(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 22.11.2000, PCT/US00/030155 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 211512 (21) Numer zgłoszenia: 355853 (22) Data zgłoszenia: 22.11.2000 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 22.11.2000, PCT/US00/030155 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: 31.05.2001, WO01/37655 (13) B1 (51) Int.Cl. A01N 1/02 (2006.01) (54) Sposób kriokonserwacji plemników z wyłączeniem plemników ludzkich (30) Pierwszeństwo: 24.11.1999, US, 60/167,423 05.01.2000, US, 09/478,299 (73) Uprawniony z patentu: XY, LLC, Navasota, US (43) Zgłoszenie ogłoszono: 31.05.2004 BUP 11/04 (72) Twórca(y) wynalazku: JOHN SCHENK, Fort Collins, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.05.2012 WUP 05/12 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PL 211512 B1

2 PL 211 512 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób kriokonserwacji plemników, z wyłączeniem plemników ludzkich. Wynalazek jest przydatny do konserwacji plemników selekcjonowanych według płci. Ponad pół wieku temu w Stanach Zjednoczonych wprowadzono sztuczną inseminację jako narzędzie w hodowli komercyjnej różnych gatunków ssaków. Chociaż sztuczna inseminacja była początkowo ograniczona do regionów stosunkowo bliskich miejscu zbiórki nasienia, postępy w kriokonserwacji i przechowywaniu nasienia ułatwiły szeroką dystrybucję i handel nasieniem przeznaczonym do sztucznej inseminacji lub zapłodnienia in vitro. Dalsze udoskonalenia w zbiórce nasienia ssaków, selekcji, kriokonserwacji, przechowywaniu i metodach manipulowania zwiększyły możliwości hodowców w produkcji zwierząt mających pożądane cechy. Na przykład, postęp w selekcji nasienia ssaków, opartej na nieznacznych różnicach we właściwościach fizycznych, umożliwiły rozdzielenie plemników według płci, to jest, selekcję komórek zawierających albo chromosom X, albo chromosom Y. Ta technika pozwala hodowcy na manipulowanie odpowiednim procentem plemników X lub Y w próbce, a przez to decydowanie o płci potomstwa. Możliwość selekcji plemników według płci lub jakiekolwiek innej pożądanej cechy dostarcza ważnego narzędzia do przyspieszania postępu genetycznego, wzrostu wydajności produkcji i osiągania większej zdolności przystosowawczej w umiejętnym obchodzeniu się z żywym inwentarzem. Pełne wykorzystanie tego narzędzia zależy jednak od możliwości mrożenia i przechowywania selekcjonowanych plemników. Do selekcji komórek są dopuszczalne różne sposoby; jednak selekcja i dalsza obróbka plemników stanowi wyjątkowe wyzwanie, ponieważ plemniki nie są zdolne do naprawy DNA oraz ze względu na morfologię plemnika. Każdy plemnik ma pokrywający główkę akrosom i witkę, które są ważne dla płodności i stosunkowo łatwo ulegają uszkodzeniu. Ponadto zdolność plemników do zapłodnienia maleje z czasem upływającym między zbiórką a zastosowaniem. Ponieważ większość dostępnych sposobów selekcji wiąże się z fizycznymi stresami i jest czasochłonnych, wyselekcjonowane plemniki są zwykle do pewnego stopnia upośledzone w porównaniu z komórkami nie selekcjonowanymi. Zdolność do zapłodnienia może ulec dalszemu zmniejszeniu, jeżeli technika selekcji wiąże się ze znacznym rozrzedzeniem. Sugerowano, że ten efekt rozrzedzenia może być spowodowany utratą składników ochronnych w plazmie nasienia. Cytometria przepływowa jest szczególnie efektywnym sposobem selekcji, którym można posłużyć się do sortowania plemników według płci. Jednak sortowane plemniki są poddane dodatkowym stresom poza tymi, które normalnie spotyka się w protokołach standardowej sztucznej inseminacji i zapłodnienia in vitro. W szczególności, cytometria przepływowa jest czasochłonna i ze względu na fizyczne ograniczenia cytometrów przepływowych, plemniki do sortowania muszą być rozrzedzane do poziomów, które nie są optymalne do przechowywania (zwykle rzędu 10 5-10 6 /ml). Ponadto, sortowane plemniki przeznaczone do sztucznej inseminacji muszą być zagęszczone tak, aby można było zastosować konwencjonalne pakowanie i sprzęt dostarczający. Potrzeba etapu zagęszczania wystawia zatem już do pewnego stopnia upośledzone plemniki na dodatkowe stresy fizyczne. Mrożenie plemników również niezmiennie zmniejsza ich zdolność do zapłodnienia, ich ruchliwość i/lub żywotność i chociaż sposoby mrożenia nie selekcjonowanych plemników są dobrze znane, nie opisano techniki do kriokonserwowania selekcjonowanych plemników. W opisie patentowym USA nr 4 474 875 opisano sposób rozdzielania plemników w ciekłym ośrodku rozdzielającym z jednolitym gradientem gęstości, dzięki któremu siły wyporu miały tendencję do oddzielania plemników niosących chromosom X od plemników niosących chromosom Y w kolumnie z gradientem gęstości. Plemniki można pobrać z kolumny z populacji na górze i na dole z różnymi charakterystykami płci. Jak ujawniono w tym opisie patentowym zamrażanie prowadzi się w zhomogenizowanym mleku ze stopniowym zwiększaniem zawartości glicerolu. Publikacja WO 99/33956 dotyczy sposobu sztucznej inseminacji ssaków niską dawką seksowanych plemników. Plemniki do takiej inseminacji przygotowuje się przez sortowanie ich według płci i wprowadzenie seksowanych plemników do macicy samicy w ilości mniejszej niż w typowym sztucznym zapłodnieniu. Zapłodnienie zwykle przeprowadza się w ciągu około 29 godzin po sortowaniu plemników. Sposób ten nie obejmuje zatem etapu mrożenia sortowanych plemników ani dodawania do nich rozcieńczalników.

PL 211 512 B1 3 W cytowanej publikacji WO ujawniono ponadto ulepszony układ do cytometrii przepływowej, który pozwala na poprawienie żywotności plemników sortowanych z jego użyciem oraz sposób sortowania plemników. Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu konserwowania plemników przy zastosowaniu niskich temperatur. Sposób ten jest szczególnie przydatny w kriokonserwacji plemników, ponieważ obejmuje izolowanie plemników z próbki selekcjonowanych plemników, następnie dodanie końcowego rozcieńczalnika do wyizolowanych plemników w celu wytworzenia zawiesiny mającej żądane stężenie plemników. Według wynalazku sposób kriokonserwacji plemników z wyłączeniem plemników ludzkich obejmuje: (a) otrzymywanie próbki plemników z wyłączeniem plemników ludzkich; (b) dodawanie do próbki plemników początkowego rozcieńczalnika obejmującego fizjologiczne dopuszczalny nośnik i jeden lub więcej z następujących składników: i) składnik, który utrzymuje osmolalność i buforuje ph; ii) substancję organiczną, która zmniejsza udar chłodowy i zabezpiecza płodność plemników; iii) źródło energii, iv) substancję, która ułatwia kapacytację plemników; i v) antybiotyk, selekcjonowanie plemników metodą cytometrii przepływowej, z wytworzeniem próbki selekcjonowanych plemników, przy czym plemniki są selekcjonowane według płci, a etapy dodawania i selekcjonowania przeprowadza się w dowolnej kolejności; (c) ochłodzenie próbki selekcjonowanych plemników do temperatury 22 C do 5 C przez okres 60 do 240 minut; (d) izolowanie plemników ze schłodzonej próbki selekcjonowanych plemników z uzyskaniem schłodzonych izolowanych plemników; (e) dodawanie końcowego rozcieńczalnika obejmującego oprócz fizjologicznie dopuszczalnego nośnika i krioprotektanta jeden lub więcej z następujących składników: i) składnik, który utrzymuje osmolalność i buforuje ph; ii) substancję organiczną, która zmniejsza udar chłodowy i zabezpiecza płodność plemników; iii) źródło energii, iv) substancję, która ułatwia kapacytację plemników; i v) antybiotyk, do schłodzonych, izolowanych plemników z wytwarzaniem schłodzonej zawiesiny plemników o stężeniu komórek plemników od 1 miliona na mililitr rozcieńczalnika do 300 milionów na mililitr rozcieńczalnika; i (f) mrożenie schłodzonej zawiesiny plemników w temperaturze od 5 C do -100 C. Korzystnie, w tym sposobie jako próbkę selekcjonowanych plemników stosuje się nasienie ssaka, korzystnie wołu, konia lub świni. Korzystnie, krioprotektant stosowany w etapie e) sposobu jest wybrany z grupy składającej się z dicukrów, tricukrów i dowolnej ich kombinacji lub glicerolu, dimetylosulfotlenku, glikolu etylenowego, glikolu propylenowego i dowolnej ich kombinacji. Korzystnie, składnik utrzymujący osmolalność i buforujący ph jest wybrany z grupy składającej się z buforu, którym jest sól, buforu zawierającego węglowodan i dowolnej ich kombinacji lub jest wybrany z grupy składającej się z cytrynianu sodu, Tris[hydroksymetylo]aminometanu, kwasu N-Tris[hydroksymetylo]metylo-2-aminoetanosulfonowego, glutaminianu sodu, mleka, podłoża buforowanego HEPES i dowolnej ich kombinacji. Korzystnie, substancja organiczna jest wybrana z grupy składającej się z żółtka jaja, ekstraktu z żółtka jaja, mleka, ekstraktu z mleka, kazeiny, albuminy, lecytyny i dowolnej ich kombinacji. Korzystnie, źródłem energii jest monosacharyd wybrany z grupy składającej się z glukozy, fruktozy, mannozy i dowolnej ich kombinacji. Korzystnie, antybiotyk jest wybrany z grupy składającej się z tylozyny, gentamycyny, linkomycyny, linkospektyny, spektynomycyny, penicyliny, streptomycyny i dowolnej ich kombinacji. Korzystnie, w sposobie po dodaniu końcowego rozcieńczalnika próbka plemników i zawiesina plemników obejmuje odpowiednio glicerol, cytrynian sodu, Tris[hydroksymetylo]aminometan, żółtko jaja, fruktozę i jeden lub więcej antybiotyków.

