UNIWERSYTET GDAŃSKI Pracownia studencka Katedry Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 3 Metody ekstrakcji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA) z gleby LABORATORIUM PRZYRODNICZE Gdańsk, 2011
Wstęp Ćwiczenie obejmuje proste metody ekstrakcji organicznych zanieczyszczeń środowiska z matrycy naturalnej na przykładzie ekstrakcji wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych z gleby. Zostanie zastosowana klasyczna ekstrakcja rozpuszczalnikiem organicznym, wspomagana ultradźwiękami, oraz ekstrakcja w aparacie Soxhleta. Wyekstrahowane związki będą monitorowane z zastosowaniem chromatografii cienkowarstwowej (TLC). UWAGA! TEORIA DO CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ ZNAJDUJE SIĘ W INSTRUKCJI DO ĆWICZENIA NR 1. I. Wprowadzenie 1. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) to obszerna grupa związków chemicznych o budowie pierścieniowej, charakteryzujących się zbliżonymi własnościami fizykochemicznymi. Chociaż znanych jest ponad 100 różnych WWA, najczęściej w środowisku występuje około 17 związków chemicznych. Struktury i nazewnictwo wybranych WWA przedstawiono w Tabeli 1. Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne należą do grupy najpowszechniej występujących, trwałych zanieczyszczeń organicznych. Głównymi źródłami WWA są: produkty niepełnego spalania paliw kopalnych, lotne pyły i popioły powstające ze spalania paliw lub utylizacji odpadów oraz przemysł ciężki (koksownie, rafinerie, huty metali). Szacuje się, iż szczególnie w okresie zimowym, poważnym źródłem WWA w środowisku jest tzw. niska emisja, pochodząca z indywidualnych źródeł ciepła. Jednak najpoważniejszy udział w emisji WWA na terenach zurbanizowanych ma transport samochodowy. Wśród źródeł naturalnych wymienia się pożary lasów i wybuchy wulkanów oraz procesy przemiany materii bakterii, glonów i roślin wyższych. Biosynteza WWA prowadzi do tworzenia tych najbardziej groźnych dla zdrowia człowieka ale w aspekcie ogólnego skażenia, ilości WWA pochodzące ze źródeł naturalnych są niewielkie w porównaniu z ilościami będącymi wynikiem działalności człowieka. WWA pochodzące ze źródeł antropogenicznych nigdy nie występują w środowisku w postaci pojedynczych związków zawsze tworzą mieszaniny wieloskładnikowe o zróżnicowanym składzie, zależnym od rodzaju materiału spalanego oraz warunków, w jakich zachodzi proces spalania. 2
Tabela 1. Wybrane wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne. 3
Najistotniejszym ze zdrowotnego punktu widzenia skutkiem oddziaływania WWA na organizm jest zdolność niektórych z nich do wywoływania zmian nowotworowych. Z tego względu WWA podzielono na nieaktywne, mniej aktywne i bardzo aktywne. Liczne badania dostarczyły dostatecznej ilości danych, by WWA o ilości pierścieni powyżej 3 uznać za rakotwórcze oraz mutagenne. Do tych związków należą m.in. benzo(a)piren, dibenzo(a,h)antracen, benzo(a)antracen, benzo(b)fluoranten, czy dibenzo(a,e)piren. WWA są metabolizowane przez mikrosomalne enzymy cytochromu P 450 do związków mogących tworzyć trwałe połączenia z DNA (np. epoksydy), co w konsekwencji może prowadzić do wysoce prawdopodobnego procesu nowotworzenia. W celu systematycznej oceny toksyczności wszystkich rakotwórczych WWA, wprowadzono tzw. względny współczynnik rakotwórczości (k), odnoszący się do rakotwórczości benzo[a]pirenu (BaP), dla którego przyjęto wartość równą 1. Obecnie jako miarę narażenia na wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne przyjmuje się wskaźnik będący sumą iloczynów stężeń 9 WWA i ich względnych współczynników rakotwórczości (Tabela 2). WWA emitowane z różnych źródeł ulegają stopniowej dystrybucji w środowisku, gdzie ostatecznie deponowane są w glebach (90%) oraz, ze względu na bardzo słabą rozpuszczalność w wodzie, w osadach dennych (9%). Oprócz depozycji WWA z powietrza, związki te trafiają do gleby razem z wodami spływnymi. Wody spływne wymywają np. nawierzchnię dróg, na których znajdują się duże ilości WWA pochodzące: ze spalin samochodowych, ze ścierania opon gumowych przy hamowaniu i z samego asfaltu bogatego we frakcje węglowodorów aromatycznych. Dodatkowym źródłem są także niekontrolowane zrzuty ścieków przemysłowych i bytowo-gospodarczych, a także odcieki ze składowisk odpadów. Substancja Tabela 2. Względne współczynniki rakotwórczości najistotniejszych WWA. Względny współczynnik rakotwórczości k Dibenzo(a,h)antracen 5 Benzo(a)piren 1 Benzo(a)antracen 0,1 Benzo(b)fluoranten 0,1 Benzo(k)fluoranten 0,1 Indeno(1,2,3-c,d)piren 0,1 Antracen 0,01 Chryzen 0,01 Benzo(g,h,i)perylen 0,01 4
