RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 210751 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 380606 (22) Data zgłoszenia: 12.09.2006 (51) Int.Cl. C12N 15/12 (2006.01) C12N 15/13 (2006.01) C07K 14/435 (2006.01) C07K 16/18 (2006.01) C12P 21/08 (2006.01) C07H 21/04 (2006.01) A61P 25/00 (2006.01) A61K 38/17 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) A61K 48/00 (2006.01) G01N 33/577 (2006.01) (54) Izolowany fragment białka Nogo-A, jego zastosowanie oraz sposób diagnozowania oraz leczenia stwardnienia rozsianego i polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej (43) Zgłoszenie ogłoszono: 17.03.2008 BUP 06/08 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.02.2012 WUP 02/12 (73) Uprawniony z patentu: JUREWICZ ANNA, Łódź, PL MATYSIAK MARIOLA, Konstantynów Łódzki, PL SELMAJ KRZYSZTOF, Łódź, PL (72) Twórca(y) wynalazku: ANNA JUREWICZ, Łódź, PL MARIOLA MATYSIAK, Konstantynów Łódzki, PL KRZYSZTOF SELMAJ, Łódź, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Witek Rafał WTS WITEK CZERNICKI ŚNIEŻKO Spółka Partnerska PL 210751 B1
2 PL 210 751 B1 Opis wynalazku Dziedzina wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania lub leczenia stwardnienia rozsianego i polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej oraz preparaty stosowane w tych sposobach. Wynalazek znajduje zastosowanie w medycynie. Opis stanu techniki Stwardnienie rozsiane (SM) jest najczęstszą demielinizacyjną chorobą ośrodkowego układu nerwowego. Deficyty neurologiczne stopniowo narastają i choroba nieodwracalnie prowadzi do trwałego inwalidztwa. SM do niedawna było uznawane za chorobę, w której dochodzi do uszkodzenia osłonki mielinowej, jednak ostatnio zwrócono uwagę na uszkodzenie aksonów (wypustek komórek nerwowych odpowiedzialnych za przekazywanie sygnału) przy zachowaniu prawidłowej mieliny (prawidłowo wyglądająca istota biała NAWM). Patologia aksonalna uważana jest za ważny element patologiczny choroby, odpowiedzialny m.in. za powstawanie nieodwracalnych zmian i trwałych zmian neurologicznych co stanowi najważniejszą cechę choroby. Do rozpoznania SM wykorzystuje się kryteria kliniczne (McDonald i wsp., Annals of Neurology, 2002) oraz pomocniczo wyniki wielu testów immunologicznych (w tym również płynu mózgowo- -rdzeniowego) i wyniki badania rezonansu magnetycznego. Jednak wyniki te są niespecyficzne i mają jedynie wartość pomocniczą w diagnozowaniu SM. Istnieje więc potrzeba wykorzystania dokładniejszej metody diagnozy SM. Białka z rodziny Nogo należą do rodziny białek reticulon. Ich pierwsze opisy związane są z opisem białka hamującego regenerację aksonów w ośrodkowych układzie nerwowym, po ich mechanicznym uszkodzeniu. Brak zdolności regeneracyjnej jest charakterystyczny dla ośrodkowego układu nerwowego w przeciwieństwie do obwodowego układu nerwowego, gdzie dochodzi do odbudowania" uszkodzonego aksonu. Jednym z białek odpowiedzialnych za hamowanie regeneracji w ośrodkowym układzie nerwowym jest Nogo-A. Do tej pory opisano trzy formy białka Nogo: A, B i C. Opisano, że Nogo-A występuje przede wszystkim w oligodendrocytach, komórkach glejowych produkujących mielinę oraz w obrębie osłonki mielinowej (która jest uszkadzana w przebiegu SM). Nogo-B występuje powszechnie w organizmie, a Nogo-C przede wszystkim w komórkach mięśniowych. Wszystkie formy Nogo (A,B,C) mają wspólny region tzw. Nogo-66, który hamuje regenerację aksonów poprzez niedawno opisany receptor. Nogo-A, występujące w oligodendrocytach ma charakterystyczny fragment tzw. amino-nogo, który nie występuje w pozostałych formach Nogo i również hamuje regenerację aksonów. W opisie US 2003000437931 przedstawiono sposób diagnozowania próbki