4 PL 211 512 B1 Korzystnie, po dodaniu końcowego rozcieńczalnika próbka plemników i zawiesina plemników, każda, obejmuje glicerol, cytrynian sodu, żółtko jaja i jeden lub więcej antybiotyków. Korzystnie, rozcieńczalnik ma ph w zakresie 6,5 do 7,5. Korzystnie, plemniki są izolowane z próbki selekcjonowanych plemników przez wirowanie, które korzystnie umożliwia co najmniej 50% do 90% odzysk plemników. Wynalazek umożliwia kriokonserwację selekcjonowanych według płci plemników, ułatwiającą przechowywanie i/lub ekspedycję próbek selekcjonowanych plemników do miejsc odległych od miejsca zbiórki. Po rozmrożeniu uzyskuje się żywotne plemniki, które można zastosować w procedurach, takich jak sztuczna inseminacja ( Al ) i zapłodnienie in vitro ( IVF ). Wynik ten był nieoczekiwany z uwagi na dobrze udokumentowaną delikatność plemników. Wcześniej badacze wykazali, że stresy towarzyszące różnym sposobom selekcji lub kriokonserwacji powodowały znaczną utratę płodności i/lub żywotności. Twórcy niniejszego wynalazku wykazali po raz pierwszy, że można osiągnąć ciąże stosując selekcjonowane, a następnie zamrożone plemniki. Wynalazek stanowi istotny postęp w hodowaniu żywego inwentarza, gdzie selekcjonowanie nasienia do stosowania w takich procedurach może być zastosowane do zwiększenia produkcji potomstwa mającego pożądane cechy. Na przykład, selekcjonowanie w celu otrzymania plemników zawierających albo chromosom X albo Y, umożliwia kontrolowanie płci potomstwa, co jest korzystne dla hodowców zwierząt, takich jak bydło mleczne lub bydło mięsne. Selekcjonowanie według płci znajduje również zastosowanie w hodowli zwierząt wartościowych (np. koni wystawowych lub wyścigowych) lub zwierząt zagrożonych wymarciem. Mrożenie selekcjonowanych plemników, które umożliwia niniejszy wynalazek, pozwoli na szerokie zastosowanie takich sposobów selekcji w celu np. zwiększania wydajności hodowli żywego inwentarza, jak również jakości. Stosowane tu określenie akrosom lub akrosomalna czapeczka odnosi się do czapeczki, która pokrywa przednią połowę główki plemnika i która zawiera enzymy niezbędne do penetracji komórki jajowej. Określenie według płci odnosi się do rodzaju chromosomu płciowego obecnego w plemniku (tj. chromosomu X lub Y). Określenie kapacytacja odnosi się do specyficznych zmian zachodzących w plemniku, mających na celu rozwinięcie zdolności do zapłodnienia komórki jajowej, takich jak zmiany enzymatyczne na powierzchni akrosomu, które prowadzą do uwalniania enzymów akrosomalnych ułatwiających penetrację plemnika do komórki jajowej. Stosowane w odniesieniu do plemnika określenie krioprotektant odnosi się do cząsteczki, która chroni plemnik podczas cyklu mrożenia-rozmrażania, sprzyjając przeżyciu i zachowaniu zdolności do zapłodnienia. Określenie efekt rozrzedzenia odnosi się do szybkiego spadku ruchliwości i/lub żywotności plemników w warunkach wysokiego rozrzedzenia. Stosowane tu określenie selekcjonowanie odnosi się do sposobu, jakim próbka jest podzielona w oparciu o obecność lub brak specyficznej właściwości. Zatem próbka selekcjonowanych plemników jest próbką otrzymaną przez poddanie próbki źródłowej selekcjonowaniu ze względu na specyficzną właściwość. Próbka selekcjonowanych plemników jest zatem wzbogacona, w stosunku do próbki źródłowej, w plemniki mające specyficzną właściwość. Określenie sortowanie jest tu stosowane do opisania sposobu selekcji przeprowadzanego z zastosowaniem fluorescencyjnie aktywowanego sortera komórek (FACS). Określenie rozcieńczalnik odnosi się do jakiegokolwiek ośrodka, który przyczynia się do konserwowania żywotności plemników. Określenie rozrzedzenie odnosi się do rozrzedzenia plemników rozcieńczalnikiem. Określenie początkowy rozcieńczalnik odnosi się do ośrodka stosowanego do rozrzedzenia plemników przed etapem izolowania w sposobie według wynalazku. Określenie końcowy rozcieńczalnik odnosi się do ośrodka stosowanego do rozrzedzenia plemników przed etapem mrożenia w sposobie według wynalazku. Substancja organiczna w opisanym tu rozcieńczalniku jest jakąkolwiek substancją organiczną, która przyczynia się do zmniejszenia udaru chłodowego i konserwuje płodność plemników. Źródłem energii w opisanym tu rozcieńczalniku jest jakakolwiek substancja organiczna lub substrat, który może być wykorzystywany przez plemnik do utrzymania procesów komórkowych i/lub ruchliwości.

PL 211 512 B1 5 Stosowane tu określenie osmolalność jest miarą ciśnienia osmotycznego cząstek rozpuszczonej substancji w roztworze wodnym (np. rozcieńczalniku). Cząstki rozpuszczonej substancji obejmują zarówno jony, jak i cząsteczki niezjonizowane. Osmolalność jest wyrażona jako stężenie osmotycznie aktywnych cząstek (tj. osmoli) rozpuszczonych w 1 kg wody. Otrzymywanie próbki selekcjonowanych plemników Zgodnie ze sposobem według wynalazku mogą być selekcjonowane i mrożone plemniki jakiegokolwiek gatunku. Sposób można przeprowadzić z plemnikami zwierząt domowych, szczególnie żywego inwentarza, jak również z plemnikami dzikich zwierząt (np. gatunków zagrożonych). Korzystnie, próbka selekcjonowanych plemników zawiera plemniki ssaków. Szczególnie korzystne są plemniki bydlęce, końskie, świńskie, owcze, łosia i bizona. Ejakulat, z którego otrzymuje się plemniki ma zwykle co najmniej około 50%, a korzystnie co najmniej około 75% plemników o prawidłowej morfologii. W tych wykonaniach na ogół co najmniej około 40%, a korzystnie co najmniej około 60% plemników w ejakulacie wykazuje ruchliwość postępową. Cytometria przepływowa, którą stosuje się do selekcjonowania plemników w sposobie według wynalazku, jest korzystnym sposobem oddzielania komórek z mieszanych populacji w oparciu o barwienie różnicowe barwnikami fluorescencyjnymi lub wiązanie ze znakowanymi fluorescencyjnie cząsteczkami, takimi jak przeciwciała lub kwasy nukleinowe. We fluorescencyjnie aktywowanym sortowaniu komórek ( FACS ) komórki są sortowane do różnych populacji w oparciu o fluorescencyjną intensywność po napromienieniu. FACS można stosować do selekcjonowania plemników według płci, ponieważ chromosom X zawiera nieznacznie więcej DNA niż chromosom Y. Gdy plemniki są barwione fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym DNA, plemnik niosący chromosom X absorbuje więcej barwnika niż plemnik niosący chromosom Y, a zatem te dwie populacje mogą być rozdzielane za pomocą FACS. Strategię tę omówiono w opisie patentowym US nr 4 362 246 i znacznie rozwinięto w opisie patentowym US nr 5 135 759 (wydanym Johnsonowi). Rozdzielanie wspomagano przez stosowanie cytometrów przepływowych o wysokiej szybkości przepływu, takich jak cytometr przepływowy MoFlo, produkowany przez Cytomation, Inc. (Ft Collins, CO) i opisany w opisach patentowych US nr nr 5 150 313, 5 602 039, 5 602 349 i 5 643 796, jak również w publikacji PCT nr WO 96/12171. Sposób selekcjonowania stosowany do otrzymywania próbki selekcjonowanych plemników jest korzystnie sposobem, w którym zachowana jest żywotność plemników. Z powodu nietrwałości plemników zwykłe metody cytometrii przepływowych powinny być na ogół modyfikowane, gdy są stosowane do sortowania plemników. Bardziej konkretnie, cytometria przepływowa wymaga barwienia, rozcieńczania i poddawania komórek działaniu światła. Wszystkie te etapy stanowią stresy, które mogą zmniejszać żywotność plemników. Wrażliwość plemników na te stresy może różnić się między gatunkami, a nawet między osobnikami jednego gatunku. Takie wrażliwości albo są udokumentowane, albo można je z łatwością określić przez badania empiryczne, takie jak te opisane w przykładach 1-5. Modyfikacje, które zwiększają żywotność, opisano w publikacjach patentowych omawianych powyżej. Na przykład, procedury dostarczające lepszą osłonę i układy kolektora dla sortowanych plemników ujawniono w publikacji PCT nr WO 99/33956 (zgłoszenie nr PCT/US98/27909). Dalej, w przykładach 1-7 poniżej opisano przykładowe procedury barwienia i sortowania plemników. W przykładzie 3 opisano badanie wpływu natężenia lasera i stężenia barwnika na ruchliwość sortowanych, mrożonych plemników po rozmrożeniu. Badanie to wskazuje, że stosowanie niższych natężeń lasera podczas sortowania może zwiększać ruchliwość po rozmrożeniu. Próbka selekcjonowanych plemników może zawierać oprócz plemników różne składniki i będzie często zawierać składniki dodane w celu ochrony plemników podczas procesu selekcjonowania. W przypadku FACS próbka selekcjonowanych plemników może zawierać składnik(i) roztworów stosowanych do barwienia i sortowania (np. płyn osłaniający i bufor wychwytujący). Ponadto, próbka selekcjonowanych plemników zawiera zwykle rozcieńczalnik lub frakcję rozcieńczalnika. Na przykład dobrze znane są dwuetapowe rozcieńczalniki, obejmujące frakcję A nie zawierającą glicerolu i frakcję B zawierającą glicerol. Jako pierwszą dodaje się do plemników frakcję A, następnie dodaje się równą objętość frakcji B. Na tym etapie frakcję B często rozdziela się na co najmniej dwie równe objętości i dodaje kolejno, np. drugą objętość frakcji B dodaje się 15 minut po pierwszej. Jeżeli składniki rozcieńczalnika są nieobecne, rozcieńczalnik lub frakcję rozcieńczalnika dodaje się zwykle do próbki selekcjonowanych plemników przed wyizolowaniem plemników z próbki. Jeśli tylko pewne składniki rozcieńczalnika są obecne, mogą być dodane ewentualnie dodatkowe składniki tak, że próbka selekcjonowanych plemników obejmuje kompletny rozcieńczalnik lub frakcję rozcień-