2. Metody ekstrakcji związków organicznych Techniki ekstrakcyjne są najczęściej stosowanymi metodami izolacji i wzbogacania analitów występujących w próbkach środowiskowych. Podczas procesu ekstrakcji następuje przeniesienie analitów z próbki (matrycy pierwotnej) do matrycy odbierającej (tzw. wtórnej), która ma zazwyczaj prosty, ściśle zdefiniowany skład chemiczny. Wprowadzenie etapu ekstrakcji do procedury analitycznej daje zazwyczaj następujące korzyści: przeniesienie analitów do matrycy o znacznie prostszym niż matryca pierwotna i jednocześnie jednoznacznie określonym składzie chemicznym, najczęściej bardziej odpowiedniej do oznaczeń końcowych, usunięcie składników przeszkadzających w analizie końcowej, możliwość podniesienia stężenia analitów powyżej granicy oznaczalności stosowanej techniki i przyrządu pomiarowego. Należy jednak pamiętać, że proces ekstrakcji może prowadzić do straty pewnej części analitów i wprowadzać dodatkowe zanieczyszczenia próbki. Próbki gleby z terenów miejskich zawierają znaczne ilości zanieczyszczeń organicznych, związanych głównie z emisją wynikającą ze znacznego ruchu samochodowego. Spośród licznych związków chemicznych trafiających w ten sposób do środowiska, stosunkowo najliczniejsze są węglowodory alifatyczne (głównie n-alkany) oraz węglowodory aromatyczne, w tym szczególnie niebezpieczne dla zdrowia wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA). Ekstrakcja n- alkanów oraz wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych z gleby jest przykładem ekstrakcji próbek stałych. Ze względu na zbliżone właściwości fizykochemiczne obu tych grup substancji, nie ma możliwości oddzielenia związków alifatycznych od aromatycznych na etapie ekstrakcji. Zastosowanie technik chromatograficznych (np. chromatografii kolumnowej lub cienkowarstwowej) pozwala na dokonanie takiego rozdzielenia. Zdecydowanie najczęściej stosowaną metodą ekstrakcji jest ekstrakcja cieczą. Polega ona na wybiórczym rozpuszczaniu substancji znajdującej się w stałej próbce w określonym rozpuszczalniku. Obecnie stosowane techniki ekstrakcji próbek stałych cieczą dzielą się na trzy zasadnicze grupy: Techniki klasyczne, do których zaliczamy: ekstrakcję rozpuszczalnikiem z wytrząsaniem, ekstrakcję za pomocą strumienia rozpuszczalnika, ekstrakcję w aparacie Soxhleta oraz homogenizację próbki z rozpuszczalnikiem 5
Nowoczesne techniki z wykorzystaniem dodatkowych czynników do wspomagania ekstrakcji (ultradźwięki czy promieniowanie mikrofalowe); do tej grupy technik ekstrakcji należy sonikacja, przyspieszona ekstrakcja z pomocą rozpuszczalnika (ASE), ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika pod zwiększonym ciśnieniem (MPLE), ekstrakcja z pomocą rozpuszczalnika wspomagana promieniowaniem mikrofalowym (MAE) Techniki, w których wykorzystuje się płyny w stanie nadkrytycznym (SFE) Przegląd wymienionych technik pod kątem czasu trwania ekstrakcji oraz zużycia rozpuszczalników znajduje się w Tabeli 2. Tabela 2. Porównanie różnych technik ekstrakcji cieczą (J. Namieśnik, Z. Jamrógiewicz, M. Pilarczyk, L. Torres, Przygotowanie próbek środowiskowych do analiz, WNT Warszawa, 2000). Technika ekstrakcyjna Ilość zużywanego rozpuszczalnika [ml] Przeciętny czas trwania procesu ekstrakcji [h] Ekstrakcja w aparacie Soxhleta 200 500 4 48 Ekstrakcja w zautomatyzowanym aparacie Soxhleta Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika wspomaganego ultradźwiękami Ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika wspomaganego promieniowaniem mikrofalowym Przyśpieszona ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika Ekstrakcja za pomocą płynu w