝyciu śruby do przesuwania preparatu w osi X/Y pamiętając, aby soczewka była zawsze zanurzona w olejku immersyjnym. 10) Po zakończeniu mikroskopowania usunąć preparat ze stolika, a obiektyw przemyć ściereczka namoczona alkoholem do mikroskopu. 11) Zostawić mikroskop z obiektywem o najmniejszym powiększeniu w osi optycznej.
Typy morfologiczne komórek bakteryjnych Metody barwienia: proste i złoŝone Ze względu na złoŝoność technik barwienia preparatów dzieli się je na proste i złoŝone. Barwienie proste, czyli monochromatyczne (jednobarwne) polega na zastosowaniu jednego barwnika do wizualizacji komórek mikroorganizmów (barwienie pozytywne) lub zabarwienia tła preparatu (barwienie negatywne). Barwienie złoŝone, czyli polichromatyczne (wielobarwne) polega na zastosowaniu dwóch lub więcej barwników w ściśle określonej kolejności. Barwienie złoŝone pozytywne Polega na zastosowaniu minimum dwóch barwników w celu zabarwienia komórek na róŝne kolory (barwienie Grama) lub zabarwienia struktur wewnątrzkomórkowych np. przetrwalników i całych komórek (barwienie Wirtza/Schaeffer-Fultona).
Barwienie metodą Grama jest barwieniem róŝnicującym, które pozwala wyodrębnić dwie zasadniczo odmienne grupy bakterii charakteryzujące się inną budową strukturalną ściany komórkowej. WyróŜniamy bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie. W wyniku barwienia metodą Grama bakterie Gram-ujemne barwią się na kolor róŝowy, a bakterie Gram-dodatnie na kolor fioletowy. 1) Fiolet krystaliczny jest zasadowym, słabo rozpuszczalnym barwnikiem, który w roztworze tworzy kationy. Łatwo penetruje przez ścianę komórkową i błonę cytoplazmatyczną bakterii Gramujemnych i Gram-dodatnich wnikając do wnętrza komórki. Na tym etapie wszystkie komórki wybarwione są na fioletowo. 2) Następnie na preparat nanosi się płyn Lugola, który stanowi roztwór jodu w jodku potasu. Jony jodu łatwo przenikają do wnętrza komórki, podobnie jak cząsteczki fioletu krystalicznego. Kationy barwnika reagują z jonami jodu tworząc wielkocząsteczkowe, nierozpuszczalne w wodzie kompleksy. Wszystkie komórki nadal zabarwione są na kolor fioletowy. 3) Trzeci etap polega na naniesieniu odbarwiacza (roztworu alkoholu lub mieszaniny acetonu z alkoholem). Odbarwiacz wnika w warstwy mureiny bakterii powodując dehydratację. W wyniku usunięcia wody następuje zagęszczenie sieci mureiny, a tym samym zmniejszenie pustych przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych. Ponadto w wyniku działania odbarwiacza u bakterii Gram-ujemnych zniszczeniu ulega zewnętrzna błona lipopolisacharydowa eksponując cienką warstwę mureiny. Kompleks barwnika z jodem zostaje uwięziony pod zwartą i grubą warstwą mureiny w komórkach bakterii Gram-dodatnich, natomiast z komórek bakterii Gramujemnych jest on łatwo wymywany odbarwiaczem. Na tym etapie następuje właściwe zróŝnicowanie komórek. Komórki Gram-dodatnie z uwięzionym kompleksem barwnika nadal mają zabarwienie fioletowe, podczas gdy komórki Gram-ujemne stają się bezbarwne po wypłukaniu kompleksu. 4) Ostatnim etapem jest dodatek barwnika kontrastowego safraniny. Barwnik ten, podobnie jak fiolet krystaliczny, wykazuje charakter zasadowy, słabo rozpuszcza się w wodzie, a w roztworze tworzy kationy, które łatwo penetrują poprzez warstwę mureiny i łączą się z ujemnie naładowanymi cząsteczkami takimi jak kwasy tejchojowe, peptydy czy główki fosfolipidów. PoniewaŜ kolor safraniny jest mniej intensywny niŝ fioletu krystalicznego komórki Gram-dodatnie pozostają fioletowe. Bezbarwne komórki Gram-ujemne zabarwione safraniną przyjmują kolor róŝowy.