biologicznej, np. krwi z białkiem Nogo skłonności zachorowania na choroby psychiczne np. schizofrenie. W omawianym zgłoszeniu test diagnostyczny wykorzystuje polimorfizm białka Nogo-A w jego specyficznym regionie. Białko Nogo-A posiada również zastosowanie w leczeniu chorób autoimmunizacyjnych. W WO2004US0015387 przedstawiono metodę polegającą na podawaniu epitopów Nogo-A w celu wywołania ochronnej odpowiedzi immunologicznej. Mimo wyżej wspomnianych zastosowań nadal istnieje potrzeba testu diagnostycznego na skłonność na zachorowanie na SM oraz jego leczenia. Istota wynalazku Przedmiotem wynalazku jest izolowany fragment białka Nogo-A posiadający masę cząsteczkową 20 kda i posiadający sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję peptydu FSKLAREYTD- LEVSHKSE odpowiadającą aminokwasom od 882 do 899 Nogo A (SEQ ID No.1). Kolejnym przedmiotem wynalazku jest także izolowana cząsteczka polinukleotydu kodującego fragment białka Nogo-A posiadający masę cząsteczkową 20 kda i posiadający sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję peptydu SEQ ID No.1. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest cząsteczka polinukleotydu kodującego polipeptyd SEQ ID No. 1. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania stwardnienia rozsianego lub polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej, charakteryzujący się tym, że w próbce płynu mózgowo- -rdzeniowego pacjenta bada się obecność fragmentu białka Nogo-A posiadającego masę cząsteczkową 20 kda i posiadającego sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję peptydu SEQ ID No.1,
PL 210 751 B1 3 przy czym jego obecność świadczy o występowaniu stwardnienia rozsianego lub polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej. Korzystnie sposób według wynalazku charakteryzuje się tym, że do wykrywania obecności fragmentu białka Nogo-A stosuje się przeciwciało specyficzne wobec tego fragmentu. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania przeciwciała do wykrywania lub leczenia stwardnienia rozsianego lub polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej obejmujący immunizację ssaka specyficznym antygenem oraz izolację przeciwciał specyficznych wobec stosowanego antygenu, charakteryzujący się tym, że do immunizacji stosuje się fragment białka Nogo-A posiadający masę cząsteczkową 20 kda i posiadający sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję peptydu SEQ ID No. 1 albo fragment tego białka zawierający SEQ ID No. 1, korzystnie peptyd składający się z SEQ ID No. 1. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku do stosowania w diagnostyce lub terapii stwardnienia rozsianego lub polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie przeciwciała specyficznego wobec fragmentu białka Nogo-A posiadającego masę cząsteczkową 20 kda i posiadającego sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję peptydu SEQ ID No. 1 albo przeciwciała specyficznego wobec fragmentu tego białka zawierającego SEQ ID No. 1 do wytwarzania preparatu do leczenia lub diagnozowania stwardnienia rozsianego lub polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej. Korzystnie, stosowane przeciwciało jest specyficzne wobec peptydu składającego się z SEQ ID No.1. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie fragmentu białka Nogo-A posiadającego masę cząsteczkową 20 kda i posiadającego sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję peptydu SEQ ID No. 1 albo fragmentu tego białka zawierającego SEQ ID No. 1 do wytwarzania preparatu do leczenia lub diagnozowania stwardnienia rozsianego lub polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej. Korzystnie, stosowany fragment białka jest peptydem składającym się z SEQ ID No. 1. Reasumując należy stwierdzić, że wynalazek dotyczy wykorzystania identyfikacji fragmentu białka Nogo w płynie mózgowo-rdzeniowym w diagnostyce lub leczeniu stwardnienia rozsianego i polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej. Wynalazek opiera się na nieoczekiwanym stwierdzeniu obecności fragmentu białka Nogo A o masie 20 kda wyłącznie w płynach mózgowo-rdzeniowych chorych na stwardnienie rozsiane i chorych na polineuropatie zapalno-demielinizacyjną. W wielu innych grupach chorobowych nie stwierdzono występowania tego białka i jego fragmentów w płynach mózgowo-rdzeniowych. Fragment białka Nogo występuje we wszystkich klinicznych postaciach stwardnienia rozsianego oraz u pacjentów w różnej fazie aktywności choroby dlatego może stanowić dogodny biomarker choroby. Jego występowanie nie zależy od czasu trwania choroby i nasilenia niesprawności. Jest to pierwszy marker diagnostyczny stwardnienia rozsianego i polineuropatii zapalno- -demielinizacyjnej. W znanych metodach rozpoznanie choroby stawiane jest na podstawie objawów klinicznych i wyników badania rezonansem magnetycznym w przypadku stwardnienia rozsianego i badań elektroneurograficznych i elektromiograficznych w przypadku polineuropatii zapalno- -demielinizacyjnej. Natomiast w metodzie według wynalazku bada się obecność fragmentu białka Nogo w płynie mózgowo-rdzeniowym, co stanowi istotę ujawnianego testu diagnostycznego obu tych chorób. Skrócony opis figur W celu uzupełnienia zgłoszenia opis przedmiotowego wynalazku został wzbogacony następującymi figurami: Fig. 1. Przewidywane struktury białek rodziny Nogo. Pełnej długości Nogo-A obejmuje N-końcowy fragment określany jako amin-nogo oraz fragment Nogo-66. (Chen et al. Nature, 2000; 403:434-439). Fig. 2. A) Western blot próbek płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) pacjentów cierpiących na SM (ścieżki 1-3) i pacjentów należących do grup kontrolnych (ścieżki 4-6). Obserwowano wykrywanie fragmentu Nogo A o masie cząsteczkowej około 20 kda za pomocą komercyjnie dostępnego przeciwciała (Santa Cruz, sc 11032) specyficznego wobec N-końca Nogo A w próbkach pochodzących od pacjentów cierpiących na SM i brak tego białka w próbkach pochodzących od pacjentów kontrolnych. B) Nie stwierdzano obecności fragmentu Nogo A w próbkach CSF od pacjentów SM nie zawierających pierwotnych przeciwciał (ścieżka 1) lub zawierających peptyd blokujący Nogo A (ścieżka 2) oraz stwierdzano brak inhibicji sygnału w wyniku wcześniejszej próby absorpcji przeciwciał specyficznych wobec Nogo-A innymi peptydami blokującymi, mianowicie: Notch-1 (ścieżka 3), Notch-3 (ścieżka 4), Jagged-1(ścieżka 5), PLP 139-151 (ścieżka 6), PLP 178-191 (ścieżka 7), MBP 87-99 (ścieżka 8), MOG 35-55 (ścieżka 9) oraz pełnej długości białkiem MBP (ścieżka 10). C) Brak immunoreaktywności próbek CSF od pacjentów SM i kontrolnych z przeciwciałem specyficznym wobec Nogo skierowanymi
4 PL 210 751 B1 do C-końca tego białka. D) Nogo-R w próbkach CSF od pacjentów cierpiących na SM i kontrolnych. Dwa wyższe prążki świadczą o niespecyficznym wiązaniu drugiego przeciwciała obserwowanego we wszystkich próbkach CSF włącznie z kontrolnymi, które nie jest eliminowane poprzez kontaktowanie z pierwszym przeciwciałem albo peptydem blokującym. E) Brak wykrywania MAG, MOG, MBP w próbkach CSF od pacjentów SM. F) Brak wykrywania MAG, MOG i MBP w próbkach CSF od pacjentów kontrolnych. G.) Western blot próbek CSF pacjentów SM (ścieżki 1-3) i kontrolnych (ścieżki 4-6). Obserwowano wykrywanie fragmentu Nogo A o masie cząsteczkowej około 20 kda za pomocą przeciwciała (Chemicon AB5888) rozpoznającego cząsteczkę Nogo A w próbkach pochodzących od pacjentów MS, oraz