stanie nadkrytycznym 50 100 1 4 100 300 0,5 1 25 50 0,5 1 15 40 0,1 0,3 8 50 0,5 2 Często stosowanym aparatem do ekstrakcji w układzie ciecz ciało stałe jest aparat Soxhleta (Rysunek 1). Aparat Soxhleta składa się z trzech części, połączonych najczęściej za pomocą szlifów: kolby kulistej (1), ekstraktora (2) i chłodnicy zwrotnej (3). Ciało stałe umieszcza się w gilzie (4) wykonanej z grubej bibuły, tkaniny bądź siatki z cienkiego drutu. W kolbie znajduje się lotny rozpuszczalnik, który wrze przy podgrzewaniu kolby za pomocą płaszcza grzejnego (7), a jego pary rurką (5) przechodzą do chłodnicy zwrotnej. Po skropleniu rozpuszczalnik gromadzi się w środkowej części aparatu (2), gdzie znajduje się gilza. Ciecz z wyekstrahowaną substancją samoczynnie, poprzez zamknięcie syfonowe (6), przelewa się do kolby, skąd rozpuszczalnik jest ponownie oddestylowywany. Dzięki zamkniętemu obiegowi i destylacji rozpuszczalnika próbkę 6
można ekstrahować wielokrotnie świeżymi porcjami, przy stosunkowo niewielkiej ilości użytego medium ekstrahującego. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta jest procesem dość powolnym, jednak nie wymaga ciągłego nadzoru. Zastosowanie automatycznych zestawów do prowadzenia ekstrakcji przyśpiesza jej przebieg oraz umożliwia zmniejszenie zużycia rozpuszczalników. Rysunek 1. Zestaw do ekstrakcji w aparacie Soxhleta. 3. Detekcja wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych Substancje, analizowane metodą chromatografii cienkowarstwowej w Ćwiczeniu nr 1, były związkami barwnymi, przez co nie wymagały żadnej metody wywoływania chromatogramu (uwidocznienia plam poszczególnych związków). Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, choć także są często barwne, nie występują w środowisku w stężeniu wystarczającym, aby zlokalizować je na płytce TLC gołym okiem bez zastosowania dodatkowej metody wizualizacji. Przy ich analizie często wykorzystuje się fakt, iż są one zdolne do absorbowania promieniowania elektromagnetycznego w zakresie UV-Vis (długości fali 180-800 nm). Zdolność ta jest związana z obecnością w cząsteczce pierścieni aromatycznych, które zaliczamy do tzw. chromoforów. Określenie chromofor odnosi się do grup funkcyjnych w cząsteczkach związków chemicznych, absorbujących promieniowanie we wspomnianym zakresie. Poza pierścieniami aromatycznymi, do chromoforów zaliczamy m. in. grupy karbonylowe, wiązania wielokrotne węgiel-węgiel, grupy 7
nitrowe. Ich wspólną cechą jest posiadanie w strukturze elektronów π. Wśród analizowanych zanieczyszczeń gleby, poza WWA znajdują się także nasycone węglowodory alifatyczne, które nie posiadają w swojej strukturze chromoforów. Z tego względu, zastosowana technika wizualizacji (promieniowanie UV) pozwoli na uwidocznienie plam na chromatogramie TLC, odpowiadających węglowodorom aromatycznym, natomiast nie umożliwi detekcji węglowodorów alifatycznych. II. Wykonanie ćwiczenia 1. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z prostymi technikami ekstrakcji związków organicznych z matrycy środowiskowej (ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami, ekstrakcja w aparacie Soxhleta) wraz z techniką monitorowania procesu ekstrakcji (chromatografia cienkowarstwowa). 2. Próbki gleby Próbki gleby pochodzą z okolic Wydziału Chemii UG. Glebę pobrano metalową łopatką i umieszczono w szklanych pojemnikach. Po przyniesieniu do laboratorium próbki rozłożono cienką warstwą na folii aluminiowej, usuwając duże cząstki roślinne i kamienie, i pozostawiono do wysuszenia. Tak wysuszona gleba nazywa się glebą powietrznie suchą. Przed procedurą ekstrakcji należy rozetrzeć glebę w moździerzu tak, aby miała w miarę jednorodne uziarnienie. 3. Ekstrakcja gleby wspomagana ultradźwiękami Powietrznie suchą glebę rozetrzeć w moździerzu. Odważyć próbkę o masie około 20 g. Naważkę gleby umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 100 ml, dodać 50 ml mieszaniny eteru naftowego i dichlorometanu (3:2, v:v). Kolbę umieścić w łaźni ultradźwiękowej na 15 min. Następnie osad zdekantować, ekstrakt przesączyć przez bezwodny siarczan sodu umieszczony na sączku z bibuły filtracyjnej do kolbki okrągłodennej o pojemności 100 ml. Do gleby dodać świeżą porcję 25 ml mieszaniny eteru naftowego i dichlorometanu i ekstrahować w łaźni ultradźwiękowej 10 min, następnie przesączyć przez ten sam sączek. Połączone ekstrakty odparować na odparowywaczu obrotowym, w temperaturze łaźni wodnej nieprzekraczającej 40ºC, do objętości około 3-5 ml i pozostawić do analizy TLC. 8