Przygotowanie preparatu i barwienie bakterii metoda Grama 1. Eze wyŝarzyć w płomieniu palnika (ezy jednorazowego uŝytku nie jałowimy w płomieniu). 2. Eze zanurzyć w roztworze soli fizjologicznej i za jej pomocą nanieść krople soli na powierzchnie odtłuszczonego szkiełka podstawowego. 3. Ponownie wyŝarzyć eze i po jej ostudzeniu w agarze, pobrać niewielka ilość hodowli bakterii z płytki. 4. Próbkę bakterii rozprowadzić równomiernie w kropli soli na szkiełku podstawowym. 5. Pozostawić do wyschnięcia. 6. Preparat utrwalić w płomieniu palnika gazowego (2 3 sek) uŝywając w tym celu pęsety lub szczypiec. 7. Preparat zalać roztworem fioletu krystalicznego na 3 min, po czym spłukać wodą. 8. Preparat barwić płynem Lugola przez 1,5 min i ponownie spłukać wodą. 9. Odbarwić preparat 70% roztworem etanolu 20 sek i przepłukać wodą. 10. Dobarwiać preparat roztworem safraniny lub fuksyny przez 15 sek i znowu obficie płukać wodą. 11. Szkiełko wysuszyć. 12 Preparat oglądać pod mikroskopem pod imersją (obiektyw 100 x).
Barwienie metodą Wirtza (Schaeffer-Fultona) jest przykładem barwienia pozytywnego złoŝonego. Pozwala na zabarwienie przetrwalników wewnątrz komórki bakterii. Polega na naniesieniu na utrwalony preparat mikrobiologiczny wodnego roztworu zieleni malachitowej, a następnie kilkukrotnym podgrzaniu szkiełka podstawowego w płomieniu palnika do zagotowania barwnika. Zieleń malachitowa w podwyŝszonej temperaturze penetruje przez powłoki przetrwalnika zabarwiając go podobnie jak komórkę wegetatywną. Kolejnym etapem jest przemywanie preparatu wodą - dekoloryzacja. Barwnik silnie zaadsorbowany we wnętrzu przetrwalnika nie zostaje z niego wypłukany w przeciwieństwie do komórki bakterii, która się odbarwia. Bezbarwną komórkę wegetatywną zabarwia się zasadowym barwnikiem kontrastowym safraniną. W wyniku barwienia przetrwalniki mają zabarwienie zielone, a komórki wegetatywne róŝowe. Barwienie przetrwalników u Bacillus subtilis 1. Bakterie nanieść na szkiełko podstawowe. 2. Po wyschnięciu, preparat utrwalić poprzez trzykrotne przeciągniecie szkiełka podstawowego nad płomieniem palnika. Nie trzymać szkiełka w płomieniu! 3. Na utrwalony preparat nanieść zieleń malachitową, tak, aby całkowicie pokryła powierzchnię z bakteriami, a następnie podgrzewać trzykrotnie w płomieniu palnika aŝ do ukazania się pary. 4. Zmyć zieleń malachitową wodą destylowaną. 5. Nanieść roztwór safraniny i pozostawić przez 1 minutę. 6. Preparat spłukać wodą i pozostawić do wyschnięcia. Wykrywanie katalazy - róŝnicowanie gronkowców (katalazo +) od paciorkowców (katalazo -) Próbę wykonuje się przez zawieszenie badanych bakterii, pobranych z hodowli na poŝywce stałej, w kropli 3% wody utlenionej na szkiełku podstawowym. Bakterie mogą tez zostać zawieszone w probówce (gęsto) i wodę utlenioną dodajemy do probówki. Uwalnianie pęcherzyków tlenu świadczy o wyniku dodatnim. Wykonanie- w probówce z 1ml NaCl zawiesić szczep gronkowca, w drugiej probówce szczep paciorkowca. Dodać kilka kropli 3% wody utlenionej. Pojawienie się bąbelków powietrza świadczy o rozkładzie wody utlenionej przez katalazę.
