ĆWICZENIE 3 DGGE- ELEKTROFOREZA W ŻELU Z GRADIENTEM CZYNNIKA DENATURUJĄCEGO CZĘŚĆ TEORETYCZNA Metody badań i cechy w oparciu o które przeprowadzana jest klasyfikacja i identyfikacja mikroorganizmówh Struktura zespołów bakterii w glebie nieskażonej i skażonej metalami ciężkimi DGGE- metoda, jej podstawy teoretyczne i praktyczne Zastosowanie metody PCR-DGGE
CZĘŚĆ PRAKTYCZNA 1. Analiza molekularna DNA bakterii z gleby pozakorzeniowej i ryzosferowej z wykorzystaniem metody DGGE. UWAGA!!! AKRYLAMID I FORMAMID TO ZWIĄZKI TOKSYCZNE!!! PODCZAS KOLEJNYCH CZYNNOŚCI ZAWSZE UŻYWAJ RĘKAWICZEK!!! a) Odczynniki. 40% Akrylamid/Bis (37:5;1) Odczynnik Ilość odczynnika Akrylamid 38,93 g Bis-akrylamid 1,07 g H 2 O dejonizowana Dopełnić do 100 ml Przefiltrować przez filtr 0,45 u i przechowywać w 4 o C Bufor 50x TAE Odczynnik Ilość odczynnika Stężenie końcowe Tris base 242,0 g 2 M Lodowy kwas octowy 57,1 ml 1 M 0,5 M EDTA ph 8,0 100,0 ml 50 mm H 2 O dejonizowana Dopełnić do 1000 ml - Wymieszać, autoklawować przez 20-30 minut, przechowywać w temp. pokojowej Bufor 1x TAE Odczynnik Ilość odczynnika Bufor 50x TAE 140 ml H 2 O dejonizowana 6860 ml Objętość końcowa 7000 ml Procentowość żelu Wielość rozdzielanych cząsteczek 6% 300-1000 bp 8% 200-400 bp 10% 100-300 bp
0% roztwór denaturujący Żel 6% Żel 8% Żel 10% Żel 12% 40% Akrylamid/Bis 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml Bufor 50x TAE 2 ml H2O dejonizowana 83 ml 78 ml 73 ml 68 ml Objętość całkowita 100 ml Odgazuj przez 10-15 min. Przefiltrować przez filtr 0,45 u i przechowywać w 4 o C w brązowej butelce do 1 miesiąca. b) Objętość żelu. 100% roztwór denaturujący Żel 6% Żel 8% Żel 10% Żel 12% 40% Akrylamid/Bis 15 ml 20 ml 25 ml 30 ml Bufor 50x TAE 2 ml Formamid (dejonizowany) 40 ml Mocznik 42 g H 2 O dejonizowana Do 100 ml Objętość całkowita 100 ml Odgazuj przez 10-15 min. Przefiltrować przez filtr 0,45 u i przechowywać w 4 o C w brązowej butelce do 1 miesiąca. Po wyjęciu z lodówki wymaga on rozpuszczenia. 10% nadsiarczan amonu (APS) Odczynnik Ilość odczynnika Nadsiarczan amonu 0,1 g H 2 O dejonizowana 1,0 ml Przechowywać w -20 o C do ok. tygodnia. Żel jest nakładany za pomocą dwóch strzykawek (dla niskiego i wysokiego stężenia czynnika denaturującego). W zależności od wielkości żelu, rozmiaru spacera dobiera się odpowiednią objętość żelu pobieranego w strzykawkach. Jest ona nieco większa od właściwej objętości żelu, co umożliwia właściwe wypełnienie przestrzeni między szybami. Rozmiar spacera Rozmiar żelu Objętość w strzykawce Miejsce regulacji objętości 1,00 mm 16 x 16 cm 16 ml 14,5 Objętość żelu to 30 ml
c) Podgrzewanie buforu do elektroforezy. Wypełnić urządzenie 7 l buforu 1x TAE. Ustawić temperaturę na 65 o C i włączyć urządzenie. Czas podgrzewania buforu to ok. 1,5-2 godziny. d) Składanie kanapki i wylewanie żelu z równoległym gradientem czynnika denaturującego. Na większą szklaną szybę połóż spacery a następnie mniejszą szybę. Ustaw klamry strzałkami do siebie, włóż w nie szyby i dokręć śruby. Sprawdź czy szyby są ułożone do siebie równolegle. Zmontowaną kanapkę umieść w statywie. Poluzuj delikatnie śruby i wsuń między szyby kartę wyrównującą w celu ustawienia spacerów. Usuń kartę i zakręć śruby, dociśnij kanapkę do szarej gąbki. Uszczelnij kanapkę w statywie. Należy wykonać to dokładnie aby żel nie wyciekł podczas wylewania.