6 PL 211 512 B1 czalnika przed etapem izolowania. W przykładowych wykonaniach, plemniki bydlęce są sortowane przepływowo tak, żeby wytworzyć próbkę selekcjonowanych plemników obejmującej frakcję A rozcieńczalnika (patrz przykłady 2, 3 i 4). W razie potrzeby można następnie do próbki selekcjonowanych plemników dodać frakcję B przed etapem izolowania (patrz przykład 5). Rozcieńczalnik (lub frakcja rozcieńczalnika) sprzed etapu izolowania jest określany jako rozcieńczalnik początkowy w celu odróżnienia od rozcieńczalnika końcowego stosowanego do rozrzedzania izolowanych plemników przed zamrożeniem. Jeśli próbka selekcjonowanych plemników była selekcjonowana metodą FACS, początkowy rozcieńczalnik można dopasować do płynu osłaniającego stosowanego do sortowania. Przykładowe dopasowane płyny osłaniające i rozcieńczalniki opisano szczegółowo w przykładzie 4. Rozcieńczalnik odpowiedni do zastosowania w próbce selekcjonowanych plemników zawiera fizjologicznie dopuszczalny nośnik. Fizjologicznie dopuszczalny nośnik jest zwykle wodny, a w korzystnych wykonaniach obejmuje dejonizowaną wodę. Odpowiednie rozcieńczalniki zwykle obejmują jeden lub więcej z następujących składników dodatkowych: krioprotektant, składnik utrzymujący osmolalność i buforujący ph, substancję organiczną zapobiegającą udarowi chłodowemu i zabezpieczającą zdolność nasienia do zapłodnienia, źródło energii, które może być łatwo wykorzystane przez plemniki, substancja ułatwiająca kapacytację plemników i jeden lub więcej antybiotyków. Chociaż krioprotektanty przydatne w sposobie według wynalazku nie są ograniczone do tych działających przez konkretny mechanizm, to większość konwencjonalnych czynników krioprotekcyjnych działa, co najmniej częściowo, przez zmniejszanie wewnątrzkomórkowej utraty wody. Konkretnie, z zamrażaniem wiąże się wzrost stężenia rozpuszczonej substancji w ośrodku otaczającym plemniki. Ten wzrost stężenia rozpuszczonej substancji wyciąga wodę z komórek na zewnątrz, co zwiększa wewnątrzkomórkowe stężenie elektrolitów. Przykładowe krioprotektanty obejmują glicerol, dimetylosulfotlenek, glikol etylenowy, glikol propylenowy i tym podobne. Krioprotektant odpowiedni do zastosowania w danym rozcieńczalniku może różnić się zależnie od gatunków, od których pochodzą plemniki. Na przykład, glicerol jest odpowiedni do zastosowania w kriokonserwacji plemników bydlęcych, ale generalnie nie stosuje się go do kriokonserwacji plemników świńskich lub króliczych. Takie preferencje są dobrze znane dla plemników wartościowych komercyjnie i mogą być łatwo określone empirycznie dla innych rodzajów plemników. Rozcieńczalnik użyteczny w sposobie według wynalazku obejmuje ewentualnie jeden lub więcej składników, które pomagają w utrzymaniu osmolalności i zapewniają zdolność buforową. W korzystnych wykonaniach wynalazku osmolalność rozcieńczalnika jest zbliżona do osmolalności płynów fizjologicznych. Korzystniej, osmolalność rozcieńczalnika jest w zakresie około 280 mosm do około 320 mosm. Korzystnie, ph jest również w fizjologicznie dopuszczalnym zakresie, bardziej korzystnie w zakresie około 6,5 do około 7,5. Substancje pomocne w utrzymaniu osmolalności i ph w tych zakresach są dobrze znane w dziedzinie i mogą być dodane do rozcieńczalnika jako ciało stałe lub już w roztworze. W tym celu można zastosować bufor zawierający sól, węglowodan lub ich kombinację. Konkretne przykłady buforów obejmują cytrynian sodu, Tris[hydroksymetylo]aminometan i TES (kwas N-Tris[hydroksymetylo]metylo-2-aminoetanosulfonowy) i glutaminian sodu; mleko; ośrodek buforowany HEPES; i jakakolwiek ich kombinację. Składnik pomocny w utrzymywaniu osmolalności i zapewniający pojemność buforową w konkretnym zastosowaniu może różnić się w zależności od innych składników rozcieńczalnika, a w pewnych przypadkach od gatunku, od którego pochodzą plemniki. Jednak wybór takiego składnika do zastosowania w sposobie według wynalazku leży w zakresie umiejętności specjalisty w dziedzinie. W rozcieńczalniku może być również zawarta jedna lub więcej substancji organicznych, chroniących przed udarem chłodowym i pozwalających zachować zdolność nasienia do zapłodnienia. Takie substancje są dobrze znane i czasami opisywane jako nie penetrujące krioprotektanty. Specjalista w dziedzinie może bez trudu określić substancję organiczną odpowiednią dla konkretnego zastosowania opisanego tu sposobu kriokonserwacji. Na przykład, w rozcieńczalniku mogą być zawarte substancje organiczne, obejmujące składniki ochronne, (np. lipoproteiny, fosfolipidy, lecytynę), które, jak uważa się, zmniejszają wpływ udaru chłodowego i efekt rozrzedzenia. Odpowiednie substancje organiczne obejmują dicukry, tricukry i jakąkolwiek ich kombinację. Substancje organiczne, przykładowo, obejmują żółtko jaja, wyciąg z żółtka jaja, mleko, wyciąg z mleka, kazeinę, albuminę, lecytynę, cholesterol i jakąkolwiek ich kombinację. Rozcieńczalnik może również zawierać detergent. Doniesiono o synergistycznym działaniu alkilowych detergentów jonowych, takich jak dodecylosiarczan sodu (SDS) z żółtkiem jaja w zwiększaniu

PL 211 512 B1 7 ochrony przed udarem chłodowym. W rozcieńczalniku mogą być zastosowane również inne detergenty przydatne w kriokonserwacji komórek, a wybór konkretnego detergentu dla konkretnego zastosowania w świetle dostarczonych tu informacji jest w zakresie umiejętności specjalisty w dziedzinie, patrz np. przykład 5. Korzystnie, rozcieńczalnik zawiera źródło energii, które jest łatwe do wykorzystania przez plemniki. Przy braku źródła energii plemniki mogą utleniać wewnątrzkomórkowe fosfolipidy i inne składniki komórkowe. Zatem obecność źródła energii w rozcieńczalniku chroni wewnątrzkomórkowe rezerwy i komórkowe składniki. Jak dobrze wiadomo w dziedzinie, cukry, szczególnie monosacharydy, dostarczają dogodnego źródła energii, chociaż w rozcieńczalniku może być zastosowane jakiekolwiek konwencjonalne źródło energii. Przykładowe monosacharydy użyteczne w rozcieńczalniku obejmują glukozę, fruktozę i/lub mannozę. W rozcieńczalniku może być ewentualnie zawarty jeden lub więcej przeciwutleniaczy w celu dostarczenia dodatkowej ochrony przed udarem chłodowym. Przykładowe przeciwutleniacze obejmują butylowany hydroksytoluen (BHT), jego pochodne i tym podobne. Jednak w rozcieńczalniku mogą być zastosowane inne przeciwutleniacze przydatne w kriokonserwacji komórek, a wybór konkretnego przeciwutleniacza dla konkretnego zastosowania jest w zakresie umiejętności specjalisty w dziedzinie w świetle dostarczonych tu informacji. Rozcieńczalnik może zawierać również substancję ułatwiającą kapacytację plemników. Różne czynniki ułatwiające kapacytację są znane w dziedzinie i mogą być wykorzystywane w rozcieńczalniku. Przykłady obejmują enzymy, takie jak alfa-amylaza, beta-amylaza, beta-glukuronidaza, które w razie potrzeby mogą być zastosowane w kombinacji. Wreszcie, rozcieńczalnik korzystnie zawiera antybiotyk, ponieważ znaczny wzrost bakteryjny może zagrażać żywotności plemników i zwiększać ryzyko infekcji gospodarza podczas sztucznej inseminacji lub procedur zapłodnienia in vitro. W rozcieńczalniku również mogą być wykorzystywane różne antybiotyki przydatne w kriokonserwacji komórek. Wybór odpowiedniego antybiotyku zależy od gatunków, z których otrzymano plemniki, od procedur związanych z otrzymywaniem i manipulacją próbką plemników i od konkretnego mikroorganizmu (mikroorganizmów). Przykładowe antybiotyki obejmują tylozynę, gentamycynę, linkomycynę, spektynomycynę, linkospektynę (kombinacja linkomycyny i spektynomycyny), penicylinę, streptomycynę i tikarcylinę, które można stosować same lub w kombinacji. Jednak specjalista w dziedzinie może łatwo określić inne antybiotyki odpowiednie do zastosowania w rozcieńczalniku. Przykładowe rozcieńczalniki omówiono bardziej szczegółowo poniżej i w przykładach. Stężenie plemników jest zwykle niższe w selekcjonowanej próbce plemników niż w próbce źródłowej i jak wskazywano powyżej, gdy stosuje się FACS, rozrzedzenie jest znaczące. Przez zwykłe sortowanie według płci można wytworzyć próbkę zawierającą plemniki w ilości 6 x 10 5 komórek/ml buforu wychwytującego. Ponieważ tak niskie stężenie nie jest optymalne dla przechowywania (przynajmniej dla większości badanych gatunków), w sposobie kriokonserwacji według wynalazku na ogół zagęszcza się próbkę selekcjonowanych plemników. Chłodzenie próbki selekcjonowanych plemników Trzeci etap sposobu kriokonserwacji wymaga chłodzenia próbki selekcjonowanych plemników, zwykle przez zmniejszanie temperatury z kontrolowaną szybkością. Zbyt szybkie chłodzenie może wywołać udar chłodowy, który może być przyczyną utraty integralności błony komórkowej i funkcji komórki. Intensywność działań wywołanych udarem chłodowym różni się u różnych gatunków i zależy od czynników, takich jak szybkość chłodzenia i zakres temperatury. W warunkach odpowiedniego kontrolowanego chłodzenia, plemniki są zdolne do adaptacji do czynników termicznych. W przykładzie 2 między innymi opisano warunki chłodzenia plemników bydlęcych, a określenie odpowiednich warunków chłodzenia plemników innych gatunków jest w zakresie umiejętności specjalistów w dziedzinie. W korzystnym wykonaniu wynalazku próbka selekcjonowanych plemników jest schładzana do temperatury od 22 C do 5 C i ochładzanie jest prowadzone przez okres 60 minut do 24 godzin, korzystnie przez okres około 90 minut do 240 minut i korzystniej przez okres około 90 minut do około 120 minut. Chłodzenie można przeprowadzić jakimkolwiek dogodnym sposobem, obejmującym zwykłe umieszczenie próbki selekcjonowanych plemników w otoczeniu o temperaturze 5 C. Izolacja komórek plemników z próbki selekcjonowanych plemników Po początkowym rozcieńczeniu próbki selekcjonowanych plemników, plemniki izolowano z próbki stosując dowolny wystarczająco delikatny sposób izolacji, dostarczający przynajmniej około 50% odzysku plemników, korzystniej około 75% do około 90% odzysku plemników i najkorzystniej

8 PL 211 512 B1 około 80% do około 90% odzysku plemników. Podczas etapu izolacji schłodzone plemniki powinno być generalnie przetrzymywane w chłodzie, tj. między około 1 a około 8 C i korzystnie blisko 4 lub 5 C. Do izolowania plemników może być stosowany dowolny z różnorodnych sposobów, odpowiedni do odzyskiwania komórek z zawiesiny, w tym, na przykład, filtracja, sedymentacja i wirowanie. W przykładowym korzystnym wykonaniu próbkę selekcjonowanych plemników rozdziela się do 50 ml probówek w równych objętościach nie przekraczających około 27 ml, a korzystnie około 20-27 ml. Wirowanie prowadzi się w około 4 C przy około 850 x g przez 20 minut. Korzystnie, etap wirowania daje przynajmniej około 50% do około 90% odzysku plemników, korzystniej około 60% do około 90% odzysku plemników i najkorzystniej około 70% do około 90% odzysku plemników. Po izolacji supernatant usuwa się, a osad zawiesza się delikatnie worteksując lub powtarzając aspirację przy 4 C. Wtedy zwykle określa się stężenie plemników (np. z zastosowaniem hemacytometru). Końcowe rozcieńczanie izolowanych komórek plemników Po izolacji plemniki zbiera się i, o ile to konieczne, rozrzedza się końcowym rozcieńczalnikiem do odpowiedniego dla zamrażania stężenia. Korzystnie, stężenie plemników po końcowym rozrzedzeniu a przed zamrożeniem jest w zakresie od około 1 x 10 6 /ml do około 300 x 10 6 /ml, korzystniej od około 10 x 10 6 /ml do około 50 x 10 6 /ml i najkorzystniej od około 10 x 10 6 /ml do około 20 x 10 6 /ml. Zamieszczony powyżej opis początkowego rozcieńczalnika stosuje się również do końcowego rozcieńczalnika, który może być taki sam lub różny od początkowego rozcieńczalnika. W konkretnych wykonaniach skład próbki plemników rozrzedzonych końcowym rozcieńczalnikiem jest zasadniczo podobny (jeśli nie taki sam) do składu próbki plemników po dodaniu początkowego rozcieńczalnika. W korzystnym wykonaniu wynalazku stosuje się jako rozcieńczalnik żółtko jaja-tris. Po dodaniu rozcieńczalnika zawiesina plemników obejmuje glicerol (krioprotektant); kwas cytrynowy i Tris[hydroksylmetylo]aminometan (bufor); żółtko jaja (substancja organiczna); fruktozę (źródło energii); tylozynę, gentamycynę i linkospektynę (antybiotyki). Typowe przybliżone stężenia tych składników po dodaniu końcowego rozcieńczalnika do izolowanych plemników wynoszą; Składniki rozcieńczalnika żółtko jaja-tris Glicerol: 4-8% obj./obj. Kwas cytrynowy: 55-75 mm Tris[hydroksymetylo]aminometan: 190-210 mm Żółtko jaja: 5-25% obj./obj. Fruktoza: 45-65 mm Tylozyna: 25-100 μg/ml Gentamycyna: 200-300 μg/ml Linkospektyna: 100-400 μg/ml* *100-400 μg/ml linkomycyny i 100-400 μg/ml spektynomycyny W odmianie tego wykonania szczególnie odpowiedniego dla zamrażania plemników bydlęcych, stężenia tych składników po dodaniu końcowego rozcieńczalnika do izolowanych plemników wynoszą około 6% (obj./obj.)glicerolu, około 65 mm kwasu cytrynowego, około 200 mm Tris[hydroksymetylo]- aminometanu, około 20% (obj./obj.) żółtka jaja, około 56 mm fruktozy, około 50 μg/ml tylozyny, około 250 μg/ml gentamycyny i około 150/300 μg/ml linkospektyny (tj. 150 μg/ml linkomycyny i 300 μg/ml spektynomycyny) w dejonizowanej wodzie. W alternatywnym wykonaniu zastosowano rozcieńczalnik żółtko jaja-cytrynian. Po dodaniu rozcieńczalnika zawiesina plemników obejmowała glicerol (krioprotektant), cytrynian sodu (bufor), żółtko jaja (substancja organiczna), tylozynę, gentamycynę i linkospektynę (antybiotyki). Typowe przybliżone stężenia tych składników po dodaniu końcowego rozcieńczalnika do izolowanych plemników wynoszą: Składniki rozcieńczalnika żółtko jaja-cytrynian Glicerol: 4-8% obj./obj. Cytrynian sodu: 60-80 mm Żółtko jaja: 5-25% obj./obj. Tylozyna: 25-100 μg/ml Gentamycyna: 200-3 00 μg/ml Linkospektyna: 100-400 μg/ml* *100-400 μg/ml linkomycyny i 100-400 μg/ml spektynomycyny