Diagnostyka paciorkowców. Typy hemolizy alpha, beta i gamma. Poszczególne gatunki paciorkowców są klasyfikowane głównie na podstawie ich właściwości hemolitycznych. Hemoliza alfa jest wywołana przez redukcję Ŝelaza w hemoglobinie, dająca zielony kolor na agarze krwawym. Hemoliza beta jest związana z całkowitym rozerwaniem erytrocytów, co daje wyróŝniające się jasne obszary wokół kolonii bakteryjnych. Symbol Grupa/ hemoliza bacytracyna optochina gatunek SP S.pyogenes β W (aglutynacja grupa A) O DP S.pneumoniae α O W SV S.viridans α O O Sβ S. β-hemolityczny β aglutynacja, grupy B, C, D, F, G S sp. S.species γ brak identyfikacji Test lateksowej aglutynacji do identyfikacji grup paciorkowców ß-hemolizujących wg. Lancefield Kolonie do identyfikacji powinny być uzyskane z hodowli na agarze krwawym. Do testu wybieramy kolonie posiadające ß-hemolizę. Bakterie przygotować w postaci zawiesiny. 1. Doprowadzić reagenty do temperatury pokojowej ogrzewając butelki w ręce. Wymieszać zawiesiny poprzez wstrząśnięcie. Usunąć pęcherzyki z kroplomierza. 2. Nanieść 1 kroplę kaŝdego z reagentów na kółko znajdujące się na karcie reakcyjnej. 3. Za pomocą pipety pasterowskiej dodać 1 kroplę zawiesiny bakteryjnej na kaŝde z 6 pól. 4. Kręcić kartą do całkowitego wymieszania zawiesiny z czynnikiem reakcyjnym. Aglutynacja na 1 lub więcej polach zazwyczaj pojawia się po 30 sekundach. Serotypowanie Lancefield - oparte na specyficznych grupach cukrowych w ścianach komórkowych jest uŝywane dla dokładniejszego rozróŝnienia gatunków beta hemolizujących [3]. Noszą one oznaczenia od A do O. W medycynie beta hemolizujące paciorkowce grupy Lancefield A i B mają największe znaczenie. Dodatkowo, niektóre paciorkowce alfa hemolizujące (szczególnie Streptococcus pneumoniae i viridans) powodują pospolite choroby u człowieka. Grupa A Streptococcus pyogenes (paciorkowiec ropny) jest czynnikiem sprawczym paciorkowcowego zapalenia gardła, prowadzącego czasami do ostrej gorączki reumatycznej, płonicy (szkarlatyny), róŝy i ostrego zapalenia kłębuszków nerkowych. Enzymy i toksyny: - hemolizyna -leukocydyna - streptokineaza -DNA-azy
Grupa B Streptococcus agalactiae paciorkowiec bezmleczności powoduje zapalenie opon mózgowordzeniowych u noworodków oraz starszych dzieci, czasami z bakteriemią. Potrafią skolonizować drogi rodne kobiety, podnosząc ryzyko przedwczesnego rozerwania błon płodowych. Grupa C NaleŜy do niej Streptococcus equi, który powoduje zołzy u koni, a takŝe Streptococcus zooepidemicus, który powoduje zakaŝenia u kilku gatunków ssaków, w tym koni. Grupa D Wiele paciorkowców grupy D zostało ponownie sklasyfikowanych i umieszczonych w rodzaju Enterococcus (w tym Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus durans i Streptococcus avium). Przykładowo Streptococcus faecalis (paciorkowiec kałowy) nosi teraz nazwę Enterococcus faecalis. Pneumokoki Streptococcus pneumoniae (dwoinka zapalenia płuc) - zwykle występują w jamie nosowej i gardle dzieci i zdrowych dorosłych. Szczególnie u małych dzieci bardzo łatwo dochodzi do zasiedlenia (nosicielstwa) śluzówki nosa i gardła pneumokokami, poniewaŝ dzieci mają niedojrzały układ odpornościowy i nie produkują wystarczającej ilości przeciwciał odpornościowych przeciw temu typowi bakterii. Viridans i inne paciorkowce Streptococcus viridans (paciorkowiec zieleniący) powoduje zapalenie wsierdzia i ropień zęba. Grupa G NaleŜą do niej: Streptococcus canis, Streptococcus dysgalactiae Bacytracyna organiczny związek chemiczny, antybiotyk polipeptydowy o działaniu bakteriobójczym wobec bakterii Gram-dodatnich Około 95% szczepów S.pyogenes (paciorkowca ropnego β-hemolizującego) z grupy A jest wraŝliwych na bacytracynę. jako wraŝliwe uwaŝa się szczepy, których średnica strefy zahamowania wzrostu wokół krąŝka wynosi 11 i powyŝej 11 mm - naleŝy je zidentyfikować jako Streptococcus pyogenes Równocześnie z identyfikacją szczepów badanych naleŝy przeprowadzić kontrolę wobec szczepów wzorcowych: Optochina W sposób wybiórczy hamuje wzrost Streptococcus pneumoniae, co odróŝnia te dwoinki od innych paciorkowców α hemolizujących wraŝliwych na znacznie większe stęŝenia tego związku. Zahamowanie wzrostu wokół krąŝka uwaŝa się za wynik dodatni. Wykonanie: krąŝki z bacytracyną lub optochiną kładziemy na sektorki z posianą hodowlą badanego paciorkowca (siejemy wymazówką z przygotowanej zawiesiny)