brak detekcji u pacjentów kontrolnych. Fig.3. Western błot homogenatów tkanki mózgowej chorych na SM i innych. A) 20 kda fragment Nogo A jest obecny w tkankach pochodzących od pacjentów SM (ścieżki 1 i 2), lecz nie w tkankach od innych (kontrolnych) pacjentów (ścieżka 3 i 4), przy czym inne fragmenty Nogo-A o wyższym ciężarze cząsteczkowym są obecne w tkankach pacjentów SM i tkankach kontrolnych. W próbkach, do których nie poddawano pierwszego przeciwciała nie wykrywano żadnego z fragmentów Nogo A włącznie z fragmentem 20 kda (ścieżki 5,6), podobne wyniki obserwowano w próbkach, do których dodawano peptyd blokujący przeciwciało (ścieżki 7,8). Fragment Nogo A o masie około 20 kda wykrywano również w mózgach pacjentów z SM różnymi przeciwciałami króliczymi specyficznymi wobec Nogo A produkowanymi przez Chemicon (ścieżka 9) i nie był obserwowany w próbkach mózgów kontrolnych (ścieżka 10). B) Wszystkie trzy izoformy Nogo A, B i C zostały zidentyfikowane przeciwciałem specyficznym wobec C-końca cząsteczki Nogo w próbkach tkanki mózgowej pacjentów z SM i kontrolnych. C) Nogo-R jest obecny w próbkach tkanki od pacjentów SM i kontrolnych. Szczegółowy opis wynalazku W związku z brakiem regeneracji aksonów w mózgach chorych na SM, sprawdzono występowanie białek z rodziny Nogo w płynach mózgowo-rdzeniowych chorych na stwardnienie rozsiane. W tym celu wykorzystano metodę Western blot z wykorzystaniem dwóch przeciwciał firmy Santa-Cruz rozpoznających 1.) fragment charakterystyczny dla Nogo-A (Santa Cruz, sc-11032) i 2.) fragment wspólny dla wszystkich form Nogo (Santa Cruz sc-11033). W płynach mózgowo-rdzeniowych chorych na SM stwierdzono występowanie fragmentu 20 kda (94% płynów chorych na SM) rozpoznawanego przez przeciwciało przeciwko Nogo A (Santa Cruz, sc-11032), którego nie znaleziono w płynach mózgowo-rdzeniowych chorych z zajęciem ośrodkowego układu nerwowego z innych przyczyn niż stwardnienie rozsiane, w tym w chorobach zapalnych (zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu), degeneracyjnych (choroba Creutzfelda-Jakoba), w chorobie niedokrwiennej mózgu (udary). Identyczny fragment Nogo A występował w lizatach mózgów chorych na SM (uzyskanych z materiału autopsyjnego), ale nie był obecny w lizatach mózgów kontrolnych. Wyniki te dają podstawę do twierdzenia, iż fragment ten powstaje bezpośrednio w mózgu chorych na SM. Tak restrykcyjne występowanie fragmentu pochodzącego z Nogo-A w płynach mózgowo-rdzeniowych chorych na SM stwarza możliwość wykorzystania tej metody w diagnostyce SM. Przebadano ponad 80 płynów mózgowo- -rdzeniowych chorych na SM i ponad sto płynów kontrolnych. Bardzo wysoka swoistość występowania Nogo-A w płynie chorych na SM (94% v. 0) stwarza jednoznaczne podstawy dla wykorzystania badania obecności tego białka w diagnostyce SM. Obecność fragmentu Nogo-A w płynie mózgowo-rdzeniowym może również tłumaczyć brak regeneracji aksonów w ogniskach chorobowych SM w mózgu. Dlatego możliwe jest również wykorzystanie tego fragmentu białka Nogo-A do stworzenia blokerów wolnego Nogo-A co powinno prowadzić do zahamowania uszkodzenia aksonalnego i zwiększonej regeneracji zmian chorobowych w SM. Takie działanie blokerów Nogo-A umożliwiłoby nowe metody leczenia SM, a w związku z tym ograniczenie inwalidztwa chorych na SM. Reasumując należy uznać, że stwierdzone swoiste występowanie fragmentu rozpuszczalnego Nogo-A w płynie mózgowo-rdzeniowym chorych na SM umożliwia wykorzystanie oznaczania obecności tego fragmentu Nogo-A jako testu diagnostycznego SM oraz zastosowanie blokerów fragmentu Nogo-A jako metody leczenia SM. P r z y k ł a d y W doświadczeniach używano kozich przeciwciał anty-nogo (sc-11033), anty-nogo-a (sc-11032), anty-nogo-66 receptor (Nogo-R), anty-mag i anty-mog; anty-kozich przeciwciał związanych z HRP, anty-króliczych przeciwciał związanych z HRP; blokujących peptydów oraz przeciwciał anty-notch-1, anty-notch-3 i anty-jagged zakupionych w firmie Santa Cruz (Santa Cruz, CA); przeciwciała rozpoznające białko zasadowe mieliny (myelin basie protein - MBP) były zakupione w firmie Sigma (Sigma,