PL 211 512 B1 9 Przykładowo, korzystne stężenia dla zamrażania plemników bydlęcych wynoszą około 7% (obj./obj.)glicerolu, około 72 mm cytrynianu sodu, około 20% (obj./obj.) żółtka jaja, około 50 μg/ml tylozyny, około 250 μg/ml gentamycyny i około 250/300 μg/ml linkospektyny. W innym, alternatywnym wykonaniu zastosowano rozcieńczalnik żółtko jaja-tes-tris ( EY TEST ). Po dodaniu rozcieńczalnika zawiesina plemników obejmowała glicerol (krioprotektant), żółtko jaja i grzane mleko, np. mleko homogenizowane zawierające 1,25% fruktozy z 10% glicerolu (substancje organiczne); tylozynę, gentamycynę i linkospektynę (antybiotyki). Typowe przybliżone stężenia tych składników po dodaniu końcowego rozcieńczalnika do izolowanych plemników wynoszą: Składniki rozcieńczalnika żółtko jaja-tes-tris Glicerol: 3-7% obj./obj. Kwas Tris[hydroksymetylometylo]-2-aminoetanosulfonowy: 140-170 mm Tris [hydroksymetylo]aminometan: 60-80 mm Żółtko jaja: 5-25% obj./obj. Fruktoza: 5-12 mm Tylozyna: 50-150 μg/ml Gentamycyna: 400-600 μg/ml Linkospektyna: 200-700 μg/μl* *200-700 μg/ml linkomycyny i 200-700 μg/ml spektynomycyny Przykładowo, korzystne stężenia dla zamrażania plemników bydlęcych wynoszą około 5% (obj./obj.)glicerolu, około 158 mm kwasu Tris[hydroksymetylometylo]-2-aminoetanosulfonowego, około 72 mm Tris[hydroksymetylo]aminometanu, około 20% (obj./obj.) żółtka jaja, około 8 mm fruktozy, około 100 μg/ml tylozyny, około 500 μg/ml gentamycyny i około 300/600 μg/ml linkospektyny. W jeszcze innym alternatywnym wykonaniu wynalazku zastosowano jako rozcieńczalnik mleko. Po dodaniu rozcieńczalnika zawiesina plemników obejmowała glicerol (krioprotektant), ogrzane homogenizowane mleko (substancja organiczna), fruktozę (źródło energii), tylozynę, gentamycynę i linkospektynę (antybiotyki). Typowe przybliżone stężenia tych składników po dodaniu końcowego rozcieńczalnika do izolowanych plemników wynoszą: Składniki rozcieńczalnika mlecznego Mleko homogenizowane 90% (obj./obj.) Glicerol: 3-7% (obj./obj.) Fruktoza: 1,25% (wag./obj.) Tyrozyna: 50 μg/ml Gentamycyna: 250 μg/ml Linkospektyna: 250-300 μg/ml* *250-300 g/ml linkomycyny i 250-300 μg/ml spektynomycyny Przykładowo, korzystne stężenia dla zamrażania plemników bydlęcych wynoszą około 90% mleka, około 10% (obj./obj.) glicerolu, około 1,25% (wag./obj.) fruktozy, około 50 μg/ml tylozyny, około 250 μg/ml gentamycyny i około 250/300 μg/ml linkospektyny. Inne standardowo stosowane do zamrażania nasienia rozcieńczalniki mogą być również stosowane jako rozcieńczalnik końcowy w zamrożonych selekcjonowanych plemnikach. Opisano różne rozcieńczalniki optymalizowane do zastosowania w zamrażaniu plemników od różnych gatunków i wiele z nich jest dostępnych na rynku. Rozcieńczalniki do zamrażania końskich plemników zawierają typowo mleko, żółtko jaja, różne cukry, elektrolity i krioprotektant. Przykładowe rozcieńczalniki do zamrażania opisali E. L. Squires i współ., Cooled and Frozen Stallion Semen Animal Reprod. and Biotechnology Laboratory, Bulletin nr 69, Rozdział 8, Seminal Extenders str. 49-51 (lipiec 1999). Równoważenie i zamrażanie plemników Przez rozrzedzenie próbki plemników uzyskuje się zawiesinę plemników, którą następnie przenosi się do pojemników do zamrażania. Jeżeli plemniki są przeznaczone do stosowania w zapłodnieniu, komórki są dogodnie rozdzielane na indywidualne dawki wystarczające do osiągnięcia zapłodnienia. Wymagane dawki mogą różnić się zasadniczo zależnie od gatunku i są albo dobrze znane (np. dla bydła i koni), albo mogą być łatwo określone. W przypadku selekcjonowanych według płci plemników bydlęcych dogodne dawki są w zakresie od około 1,0 x 10 6 plemników do około 3,0 x 10 6 plemników. Do zamrażania można wykorzystać jakikolwiek odpowiedni pojemnik, na przykład ampułkę, fiolkę i słomkę. Plemniki przeznaczone do Al (sztucznej inseminacji) są zwykle mrożone w słomkach (np. słomkach 0,25 ml lub 0,50 ml) przeznaczonych do stosowania w pistolecie do inseminacji. Korzystnie, bolus rozcieńczalnika jest wciągany do słomki, a po nim kolejno powietrze, plemniki, powietrze i roz-

10 PL 211 512 B1 cieńczalnik, tak więc plemniki są z obu stron otoczone przez przestrzeń powietrzną, która oddziela je od bolusa rozcieńczalnika przy każdym końcu słomki. Przed zamrożeniem plemniki zwykle są równoważone w 5 C. Korzystnie plemniki są równoważone przez okres od około 1 godziny do około 18 godzin, korzystniej między około 3 godzin a około 18 godzin, a najkorzystniej między około 3 godzin a około 6 godzin (patrz przykład 2). Po zrównoważeniu może być zastosowany jakikolwiek standardowy sposób zamrażania o niezbyt dużej szybkości mrożenia (tj. nie przekraczającej około 0,5 C/minutę). Korzystnie prędkość mrożenia wynosi około 0,5 C/minutę. W przykładowym korzystnym wykonaniu plemniki umieszcza się w statycznych oparach ciekłego azotu, a zamrażanie przeprowadza się w trzech różnych stadiach przez okres około 10 minut. W pierwszym stadium zamrażania plemniki chłodzi się do temperatury od około 5 C do około -15 C z prędkością od około 40 C/minutę do około 65 C/minutę. W drugim stadium zamrażania plemniki chłodzi się do temperatury od około -15 C do około -60 C z prędkością od około 25 C/minutę do około 35 C/minutę. W trzecim stadium plemniki zanurza się w ciekłym azocie w około -100 C. Próbki selekcjonowanych plemników Próbka zamrożonych plemników obejmuje plemniki selekcjonowane z próbki źródłowej według płci. Plemniki mogą pochodzić od dowolnego gatunku, w tym jakiegokolwiek z tych omówionych powyżej w odniesieniu do sposobu zamrażania. Korzystne wykonania obejmują zamrożone selekcjonowane według płci plemniki bydlęce, końskie, świńskie, owcze, łosia lub bizona. Selekcję według płci przeprowadzono z zastosowaniem cytometrii przepływowej, jak opisano ogólnie powyżej. Pojemnik zawierający próbkę zamrożonych plemników może być wytworzony z jakiegokolwiek materiału, który nie wchodzi w reakcję z próbką zamrożonych plemników i może mieć dowolny kształt lub inną cechę, która ułatwi wykorzystanie próbki w planowanym zastosowaniu. Dla próbek przeznaczonych do zastosowania w Al, na przykład dogodnie pojemnikiem jest słomka (np. słomka 0,25 ml lub 0,5 ml) przeznaczona do stosowania w pistolecie inseminacyjnym. Pojemnik uszczelnia się w dowolny sposób odpowiedni dla konserwacji próbki w planowanej temperaturze przechowywania, która zwykle wynosi poniżej -80 C Celsjusza. Słomki 0,25 ml mogą być uszczelnione, na przykład, proszkiem PCV, ultradźwiękowo lub bawełniano-poliwinylowym korkiem i/lub kulką stali nierdzewnej (BB). Sposoby stosowania próbki selekcjonowanych plemników Zamrożona próbka selekcjonowanych plemników jest odpowiednia do zastosowania w dowolnym sposobie wykorzystującym plemniki. Próbkę można rozmrozić i zastosować w dowolnym konwencjonalnym sposobie zapłodnienia, takim jak sztuczna inseminacja lub zapłodnienie in vitro. Rozmrażanie przeprowadza się w ten sam sposób jak dla zamrożonych nie selekcjonowanych plemników. Krótko mówiąc, słomkę zawierającą zamrożone plemniki zanurza się w kąpieli wodnej utrzymując temperaturę około 35 C do około 37 C przez okres około 20 do około 30 sekund. Po rozmrożeniu złożenie plemników (np. inseminację) przeprowadza się zgodnie ze standardowymi procedurami, biorąc pod uwagę ochronę plemników przed fluktuacjami otoczenia. Przykłady P r z y k ł a d 1. Wpływy rozrzedzenia na plemniki Cel: określenie wpływu stężenia plemników na ruchliwość plemników dla nie zamrożonych, nie sortowanych, ale bardzo rozrzedzonych plemników. A. Wpływy rozrzedzenia na nie przemywane plemniki 1. Pobieranie próbki źródłowej. Nasienie pobrano od byków zgodnie z rutynowym schematem pobierania stosując sztuczną pochwę jak opisano w J. Schenk, Proc. 17 NAAB, str. 48-58 (1998) i Saacke RG, Proc. NAAB Tech. Conf. Al Reprod. 41: 22-27 (1972). Wszystkie stosowane ejakulaty zawierały ponad 50% plemników wykazujących ruch postępowy i ponad 75% plemników o prawidłowej morfologii. Do oczyszczonego surowego ejakulatu dodano antybiotyki jak opisał S. Shin, Proc. NAAB Tech. Conf. Al Reprod. 11: 33-38 (1986) w 15 minut od pobrania, a stężenie plemników określono stosując spektrofotometr. 2. Metody. Nasienie od 4 byków rozrzedzono do 1,25, 2,5, 5, 10, 15 i 20 x 10 6 /ml stosując rozcieńczalnik żółtko jaja-cytrynian (EYC) wytworzony z 20% (obj./obj.) żółtka jaja w 72 mm cytrynianu sodu, 50 Tg/ml tylozyny, 250 Tg/ml gentamycyny i 250/300 Tg/ml linkospektyny. Każdą próbkę wytworzono podwójnie (2 probówki/rozrzedzenie/byk) i całkowita objętość na probówkę wynosiła 8 ml. Wszystkie próbki inkubowano przez 60 minut w 22 C, następnie wirowano stosując wirówkę typu