4. Ekstrakcja gleby w aparacie Soxhleta Powietrznie suchą glebę rozetrzeć w moździerzu. Odważyć próbkę o masie około 20 g. Przenieść odważoną próbkę do gilzy, od góry gilzę zamknąć watą i całość umieścić w nasadce ekstrakcyjnej. Do kolby okrągłodennej wprowadzić kamyki wrzenne, wlać 120 150 ml eteru naftowego (według zaleceń prowadzącego), kolbę umieścić w płaszczu grzejnym, zamontować na niej aparat Soxhleta i chłodnicę zwrotną. Włączyć przepływ wody chłodzącej i rozpocząć ogrzewanie. Utrzymywać stan łagodnego wrzenia przez 1 godzinę (czas ekstrakcji). Wyłączyć ogrzewanie, zawartość kolby okrągłodennej przenieść do kolby o pojemności 250 ml. Ekstrakt odparować na odparowywaczu obrotowym, w temperaturze łaźni wodnej nieprzekraczającej 40ºC, do objętości około 3-5 ml i pozostawić do analizy TLC. 5. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) Należy wykonać analizy TLC ekstraktów gleby oraz wzorca WWA przy użyciu fazy ruchomej cykloheksan : toluen (67:33, v:v). Napełnić komorę chromatograficzną fazą ruchomą (V = 3 ml) i pozostawić na około 5-10 min. W tym czasie przygotować płytki TLC, czyli narysować delikatnie miękkim ołówkiem: linię startową - około 0,8 cm od dolnego brzegu płytki i zaznaczyć na niej punkty nanoszenia próbek, linię końcową - około 1 cm od górnego brzegu płytki. Nanieść na płytkę po około 3-5 μl roztworów badanych próbek, uważając, aby plamka nie miała średnicy większej niż 5 mm. Należy powtórzyć nanoszenie każdego roztworu 5-6 razy, za każdym razem czekając, aż naniesiony rozpuszczalnik odparuje (można użyć suszarki do włosów). Delikatnie, przy pomocy pęsety, wstawić płytkę TLC z naniesionymi substancjami do komory chromatograficznej; boki płytki nie mogą dotykać ścian komory. Zamknąć komorę i rozwijać chromatogram, do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika będzie w odległości 1 cm od górnego brzegu płytki, następnie wyjąć i wysuszyć płytkę, po czym za pomocą pęsety umieścić ją pod lampą UV i ołówkiem obrysować widoczne plamki. Wyznaczyć i porównać współczynnik (lub zakres współczynników) opóźnienia RF dla wzorca oraz substancji obecnych w badanych ekstraktach. 9
6. Sprawozdanie Sprawozdanie powinno zawierać: krótki wstęp teoretyczny, schemat wykonania ćwiczenia, wyniki uzyskane według punktu 5 oraz krótką ich dyskusję (przydatność metod ekstrakcji, porównanie wyników dla wzorca oraz ekstraktów). Literatura 1. Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej. W-wa, PWN, 1996. 2. Kocjan R. Chemia analityczna, podręcznik dla studentów, W-wa, PZWL, 2000, tom 2. 3. Staszewski R. Kontrola chemicznych zanieczyszczeń środowiska, Podstawy teoretyczne z ćwiczeniami laboratoryjnymi, Politechnika Gdańska, Gdańsk,1990. 4. Namieśnik J. Metody instrumentalne w kontroli zanieczyszczeń środowiska. J., Politechnika Gdańska, Gdańsk,1992. Szkło i odczynniki roztwory wzorcowych WWA, eter naftowy destylowany, toluen destylowany, cykloheksan destylowany, dichlorometan destylowany, bezwodny siarczan(vi) sodu cz.d.a., rozpuszczalniki do mycia. aparat Soxhleta kamyczki wrzenne kolba stożkowa o poj. 50 ml 2 szt, kolba stożkowa o poj. 100 ml 1 szt, cylindry miarowe o poj. 10 ml - 1 szt., 25 ml - 1 szt., 50 ml - 1 szt, pipeta z tłoczkiem lub strzykawka szklana o poj. 2 ml - 2 szt, lejek szklany - 1 szt, kolba okrągłodenna poj. 100 ml - 1 szt, kolba okrągłodenna poj. 250 ml - 1 szt, łyżka metalowa - 2 szt, moździerz porcelanowy - 1 szt, 10
sączki z bibuły filtracyjnej, naczynie szklane na próbkę gleby, komora chromatograficzna 2 szt., płytki TLC, strzykawka o poj. 10 μl z płasko zakończoną igłą lub kapilary, pęseta, odparowywacz obrotowy, lampa UV, ołówek, linijka, suszarka ręczna, rękawice ochronne, lateksowe. 11