Przygotuj strzykawki, ustaw w urządzeniu do wylewania gradientu, ustaw pokrętło (pozycja 14,5). Połącz ze sobą rurki, które po złożeniu utworzą literę Y. Najkrótszą z nich połącz z igłą i przymocuj taśmą do szczeliny między szybami. Przygotuj odpowiednią objętość roztworów o niskiej i wysokiej gęstości czynnika denaturującego. Do każdego dodaj APS, a następnie TEMED. OD MOMENTU DODANIA TEMED u ŻEL ZACZYNA POLIMERYZOWAĆ. W CZASIE 7-10 MINUT NALEŻY WYLAĆ ŻEL!!! Po pobraniu do strzykawek przygotowanych roztworów usuń pęcherzyki powietrza i umieść strzykawki w urządzeniu. Połącz rurki. Delikatnie przekręcaj pokrętło aż do momentu całkowitego usunięcia żelu ze strzykawek. Natychmiast umyj strzykawki i rurki aby żel nie spolimeryzował w tych elementach. Ostrożnie włóż grzebień między szyby w celu utworzenia studzienek. Żel polimeryzuje ok. 60 minut. e) Elektroforeza. Po spolimeryzowaniu żelu usuń grzebień. Kanapkę wyciągnij ze statywu i połącz z rdzeniem do elektroforezy. Jeżeli bufor w aparacie jest już nagrzany, wyłączyć urządzenie i umieścić rdzeń w aparacie. Ponownie włączyć urządzenie aby została osiągnięta odpowiednia temperatura.
Przed nałożeniem prób należy przemyć kieszonki buforem. Delikatnie nałóż próby DNA do kieszonek. Załącz urządzenie. Żel rozwija się ok. 16 godzin. f) Wyjmowanie żelu. Wyciąg rdzeń ze zbiornika. Odepnij kanapkę od rdzenia. Ściągnij klamry. Podważ mniejszą szybę i zrzuć żel. g) Barwienie żelu. Przenieś żel z szyby do naczynia zawierającego 250 ml buforu 1x TAE i 25 µl bromku etydyny (10 mg/ml). Wybarwianie trwa 5-15 minut. Po tym czasie przenieś żel do czystego buforu. Odbarwianie trwa 5-20 minut. Zrobić zdjęcie. Przeprowadzić analizę otrzymanych wyników. Wyciągnąć wnioski. 2. Odczyt z izolacji bakterii z gleby pozakorzeniowej, ryzosferowej, ryzoplanu metalofitów. a) Po kilkudniowej inkubacji płytek posianych redukcyjnie sprawdzić, czy uzyskana hodowla jest jednorodna i czy pojedyncze kolonie mają taką samą morfologię jak pobrana kolonia wyjściowa, a więc czy rzeczywiście udało się uzyskać czystą kulturę. Jeżeli tak, to należy przesiać je na skosy z podłożem agarowym aby stworzyć kolekcję bakterii gleby pozakorzeniowej, ryzosferowej, ryzoplanu metalofitów. 3. Odczyt z izolacji bakterii endofitycznych z metalofitów. a) Tak jak w przypadku powyższego podpunktu należy sprawdzić czy na posianych redukcyjnie płytkach uzyskano pojedyncze kolonie. Jeżeli tak to należy przesiać je na skosy z podłożem agarowym aby stworzyć kolekcję bakterii endofitycznych metalofitów.