PL 211 512 B1 11 swinging bucket (Eppendorf, Model # 5810R) przy 600 x g przez 10 minut zatężenia celu zagęszczenia nasienia. Po wirowaniu z jednego zestawu podwójnych probówek nie usunięto supernatantu; nasienie ponownie zawieszono w tym samym ośrodku i w wyjściowym stężeniu, przez powtarzaną delikatną aspirację z zastosowaniem 5-ml pipety serologicznej (drugi zestaw podwójnych probówek zastosowano w przykładzie 1B). Próbki nasienia ochładzano następnie do 5 C przy 0,2 C/min przez 90 minut. To nasienie określono jako przemywane niepłukane nasienie. Wszystkie próbki inkubowano przy 5 C przez 24 lub 48 godzin po pobraniu. 3. Ocena ruchliwości. Po inkubacji próbki ogrzano do 37 C stosując inkubator typu dry block przez 10 minut przed określeniem ruchliwości. Do tego eksperymentu dla każdej próbki określono doświadczenia pojedyncze, ślepe szacowanie procentu plemników o ruchliwość postępowej. Postępowa ruchliwość plemników była określona subiektywnie dla każdej podklasy przez pojedynczego obserwatora (x 200, mikroskop fazowo-kontrastowy); inna osoba przygotowywała szkiełka przedmiotowe mikroskopu w sposób zrandomizowany, tak więc obserwator był nieświadomy sposobów traktowania. 4. Analiza statystyczna. Dane analizowano analizą wariancji (SAS Institute, Cary, North Carolina) z czynnikami takimi jak dawca byk i stężenie po początkowym rozrzedzeniu. Wykonano oddzielne analizy dla każdego czasu inkubacji. Trendy rozrzedzenia badano stosując (log) kontrastów linearnych. 5. Wyniki. Dane dla nie przemywanych plemników (tabela 1) ujawniły (log) liniową zależność (P < 0,01) dla obu czasów inkubacji. Procent ruchliwych plemników wzrastał wraz ze wzrostem stężenia plemników od 1,25 x 10 6 /ml do 10 x 10 6 /ml, ale później występowała mała różnica. Składowa sześcienna była znacząca (P < 0,05) dla 24-godzinnych i marginalnie znacząca (P < 0,1) dla 48-godzinnych inkubacji. W obu przypadkach występował efekt byka (P < 0,01). T a b e l a 1 Wpływ chłodzenia na ruchliwość nie przemywanych plemników (%) po ochłodzeniu do 5 C Rozrzedzenie (10 6 /ml) Inkubacja w 5 C 24 h a 48 h b 1,25 18 c 0 c 2,5 38 c,d 6 c,d 5,0 56 d 31 d,e 10,0 61 d 42 e 15,0 55 d 44 e 20,0 58 d 41 e S.E. f 5,6 6,4 a (log) efekty liniowe (P < 0,01) i sześcienne (P < 0,05). b (log) efekty liniowe (P < 0,01) i sześcienne (P < 0,1). c,d,e Średnie w kolumnach bez wspólnych wykładników różnią się (P < 0,05). f (SAS Institute, Cary, NC, USA). Wpływy rozrzedzenia na przemywane plemniki 1. Pobranie próbki źródłowej. W doświadczeniu tym zastosowano drugi zestaw podwójnych probówek zawierających próbki, przygotowany w przykładzie 1A. 2. Metody. Nasienie rozrzedzano, inkubowano i zagęszczano przez wirowanie jak w przykładzie 1A. Po odwirowaniu z każdej probówki zaaspirowano 7,1 ml supernatantu, usuwając większość plazmy nasienia i pozostawiając plemniki w 900 μl osadu. Plemniki rozrzedzono w EYC (patrz przykład 1A) wytwarzając zawiesiny plemników 10 x 10 6 /ml lub 20 x 10 6 /ml. Następnie, próbki ochładzano do 5 C przez 90 minut jak w przykładzie 1A. 3. Ocena ruchliwości. Próbki ogrzewano i oceniano ruchliwość postępową jak w przykładzie 1A. 4. Analiza statystyczna. Dane analizowano jak w przykładzie 1A. Ponadto dane w przykładzie 1B analizowano dla stężenia podczas inkubacji w 5 C. 5. Wyniki. Dane dla przemywanych plemników (tabela 2) nie ujawniły znacznych wpływów traktowania, gdy plemniki oceniano po 24 godzinach. Jednak po 48 godzinnym przechowywaniu w 5 C

12 PL 211 512 B1 wystąpiły efekty byka, rozrzedzenia początkowego, stężenia podczas inkubacji i byka przez inkubację (P < 0,05). Więcej plemników zachowało ruchliwość, gdy utrzymywano je w 20 x 10 6 /ml niż przy 10 x 10 6 /ml (31% vs. 20%; P < 0,05). Początkowe rozrzedzenia 1,25, 2,5 i 5 x 10 6 plemników/ml dały ruchliwość postępową niższą niż 10 x 10 6 plemników/ml (P < 0,05), ze średnimi odpowiedniego efektu głównego 19, 20, 27 i 37% ruchliwych plemników. Stężenie plemników podczas 1 h wstępnej inkubacji w 37 C (%) T a b e l a 2 Skumulowane wpływy przemywania, rozrzedzania, zagęszczania i ochładzania na ruchliwość postępową plemników Przechowywanie w 5 C - stężenie plemników i czas trwania 24 h 48 h a 20 x 10 6 /ml 10 x 10 6 /ml 20 x 10 6 /ml 10 x 10 6 /ml b 1,25 45 49 24 15 2,5 51 40 29 11 5,0 54 54 32 21 10,0 51 50 40 34 15,0 60 41 20,0 55 40 a Stężenie 20 x 10 6 plemników/ml przewyższało (P < 0,05) 10 x 10 6 plemników/ml po 48 h przechowywania. Również wstępne rozrzedzenie 10 x 10 6 przewyższało niższe rozrzedzenia (P < 0,05). Połączone błędy standardowe, b Istotny trend (log) liniowy (P < 0,06). wynosił 4,0 dla 24 h i 2,8 dla 48 h inkubacji. Wniosek Wysokie rozrzedzenie i ochładzanie nasienia powodowało istotne zmniejszenie procentu ruchliwych plemników, bez względu na obecność czy usunięcie plazmy nasienia. Jednak ten efekt rozrzedzenia był bardzo osłabiony przy rozcieńczonego zagęszczaniu rozrzedzonego nasienia do 10 x 10 6 /ml, a jeszcze bardziej do 20 x 10 6 /ml przed przechowywaniem w 5 C. Nasienie od pewnych dawców lepiej tolerowało rozrzedzenie niż nasienie od innych byków; jednak stwierdzone różnice są typowe. Silnie rozrzedzone nasienie może być przyczyną uszkodzenia plemników podczas sortowania, częściowo przez usunięcie ochronnych związków z plazmy nasienia. P r z y k ł a d 2. Wpływy czasu równoważenia przed zamrożeniem sortowanych plemników Cel: ocena wpływu czasów równoważenia (3, 6 i 18 h, 5 C) przed zamrożeniem przepływowo sortowanych plemników. Powtórzono w całości następujące doświadczenie z użyciem tych samych dawców - byków: 1. Pobranie próbki źródłowej. Nasienie od 4 byków pobrano i przygotowano jak opisano w przykładzie 1A. 2. Metody. a) Barwienie i przygotowanie do sortowania i) Przygotowanie roztworu podstawowego barwnika: roztwór podstawowy 8,89 mm Hoechst 33342 (bis-benzimid H-33342; #190305, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) przygotowano w dejonizowanej wodzie. ii) Procedura barwienia plemników: plemniki rozrzedzono w modyfikowanym buforze TALP (tabela 3) do 400 x 10 6 plemników/ml. Po rozrzedzeniu do zawiesin plemników dodano barwnik Hoechst 33342 w stężeniu 224 μm. Po dodaniu barwnika do zawiesin plemników próbki inkubowano przez 60 minut w 34 C. Po inkubacji plemniki rozrzedzono do 100 x 10 6 /ml dodając TALP zawierający 2,67% oczyszczonego żółtka jaja i 0,002% barwnika do żywności (FD & C #40), który wygasza fluorescencję Hoechst 33342 w plemnikach z uszkodzonymi błonami komórkowymi, pozwalając na odrzucenie ich w procesie sortowania. Tuż przed sortowaniem przepływowym próbki filtrowano przy ciężarze jednostkowym przez filtr nylonowy o wielkości oczka 40 μm, w celu usunięcia resztek i/lub zlepionych plemników.