Test API 20 Strep jest wystandaryzowanym zestawem zawierającym 20 testów biochemicznych, który daje szerokie moŝliwości. UmoŜliwia on identyfikację grup lub gatunków większości paciorkowców i enterokoków oraz najbardziej powszechnych spokrewnionych drobnoustrojów. Niewątpliwie metoda ta przy uŝyciu odpowiednich kodów stanowi jak dotąd najdoskonalszą i najbardziej uniwersalną metodę identyfikacji bakterii. Test API składa się z 20 miniprobówek z tworzywa wtopionych w pasek równieŝ wykonany z tworzywa. W kaŝdej miniprobówce znajduje się odwodniony substrat i wskaźnik umoŝliwiający odczytanie reakcji. Oznaczenie polega na dodaniu zawiesiny paciorkowców do wszystkich probówek i po inkubacji dodaniu do niektórych probówek odpowiednich odczynników. Zmiany barwy zawartości probówek umoŝliwiają określenie, jakie substraty są rozkładane, czy teŝ jaki rodzaj aktywności enzymatycznej występuje. Określenie grupy lub gatunku dokonuje się na podstawie załączonego przez producenta klucza diagnostycznego. Diagnostyka gronkowców. Symbol Rodzaj i gatunek test na koagulazę wraŝliwość na nowobiocynę oporność na cefoksytynę STAPHYLOCOCCUS aureus + W MRSA SA SE epidermidis - W MRSE SAP saprophyticus - O MRCNS Oznaczanie gronkowcowego czynnika zlepnego (clumping factor, CF) metodą szkiełkową. 1. Na szkiełku podstawowym umieścić obok siebie dwie krople fizjologicznego roztworu chlorku sodowego 2. W obu kroplach zawiesić za pomocą ezy badane bakterie pochodzące z hodowli na podłoŝu agarowym, zawiesina powinna być gęsta, wyglądem przypominać mleko. 3. Do jednej kropli zawiesiny dodać za pomocą ezy (1 oczko) osocza króliczego i delikatnie wymieszać Odczyt: w ciągu kilkunastu sekund powinny pojawiać się wyraźne kłaczki, co dowodzi obecności CF. Zawiesina bakterii bez osocza powinna pozostać homogenna, pojawienie się kłaczków w zawiesinie bez osocza świadczy o autoaglutynacji bakterii i nie moŝe być podstawą do przyjęcia ujemnego lub dodatniego wyniku. Oznaczanie koagulazy metodą probówkową: 1. Do oznaczeń stosuje się osocze królicze nierozcieńczone lub rozcieńczone pięciokrotnie jałowym, fizjologicznym roztworem chlorku sodowego. 2. Do 0,5 ml osocza dodać za pomocą ezy szczep z hodowli z podłoŝa agarowego lub 0,5 ml hodowli bulionowej 3. W taki sam sposób przygotować próbę kontrolną ze szczepami koagulazo-dodatnimi i koagulazoujemnymi. 4. Inkubować w temp. 37ºC.
5. Wynik testu odczytać po 1, 3, 6, 24 godzinach. Odczyt: szczepy koagulazo-dodatnie Staphylococcus aureus powodują powstanie w probówce wyraźnego skrzepu, natomiast koagulazo-ujemne nie powodują krzepnięcia osocza. Wynik testu obserwować we wskazanym powyŝej czasie, poniewaŝ po dłuŝszej inkubacji, w niektórych przypadkach, moŝe nastąpić rozpuszczenie skrzepu przy udziale wytwarzanego przez gronkowca aktywatora plazmowego. Oznaczenie wraŝliwości na nowobiocynę i metycylinę Na podłoŝu opornościowym posiewamy 4 szczepy gronkowców (na sektorkach), na środku umieszczamy krąŝek z nowobiocyną a na środku kaŝdego sektorka krąŝek z cefoksytyną (wykorzystywana do badania oporności na metycylinę zamiast metycyliny) API STAPH jest biochemicznym systemem identyfikacji gronkowców i mikrokoków w oparciu o 19 testów róŝnicujących (wytwarzanie kwasu z 14 węglowodanów, redukcja azotanów do azotynów, wytwarzanie fosfatazy zasadowej, wytwarzanie acety-metylo-karbinolu, dihydrolaza argininy, ureaza). API STAPH składa się z pasków zawierających odwodnione substraty testowe w pojedynczych probówkach. Substraty rozpuszcza się przez dodanie do kaŝdej mikrobrobówki zawiesiny testowanego szczepu. Następnie inkubuje się 18 h (w niektórych przypadkach 48h) w temperaturze 30-37 C. Odczyt i interpretacja zgodnie z informacjami podanymi przez producenta.