PL 211 512 B1 13 b) Sortowanie. Do wzbudzania barwnika Hoechst zastosowano dwuliniowy laser argonowy działający przy 351 i 364 nm i 150 mw. Zastosowano cytometr przepływowy/sorter komórkowy SX MoFlo (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, USA) działający przy 344,74 Pa (50 psi). Zastosowano płyn osłonowy oparty na Tris, zawierający Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris; 197,0 mm; #T-1503, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), monohydrat kwasu cytrynowego (55,4 mm; #C-7129, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) i fruktozę (47,5 mm; #F-0127, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Do płynu osłonowego opartego na Tris dodano również antybiotyki pierwszego rzutu obejmujące 0,58 g/l penicyliny i 0,05 g/l siarczanu streptomycyny. Plemniki sortowano w procesie określanym jako sortowanie masowe, który pozwala na szybkie gromadzenie dużej liczby plemników, tak więc w rozsądnym czasie można wykonać przykłady na dużą skalę. Plemniki przechodziły przez cytometr przepływowy w standardowych warunkach roboczych z wyjątkiem tego, że wszystkie krople zawierające żywe plemniki zbierano do pojedynczej probówki, a nie sortowano do dwóch probówek w oparciu o płeć. Plemniki sortowano na podstawie ich żywotności; stąd plemniki o uszkodzonych błonach komórkowych były wykluczane podczas masowego sortowania. Podczas sortowania barwione plemniki utrzymywano w 22 ± 1 C. Masowo sortowane plemniki zbierano do 50 ml plastikowych probówek zawierających 2 ml 20% rozcieńczalnika żółtko jaja-tris, przygotowanego z 20% żółtka jaja (obj./obj.) w 200 ml Tris, 65 mm kwasu cytrynowego, 56 mm fruktozy, 50 Tg/ml tylozyny, 250 Tg/ml gentamycyny i 150/300 Tg/ml linkospektyny w dejonizowanej wodzie. Rozcieńczalnik żółtko jaja-tris określono jako Tris-frakcja A w celu podkreślenia braku glicerolu w tym punkcie procedury. Plemniki zebrano do probówek tak, by zawierały 12 ml i w przybliżeniu około 6 x 10 6 plemników. Plemniki były później inkubowane w 22 C przez 1 do 3 godzin w celu symulacji warunków sortowania według płci. c) Przygotowanie do zamrożenia. Po inkubacji sortowane plemniki ochładzano do 5 C przez okres 70 minut. Po ochłodzeniu zawartości dwóch probówek spulowano i chłodzono, wirówkę typu swinging bucket nastawiono na 5 C i przez 20 minut wirowano przy 850 x g. Po usunięciu supernatantu proces kontynuowano w 5 C dodając około 150 μl rozcieńczalnika Tris-frakcja A do około 150 μl osadu plemników w celu otrzymania stężenia plemników w przybliżeniu 40 x 10 6 /ml. Plemniki od indywidualnych byków spulowano i bezzwłocznie rozrzedzono w równej objętości rozcieńczalnika żółtko jaja-tris zawierającego 12% (obj./obj.) glicerolu ( Tris-frakcja B ). Tris-frakcję B dodano do zawiesiny plemników w 2 równych objętościach w 15 minutowych odstępach w celu dostosowania końcowego stężenia plemników do 20 x 10 6 /ml. Końcowe stężenie glicerolu w kompletnym rozcieńczalniku żółtko jaja-tris, wynosiło 6% (obj./obj.). d) Równoważenie i mrożenie. Następnie, rozrzedzone plemniki umieszczono w 0,25 ml słomkach z polichlorku winylu do mrożenia rutynowymi procedurami na stojakach w statycznych oparach ciekłego azotu. Dwie słomki od każdego z 4 byków zamrożono po 3, 6 i 18 godzinach całkowitego czasu równoważenia w 5 C. 3. Ocena ruchliwości po rozmrożeniu. Słomki rozmrażano w 37 C łaźni wodnej przez 30 sekund. Ślepe szacowanie ruchliwości postępowej wykonano po inkubacji próbek w 37 C dla 0, 1 i 2 godzin po rozmrożeniu. Każdy z dwóch obserwatorów szacował postępową ruchliwość plemników z każdej z dwóch słomek. Te cztery ślepe oznaczenia ilościowe dla każdej jednostki doświadczalnej reprezentują podpróby. 4. Analiza statystyczna. Podpróby analizowano statystycznie jako subplot głównego płotu metodą najmniejszych kwadratów ANOVA w celu zbadania wpływów dowolnej obserwacji i interakcji obserwacja x traktowanie. N odnosi się do liczby jednostek doświadczalnych, a nie podprób; błędy standardowe obliczono na podstawie średnich z 4 podprób z błędów średniokwadratowych ANOVA i liczb jednostek doświadczalnych; przedstawiono średnie najmniejszych kwadratów. Wpływy traktowania oceniono przez oddzielne ANOVA dla każdego czasu inkubacji. Model obejmował dawców-byki jako efekt losowy, a czas równoważenia i obserwację jako efekty ustalone; subplot składał się z określonych obserwacji i związanych z nimi interakcji. 5. Wyniki. Czasy równoważenia 3 i 6 godzin przeważały nad 18 godzinami (tabela 4) w oparciu o procent postępowo poruszających się plemników dla 0 i 1 godziny (P < 0,01), ale nie dla 2 godzin inkubacji po rozmrożeniu. Efekty dawców były oczywiste przy czasach inkubacji 1 i 2 godziny (P < 0,05),

14 PL 211 512 B1 ale nie przy 0 godzin. Nie było znaczącego wpływu (P > 0,1) przez interakcję w czasie równoważenia, jak również nie było znacznego wpływu obserwacji na jakąkolwiek odpowiedź. T a b e l a 3 Zmodyfikowany bufor TALP NaCl KCl NaHPO 4 NaHCO 3 MgCl 2 6 H 2 O Pirogronian sodu Glukoza Mleczan sodu HEPES a Składnik Bydlęca albumina osoczowa b Siarczan gentamycyny a #H3375, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA b #US70195, frakcja V; Amersham/Life Science, Cleveland, OH, USA Stężenie 95,0 mm 3,0 mm 0,3 mm 10,0 mm 0,4 mm 2,0 mm 5,0 mm 25,0 mm 40,0 mm 3,0 mg/ml 30,0 μg/ml Równoważenie przy 5 C T a b e l a 4 Wpływ czasu równoważenia przed zamrożeniem na postępową ruchliwość po rozmrożeniu (%) Inkubacja w 37 C po rozmrożeniu 0 h 1 h 2 h 3 h 41 a 36 a,b 16 6 h 41 a 37 a 18 18 h 35 b 31 b 12 S. E. c 1,5 0,8 2,0 a,b w kolumnach średnie bez wspólnego wykładnika różnią się (P < 0,05), Tukey's HSD. c połączone błędy standardowe, 6. Wniosek Wyniki wskazały na brak różnic w ruchliwości plemników po rozmrożeniu w całkowitym czasie równoważenia 3-6 godzin w 5 C, ale występował znaczny spadek ruchliwości plemników po 18 godzinach równoważenia w 5 C przed zamrożeniem. Zakres 3-6 godzin pozwala na połączenie 2 kolejnych 3-godzinnych serii sortowania dla zamrożonych plemników bez zmniejszenia ruchliwości po rozmrożeniu. Ponieważ interakcja byk i czas równoważenia nie była znacząca, czas równoważenia 3 do 6 godzin był właściwy, z zastrzeżeniem, że wykorzystano tylko 4 byki. Optymalny czas równoważenia dla mniejszej ilości byków przypuszczalnie wynosi > 6 godzin. P r z y k ł a d 3. Wpływy stężenia barwnika i mocy lasera na sortowane plemniki Cel: ocena wpływu stężenia barwnika Hoechst 33342 w kombinacji z intensywnością lasera na sortowane przepływowo plemniki. 1. Pobranie próbki źródłowej. Nasienie pobrano od 6 byków i przygotowano jak w przykładzie 1A. 2. Metody a) Projekt doświadczalny. Zastosowano jeden ejakulat (2 byki) i 2 ejakulaty z różnych dni (4 byki) w projekcie 2 przez 2 plus kontrola.

PL 211 512 B1 15 b) Barwienie i sortowanie. Barwienie, przygotowanie do sortowania i sortowanie plemników wykonano jak opisano w przykładzie 2 z wyjątkiem tego, że barwnik Hoechst 33342 dodano do zawiesin plemników w stężeniu końcowym 149 TM lub 224 TM; a plemniki sortowano masowo laserem działającym przy 100 mw lub 150 mw doprowadzonej mocy. Sortowane masowo plemniki zebrano do 50 ml plastikowych probówek, jak opisane w przykładzie 2. Dla każdego byka przez 1 godzinę zebrano cztery probówki zawierające w przybliżeniu 15 x 10 6 całkowitego nasienia/probówkę. Sortowane plemniki inkubowano przez 1 godzinę w 22 C symulując dłuższy czas sortowania. c) Przygotowanie do zamrożenia. Po inkubacji plemniki ochłodzono jak w przykładzie 2. Następnie, plemniki zagęszczono przez wirowanie w 5 C przy 850 x g przez 20 minut. Po usunięciu supernatantu do każdych 150 μl osadu plemników dodano 150 μl rozcieńczalnika Tris-frakcja A. Wszystkie osady plemników zawieszono przez delikatną powtarzaną aspirację i spulowano plemniki od indywidualnych byków. Rozcieńczalnik Tris-frakcja B dodawano stopniowo jak w przykładzie 2. Dla każdego byka przygotowano nie barwioną i nie sortowaną kontrolę przy 20 x 10 6 plemników/ml w rozcieńczalniku Tris zawierającym 6% glicerol i ochłodzono do 5 C, podczas gdy sortowane masowo było plemniki były przygotowywane. d) Równoważenie i zamrażanie. Kontrolę i sortowane plemniki umieszczono w 0,25 ml słomkach z polichlorku winylu, jak opisano w przykładzie 2, równoważono w 5 C przez 3 godziny, a następnie zamrożono konwencjonalnie. 4. Analiza statystyczna. Ogólny opis analizy statystycznej dostarczono w przykładzie 2. Szczególnie wpływy traktowania oszacowano przez ANOVA. Model obejmował stężenie barwnika, intensywność lasera i byki w głównym plocie, oraz obserwatora i związane interakcje w subplocie. Byki uznano za efekt losowy, a inne czynniki jako ustalone. 5. Wyniki. Wpływy byków na procent plemników o postępowej ruchliwości bezpośrednio po rozmrożeniu (P < 0,1) oraz po 1 i 2 godzinach inkubacji w 37 C (P < 0,05) były znaczne. Nie stwierdzono wpływu stężenia barwnika lub byka x stężenie barwnika na ruchliwość plemników przy dowolnym czasie inkubacji. Przy uznaniu wpływu dawców - byków za efekt losowy 150 mm moc lasera powodowała niższą ruchliwość plemników po rozmrożeniu niż 100 mw przy 0 godzinach inkubacji (P < 0,1), ale nie przy innych czasach inkubacji (tabela 5). Jeżeli byki uznano za efekty ustalone, 150 mw moc powodowała niższą ruchliwość plemników niż 100 mw (P < 0,05) przy wszystkich 3 czasach inkubacji. Stwierdzono wpływ byka i mocy lasera (P < 0,05) na ruchliwość plemników przy 1 godzinie, ale nie przy 0 lub 2 godzinach inkubacji. Również najwyższa moc lasera powodowała niższą ruchliwość plemników niż kontrola (P < 0,05) przy 0 i 1 godzinie inkubacji (tabela 5). Stwierdzono znaczny efekt obserwacji przy 1 godzinie, ale nie przy 0 lub 2 godzinach inkubacji. Nie stwierdzono interakcji obserwacja i traktowanie (P > 0,1). T a b e l a 5 Wpływy intensywności lasera i stężenia barwnika na ruchliwość (%) po rozmrożeniu Średnie efektu głównego Inkubacja w 37 C 0 h 1 h 2 h Kontrola 49 44 33 Stężenie barwnika 149 μm 41 39 30 224 μm 42 39 30 Intensywność lasera 100 mw 46 42 33 150 mw 38 a 35 b 27 S. E. c 2,2 1,2 1,3 a Istotny efekt główny (P < 0,1) różni się od kontroli (P < 0,05). b Różni się od kontroli (P < 0,05). c Połączone błędy standardowe,

16 PL 211 512 B1 6. Wnioski. Procent plemników o postępowej ruchliwości zmniejszał się wskutek procesu barwienia i sortowania. Wyższa intensywność lasera była bardziej szkodliwa niż niższa intensywność lasera. Nie stwierdzono wpływu stężenia barwnika na ruchliwość plemników po rozmrożeniu. Zatem pobudzenie barwnika Hoechst 33342 związanego z plemnikiem przy niższych intensywnościach lasera jest mniej szkodliwe i barwienie plemników przy najwyższym stężeniu barwnika nie miało szkodliwego wpływu na ruchliwość po rozmrożeniu. Obserwowane uszkodzenie przypuszczalnie dotyczyło aparatu ruchowego plemników. P r z y k ł a d 4. Ocena poprzedzających sortowanie procedur barwienia i wybór rozcieńczalników do kriokonserwacji plemników Cel: (1) ocena trzech poprzedzających sortowanie zabiegów na plemnikach; i (2) ocena kombinacji płynu osłonowego i rozcieńczalnika dla kriokonserwacji sortowanych przepływowo plemników. Powtórzono w całości następujące doświadczenie: 1. Pobranie próbki źródłowej. Pobrano nasienie od 4 byków i przygotowano jak w przykładzie 1A. 2. Metody a) Projekt doświadczalny. Zaprojektowano 3 (traktowania poprzedzające sortowanie) przez 3 (rozcieńczalniki) przez 2 (płyny osłonowe) przez 4 (dawcy-byki) przez 2 (obserwacje) silniowy eksperyment w celu określenia najlepszej procedury przetrzymywania plemników przed sortowaniem i oceny trzech rozcieńczalników do kriokonserwacji sortowanych plemników. b) Przygotowanie i barwienie próbki. Świeżo zebrane nasienie od każdego z 4 byków potraktowano następująco: (1) rozrzedzono do 400 x 10 6 /ml w zmodyfikowanym TALP (patrz przykład 2, tabela 3) i barwiono przez 1 godzinę w 34 C przed masowym sortowaniem ( rozrzedzenie - 0 h); (2) inkubowano bez domieszki w 22 C przez 3 godziny przed rozrzedzeniem, barwieniem i sortowaniem ( czysty - 3 h ); lub (3) rozrzedzono i barwiono jako rozrzedzenie 0 h, a następnie inkubowano w 22 C przez 3 godziny przed masowym sortowaniem ( rozrzedzone - 3 h ). c) Rozcieńczalniki. Porównano następujące rozcieńczalniki do zamrażania: EYC (patrz przykład 1) zawierający 7% glicerolu, żółtko jaja-tris (patrz przykład 2) zawierający 6% glicerolu i żółtko jaja-tes- -Tris (TEST) zawierający 5% glicerolu. EYC Frakcja A dotyczy rozcieńczalnika EYC nie zawierającego glicerolu, a EYC Frakcja B dotyczy rozcieńczalnika EYC zawierającego dwa razy końcowe żądane stężenie glicerolu (tj. 14%). Zatem, gdy frakcje EYC A i B połączono w równych objętościach, końcowy rozcieńczalnik EYC zawierał 7% glicerolu. Frakcje Tris A i B nazwano podobnie i opisano w przykładzie 2. Rozcieńczalnik TEST przygotowano jako kompletny rozcieńczalnik zawierający 5% glicerolu; stąd nie było frakcji A i B dla TEST. d) Płyn osłonowy. Jak opisano w przykładzie 2 płynem osłonowym był albo 98,6 mm dihydrat cytrynianu sodu (#279-3, Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ), albo Tris. Oba rodzaje płynu osłonowego doprowadzono do ph 6,8; osmolalność wynosiła około 270 do 280 mosm/kg. Płyn osłonowy Tris stosowano przy zbieraniu nasienia, które później rozrzedzano w rozcieńczalnikach do zamrażania żółtko jaja-tris i TEST. Płyn osłonowy, zawierający 98,6 mm dihydratu cytrynianu sodu, zastosowano do zbierania nasienia rozrzedzanego później rozcieńczalnikiem do mrożenia EYC. e) Sortowanie. W przybliżeniu 58 x 10 6 plemników dla każdej kombinacji zabiegu poprzedzającego sortowanie, płyn osłonowy i rozcieńczalnik były masowo sortowane jak opisano w przykładzie 2, przy 150 mw mocy padającej lasera. Dla każdego sortowania plemniki zbierano przez około 1 godzinę. Po sortowaniu próbki inkubowano w 22 C przez 2 godziny symulując 3 godziny sortowania. f) Przygotowanie do zamrażania. Po inkubacji plemniki ochładzano jak w przykładzie 2. Po schłodzeniu próbki wirowano w 5 C przy 850 x g przez 20 minut. Każda próbka obejmowała około 28 ml całkowitej objętości i była zawarta w 50 ml probówce z tworzywa sztucznego. Po usunięciu supernatantu plemniki z powrotem umieszczono w zimnym pomieszczeniu o temperaturze 5 C w celu rozrzedzenia. Próbki rozrzedzono do 40 x 10 6 /ml przez złożenie 131 μl zawiesiny plemników w 69 μl frakcji A EYC, frakcji A żółtko jaja-tris lub rozcieńczalniku TEST. Zawiesiny natychmiast doprowadzono do 20 x 10 6 plemników/ml przez dodanie dobranego rozcieńczalnika zawierającego glicerol (tj. frakcję B EYC, frakcję B Tris) lub TEST. Rozcieńczalniki frakcji B dodawano do odpowiednich próbek stopniowo (2X) w 15 minutowych odstępach jak opisano w przykładzie 2. TEST dodano do plemników stopniowo w ten sam sposób jak rozcieńczalniki frakcje B EYC i Tris.

PL 211 512 B1 17 g) Równoważenie i zamrażanie. Plemniki umieszczono w 0,25 ml rurkach probówkach z polichlorkiem winylu, równoważono przez 3 godziny w 5 C i natychmiast zamrażano w statycznych parach ciekłego azotu. 3. Ocena ruchliwości po rozmrożeniu. Rozmrażanie i ocenianie plemników po rozmrożeniu wykonano jak w przykładzie 2. 4. Analiza statystyczna. Ogólny opis analizy statystycznej dostarczono w przykładzie 2. Konkretnie, wpływy traktowań oceniono przez oddzielną analizę wariancji dla każdego czasu inkubacji po rozmrożeniu. Główny plot obejmował traktowanie przed sortowaniem, rozcieńczalniki i byki; subplot składał o się z obserwacji i towarzyszących interakcji. Byki przyjęto za efekt losowy, a inne czynniki za ustalone. Całe doświadczenie powtórzono dwa razy. Do separacji średnich zastosowano test Tukey'a HDS. 5. Wyniki. Na postępową ruchliwość po rozmrożeniu masowo sortowanych plemników wpływano (P < 0,05) przez rozcieńczalnik i dawców-byki przy każdym czasie inkubacji po rozmrożeniu i przez procedurę poprzedzającą sortowanie przy 0 h inkubacji (tabela 6). Nie stwierdzono różnic spowodowanych płynami osłonowymi (P > 0,05). Przy 0 h inkubacji po rozmrożeniu stosowanie 3-godzinnego zabiegu bez domieszki powodowało większy ruch plemników po zamrożeniu i rozmrożeniu niż inne 2 zabiegi barwienia poprzedzające sortowanie (P < 0,05; tabela 6). Jednak procedury poprzedzające sortowanie nie były statystycznie istotne po inkubacji plemników po rozmrożeniu dla 1 lub 2 godziny z bykami przyjętymi za efekt losowy. Ważne jest, że przy tych 2 czasach inkubacji nie było znaczących interakcji zabieg poprzedzający sortowanie x byk (P < 0,05). Ponadto, zabieg poprzedzający sortowanie mógł być istotnym efektem przy wszystkich czasach inkubacji po rozmrożeniu, jeżeli byki byłyby uważane za efekt ustalony. Natychmiast po rozmrożeniu (0 h), TEST był najlepszym rozcieńczalnikiem, ale po 1 lub 2 godzinach inkubacji w 37 C, najlepszym rozcieńczalnikiem był Tris. Ważne jest, że nie było interakcji zabieg poprzedzający sortowanie x rozcieńczalnik dla jakiejkolwiek odpowiedzi. Stwierdzono efekty obserwacji (P < 0,01) przy wszystkich czasach inkubacji, ale nie stwierdzono interakcji obserwacje x traktowanie. Stwierdzono interakcję byk x rozcieńczalnik (P < 0,05) przy wszystkich 3 czasach inkubacji. T a b e l a 6 Główne wpływy zabiegu poprzedzającego sortowanie i rozcieńczalników do mrożenia na postępową ruchliwość plemników po rozmrożeniu (%) Procedura poprzedzająca sortowanie Inkubacja przy 37 C Rozcieńczalnik 0 h 1 h 2 h Rozrzedzenie - 0 h Średnia 39 a 32 22 Bez domieszki - 3 h Średnia 43 b 36 25 Rozrzedzenie - 3 h Średnia 38 a 31 19 Średnia EYC 36 a 29 a 17 a Średnia Tris 40 b 39 b 29 b Średnia TEST 44 c 33 c 20 a S.E. 0,8 0,8 0,7 a,b,c średnie w kolumnach, z efektami głównymi, bez wspólnych wykładników różnią się (P < 0,05). d Połączone błędy standardowe, 6. Wniosek. Badanie wykazało, że przetrzymywanie nasienia bez domieszki przez 3 godziny przed rozrzedzeniem, barwieniem i sortowaniem było lepsze, niż bezpośrednie rozrzedzenie i barwienie 0 h lub 3 godziny później. Zatem, sortowanie najlepiej jest prowadzić z nową próbką oryginalnego ejakulatu, który przetrzymywano bez domieszki przez 3 godziny i następnie barwiono, a nie z oryginalną próbką nasienia barwioną i przetrzymywaną przy 400 x 10 6 plemników/ml. Gdyby nawet rozcieńczalnik TEST dostarczał wyższej ruchliwości po rozmrożeniu w 0 h, Tris był lepszym rozcieńczalnikiem, gdy plemniki były poddawane stresowi przez inkubację w 37 C. Każdy płyn osłonowy działał równie dobrze dla każdego rozcieńczalnika. W oparciu o te wyniki do standardowej procedury operacyjnej włączono stosowanie płynu osłonowego Tris w połączeniu z rozcieńczalnikiem do zamrażania Tris.

18 PL 211 512 B1 P r z y k ł a d 5. Wpływy dodatków rozcieńczalnika na sortowane plemniki Cel: Ocena wpływu dodania dodecylosiarczanu sodu ( SDS ) do rozcieńczalnika do zamrażania na sortowane przepływowo plemniki. A. Ocena wpływu stężenia SDS w rozcieńczalniku do mrożenia 1. Pobranie próbki źródłowej. Pobrano nasienie od 6 byków i przygotowano jak opisano w przykładzie 1A. 2. Metody. Nasienie od każdego z 6 byków rozrzedzono do 20 x 10 6 /ml w rozcieńczalniku 20% całe jajko-tris ( WET ), zawierającym 0, 0,03, 0,06, 0,09 lub 0,12 procent SDS, umieszczono w słomkach i zamrożono. Rozcieńczalnik WET przygotowano stosując 3,028 g Tris[hydroksymetylo]aminometanu, 1,78 g monohydratu kwasu cytrynowego i 1,25 g fruktozy na 100 ml podwójnie destylowanej wody, do której dodano 20% całe jajko (obj./obj.). Wytworzono rozcieńczalnik WET o ph około 7,0 i końcowym stężeniu glicerolu około 6% (obj./obj.). Rozcieńczalnik WET zawierał również 1000 lu penicyliny G sodowej i 100 Tg siarczanu streptomycyny/ml. 3. Wyniki. Odpowiednie średnie (n = 1 próbka od każdego z 6 byków) wynosiły 51, 51, 50, 51 i 48% plemników o postępowej ruchliwości w przybliżeniu 10 minut po rozmrożeniu. Opierając się na tych wynikach w przykładzie 5B zastosowano 0,06 % SDS. B. Ocena wpływów 0,06 % SDS w różnych rozcieńczalnikach do zamrażania na ruchliwość po rozmrożeniu przepływowo sortowanych plemników 1. Pobranie próbki źródłowej. Pobrano nasienie od 6 byków i przygotowano jak w przykładzie 1A. 2. Metody. Badano ruchliwość po rozmrożeniu plemników zamrożonych w rozcieńczalnikach żółtko jaja-tris i WET (patrz przykład 5A) z i bez 0,06% SDS. Końcowa zawartość glicerolu w obu rozcieńczalnikach wynosiła 6%. a) Barwienie, przygotowanie do sortowania, sortowanie. Barwione próbki plemników przygotowano z ejakulatu od każdego z 8 byków, jak opisano w przykładzie 2. Barwione plemniki sortowano masowo z zastosowaniem płynu osłonowego jak w przykładzie 2, z wyjątkiem tego, że sortowanie wykonano stosując 135 mw moc padającą lasera. Sortowane plemniki zebrano do 50 ml probówek ze sztucznego tworzywa, zawierających 2 ml frakcji A buforu do zamrażania dla każdego rozcieńczalnika; 15 x 10 6 całkowitych sortowanych plemników (25 ml) dla każdego traktowania zebrano i inkubowano przez 1 godzinę w 22 C w celu symulowania dłuższego sortowania. b) Przygotowanie do mrożenia. Rozrzedzone plemniki ochłodzono do 5 C przez 90 minut. Równą objętość odpowiedniego rozcieńczalnika frakcji B dodano stopniowo (2 x) w 15 minutowych odstępach do każdej 50 ml probówki z tworzywa sztucznego zawierającej sortowane plemniki. Próbki 25 ml traktowane rozcieńczalnikiem zagęszczano przez wirowanie przez 20 minut przy 850 x g w wirówce chłodniczej. Supernatant usunięto pozostawiając 600 Tl osadu plemników, który zawieszono przez delikatne wirowanie przez 15 sekund. Nie dodano dodatkowego rozcieńczalnika do osadu plemników, ponieważ zawiesina zawierająca osad zawierała już glicerol. Stężenie zawiesiny plemników wynosiło w przybliżeniu 20 x 10 6 /ml. Dla każdego byka przygotowano nie barwioną i nie sortowaną kontrolę o 20 x 10 6 plemników/ml w rozcieńczalniku żółtko jaja-tris, zawierającym 6% glicerol. Kontrolę umieszczono w pomieszczeniu chłodniczym w 5 C, podczas gdy przeprowadzano masowe sortowanie. c) Równoważenie i zamrażanie. Wszystkie kontrole i sortowane masowo plemniki zapakowano i zamrożono w tym samym czasie. Plemniki umieszczono w 0,25 ml rurkach probówkach z polichlorku winylu, równoważono przez około 3-6 godzin w 5 C i następnie zamrożono w statycznych oparach ciekłego azotu. 3. Ocena ruchliwości po rozmrożeniu. Rozmrażanie i oceny plemników po rozmrożeniu wykonano jak w Przykładzie 2 z tym wyjątkiem, że ruchliwość postępową oceniono po 0,5 i 2,0 godzinach inkubacji. 4. Analiza statystyczna. Ogólny opis analiz statystycznych dostarczono w przykładzie 2. Konkretnie, wpływy traktowania oceniono przez osobne analizy wariancji dla każdego czasu inkubacji; model obejmował byka i rozcieńczalnik w plocie głównym i obserwację i związane interakcje w subplocie. Różnice w średnich określono przez test najmniej istotnych różnic. 5. Wyniki. Rozcieńczalnik oddziaływał (P < 0,05) na postępową ruchliwość plemników po 0,5 lub 2 godzinach inkubacji (tabela 7). Przy 0,5 godziny WET plus SDS powodowały niższą ruchliwość niż Tris z SDS. Przy 2 godzinach wszystkie zabiegi z masowo sortowanymi plemnikami były gorsze niż z niesortowanymi plemnikami kontrolnymi. Występowały istotne efekty byka i obserwacji (P < 0,01) przy obu czasach inkubacji, ale nie było interakcji obserwacja x traktowanie.

PL 211 512 B1 19 T a b e l a 7 Wpływ rozcieńczalnika na postępową ruchliwość po rozmrożeniu (%) Rozcieńczalnik Inkubacja w 37 C 0,5 h 2 h Tris (nie sortowany) 42 a 41 a Tris bez SDS 40 a,b 35 b Tris z SDS 42 a 37 b WET bez SDS 40 a,b 35 b WET z SDS 38 b 35 b S. E. c 1,0 1,2 a,b średnie w kolumnach bez wspólnego wykładnika różnią się (P < 0,05). c 6. Wniosek. Włączenie SDS w rozcieńczalnikach Tris lub WET nie poprawiło jakości plemników, jak określono przez wizualną ocenę ruchliwości po rozmrożeniu. Podobne były również wyniki z zastosowaniem rozcieńczalników WET i Tris; stąd WET okazał się tak samo skuteczny jak Tris do kriokonserwacji sortowanych plemników. P r z y k ł a d 6. Jakość plemników sortowanych przepływowo według płci dla prób terenowych Cel: ocena jakości sortowanych plemników po rozmrożeniu oparta na integralności akrosomalnej. 1. Pobranie próbki źródłowej. Nasienie od 3 byków zebrano i przygotowano jak opisano w przykładzie 1A. 2. Sposoby. Sortowane i nie sortowane plemniki kontrolne z tego samego ejakulatu barwiono, przetwarzano i sortowano jak w Przykładzie 2 z tym wyjątkiem, że plemniki sortowano według płci przy 90% poziomie czystości. Sortowane plemniki zebrano do objętości w przybliżeniu 20 ml i ochłodzono do 5 C przez 90 minut (0,2 C/min.). Po ochłodzeniu do sortowanych plemników w 15 minutowych odstępach dodano równą objętość rozcieńczalnika żółtko jaja-tris B (patrz przykład 2) w dwóch równych objętościach. Wirowania i aspirowania supernatantu dokonano jak w przykładzie 5. Po wirowaniu i aspirowaniu do osadu plemników dodano rozcieńczalnik żółtko jaja-tris zawierający 6% glicerolu (obj./obj.), doprowadzając stężenie plemników do około 20 x 10 6 /ml. Zamrażanie i rozmrażanie przeprowadzono jak opisano w przykładzie 2, z tym wyjątkiem, że czas równoważenia wynosił 3 godziny. 3. Ocena ruchliwości po rozmrożeniu. Wizualną ocenę odsetka plemników z postępową ruchliwością w 37 C wykonano w przybliżeniu 10 minut po rozmrożeniu. Integralność akrosomalna plemników oceniono stosując różnicową mikroskopię interferencyjno-kontrastową (x 1000) po 2 godzinach inkubacji w 37 C. Plemniki poddano działaniu 40 mm fluorku sodu, sporządzono mokry wymaz i zbadano 100 plemników na traktowanie. Akrosomy sklasyfikowano jako: (a) akrosomy nienaruszone, (b) akrosomy obrzmiałe lub uszkodzone lub (c) akrosomy nieprawidłowe (nie nienaruszone). 4. Analiza statystyczna. Analizowane dane pochodziły z 19 różnych dat mrożenia od 3 byków stosowanych w próbach terenowych. Wpływy traktowań (sortowane vs. kontrola) oceniono przez analizę wariancji z bykami jako efektem ustalonym. 5. Wyniki. Odsetek plemników o postępowej ruchliwości po rozmrożeniu był znacznie wyższy (P < 0,05) dla nie sortowanych plemników (50%) niż dla sortowanych (46%; tabela 8), pomimo usunięcia martwych plemników podczas sortowania. Jednak odsetek plemników z nienaruszonym akrosomem nie różnił się. Sortowanie zwiększało odsetek plemników o brakującym akrosomie, ale również zmniejszało odsetek plemników z uszkodzonym akrosomem, w stosunku do kontrolnych plemników (P < 0,05). Wśród byków występowały istotne różnice w odsetku nienaruszonych akrosomów (P < 0,05), odsetku nie nienaruszonych akrosomów (P < 0,01) i postępowej ruchliwości po rozmrożeniu (P < 0,01). Występował efekt byk x sortowanie dla ruchliwości po rozmrożeniu (p < 0,01), ale nie dla innych odpowiedzi. Od byków A i B różnice w ruchliwości po rozmrożeniu między sortowanymi i nie sortowanymi plemnikami były bliskie zeru; dla byka C plemniki sortowane miały ruchliwość o 10 punktów procentowych (19%) niższą niż plemniki kontrolne.

20 PL 211 512 B1 T a b e l a 8 Wpływ sortowania na ruchliwość po rozmrożeniu (%) i stan akrosomu (%) Stan akrosomu Nienaruszony Uszkodzony Nienaruszony Ruchliwość po rozmrożeniu Kontrola 64 a 20 a 15 a 50 a Sortowane 65 a 14 b 21 b 46 b Kolumnowe średnie z różnymi wykładnikami różnią się (P < 0,05). 6. Wniosek. Wizualne oceny postępowej ruchliwości dla sortowanych, mrożonych plemników średnio były nieznacznie niższe (4 punkty procentowe; 8%) niż dla plemników kontrolnych, chociaż dla jednego byka różnica ta była większa. Ocen tych dokonano w przybliżeniu 10 minut po rozmrożeniu. Mała średnia różnica jest zgodna z różnicą dla nie-nienaruszonych akrosomów po 2 godzinach inkubacji. Plemniki z uszkodzonym lub nieprawidłowym akrosomem są prawdopodobnie nieruchliwe. Wzrost odsetka plemników z nienaruszonym akrosomem dla sortowanych próbek, wskazuje na uszkodzenie związane z sortowaniem lub z kriokonserwacją przed lub po aktualnym sortowaniu. Przypuszczalnie sortowanie przekształca uszkodzone akrosomy w akrosomy nieprawidłowe. W oparciu o standardowe procedury oceny jakości nasienia nie istnieją podstawy do przypuszczenia, że dla większości byków potencjał zapładniający tych przepływowo sortowanych plemników mógłby być poważnie zagrożony. P r z y k ł a d 7. Selekcja według płci i kriokonserwacja plemników byka z użyciem rozcieńczalnika 20% żółtko jaja-tris Cel: Dostarczenie protokołu kriokonserwacji przepływowo sortowanych plemników. 1. Pobranie i oszacowanie ejakulatu. Ejakulaty pobrano i przygotowano jak opisano w przykładzie 1A. Wybrano ejakulaty od byków z plemnikami o prawidłowej morfologii > 75%. Oszacowano wizualnie odsetek plemników o postępowej ruchliwości (najlepsze do sortowania są ejakulaty z ruchliwością postępową > 60%). Do surowego nasienia dodano następujące antybiotyki: tylozynę w końcowym stężeniu 100 μg/ml, gentamycynę w końcowym stężeniu 500 μg/ml i linkospektynę w końcowym stężeniu 300/600 μg/ml. 2. Barwienie i przygotowanie do sortowania. Po dodaniu antybiotyków do próbki surowego nasienia odczekano 15-20 minut przed barwieniem. Barwienie próbek opisano w przykładzie 2. 3. Sortowanie. Sortowano plemniki zarówno z chromosomem X jak i Y, przy ustawieniu bramek sortowania na 90% czystości. Plemniki sortowano do 50 ml probówek Falcona zawierających 2 ml frakcji A rozcieńczalnika 20% żółtko jaja-tris (patrz przykład 2), aż każda probówka zawierała maksimum 20 ml objętości (lub maksimum 2 godziny na sortowanie), a końcowe stężenie sortowanych plemników wynosiło 6 x 10/ml. Odnotowano, że dodatkowy bufor wychwytujący-frakcja A-20% żółtko jaja-tris trzeba dodać po sortowaniu i przed chłodzeniem, tak, że końcowy procent żółtka jaja wynosi przynajmniej 3%. 4. Przygotowanie do zamrażania. Po sortowaniu, chłodzono sortowane próbki do 5 C przez okres 90 minut. Po schłodzeniu dodano frakcję B rozcieńczalnika 20% żółtko jaja-tris (patrz przykład 2) stopniowo (2 x) w 15 minutowych odstępach. Końcowa objętość frakcji B rozcieńczalnika Tris dodanego do próbki plemników powinna być równa objętości frakcji A rozcieńczalnika Tris. Całkowita objętość próbki plemników po dodaniu frakcji B rozcieńczalnika Tris nie powinna przekraczać 27 ml całkowitej objętości. Po dodaniu do próbki plemników frakcji B rozcieńczalnika Tris, próbkę zagęszczono przez 20 minutowe wirowanie przy 850 x g. Zaaspirowano supernatant pozostawiając w przybliżeniu 150 μl osadu plemników. Plemniki ponownie zawieszono i spulowano plemniki od każdego indywidualnego byka. 5. Zamrażanie. Dodano kompletny rozcieńczalnik żółtko jaja-tris (6% glicerol) do osiągnięcia końcowego stężenia plemników 20 x 10 6 /ml. Rozrzedzone plemniki do zamrożenia umieszczano w 0,25 ml słomkach z polichlorku winylu, jak opisano w przykładzie 2. P r z y k ł a d 8. Ocena płodności zamrożonych plemników byków przepływowo sortowanych w badaniach terenowych Materiały i metody Zbiórka i obróbka nasienia