PL 210 751 B1 5 Poznań, Polska). W firmie Chemicon (Chemicon, CA, USA) zakupiono królicze inne przeciwciało rozpoznające Nogo-A (AB5888). Peptydy PLP139-151 i 178-191, peptyd MBP 87-99, peptyd MOG 35-55 zostały zsynetyzowane w Albert Einstein College of Medicine, New York, a białko MBP zakupione w Sigmie; wszystkich tych odczynników użyto do blokowania przeciwciała anty-nogo-a. Przeciwciało anty-nogo rozpoznaje C-końcowy peptyd, wspólny dla wszystkich izoform Nogo A, B i C. Przeciwciało anty-nogo-a rozpoznaje N-końcowy region Nogo-A, charakterystyczny tylko dla izoformy. Zgromadzono i poddano badaniom płyn mózgowo-rdzeniowy (PMR) 114 chorych na SM, 115 chorych na inne choroby neurologiczne (OND), 18 chorych na zapalenie opon mózgowo- -rdzeniowych i 11 pacjentów z klinicznie izolowanym zespołem (CIS). Próbki PMR wstępnie odwirowywano (6000 rpm) a następnie zamrażano w -80 C do czasu badania. Poziom białka w każdej próbce oceniano przy pomocy urządzenia GeneQuant (Pharmacia), i tę samą ilość białka (3 μg) nanoszono na kanał i poddawano elektroforezie. Wszyscy pacjenci z rozpoznanym SM spełniali kryteria McDonald dla klinicznie pewnego SM. Pacjentów podzielono na 2 grupy pacjentów z przebiegiem choroby: 1. z rzutami (RR-MS) (n=103) i 2. wtórnie przewlekle postępującym (SP-MS) (n=11). Wśród chorych na SM postać RR 33 badano w trakcie rzutu. 31 chorych miało zmiany w badaniu rezonansu magnetycznego MRI na krótko przed pobraniem PMR, a 13 z nich wzmacniające się po podaniu kontrastu. Średni wiek chorych na SM-RR wynosił 35 4±9 2 lat a średni okres trwania choroby 5 2±3 9 lat. Średni stopień niesprawności chorych wynosił 3 5±2 5w skali EDDS. Średni wiek chorych na SM -SP wynosił 44 2 ± 5 9 lat a średni okres trwania choroby 7 8±4 5 lat. Średni stopień niesprawności chorych wynosił 3 75±1 0 w skali EDDS. W grupie chorych z CIS było 11 pacjentów a średnia wieku wynosiła 25±2,7 lat; klinicznymi objawami w tej grupie było pozagałkowe zapalenie nerwu wzrokowego, uszkodzenie rdzenia, i inne izolowane objawy neurologiczne. Średni wiek chorych z zapaleniem opon-mózgowo rdzeniowych wynosił 41±13 lat a u jednego chorego rozpoznano gruźlicze zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, u 4 bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, u 3 zapalenie mózgu wywołane przez arbowirusy, i u 10 zapalenie mózgu wywołane przez inne wirusy. Średni wiek w grupie chorych na OND wynosił 47±21 lat, a u pacjentów rozpoznano ostre bóle głowy po wykluczeniu krwotoku podpajęczynówkowego (49), udar niedokrwienny (35), zespoły bólowe kręgosłupa (17), chorobę Creuzfeldt-Jakob (3), padaczkę (3), porażenie nerwów czaszkowych (8) przewlekłą polineuropatię (7) i zespół Device'a (3). W grupie chorych na inne choroby autoimmunologiczne przebiegające z zajęciem ośrodkowego układu nerwowego było 2 chorych ze zdiagnozowaną chorobą Behcet'a, 4 chorych z toczniem układowym - SLE, 3 chorych z zapaleniem naczyń mózgowych i 1 chory z neurosarkoidozą. Tkankę mózgową uzyskano z autopsji 3 chorych na SM (2 kobiety i 1 mężczyzna) i 2 chorych z udarem niedokrwiennym mózgu (1 kobieta i 1 mężczyzna). Do oceny metodą Western biot użyto fragmentów ze zmian demielinizacyjnych potwierdzonych oceną mikroskopową barwienia hematoksyliną i eozyną skrawków. Do oceny Western blot, 10 g fragmenty tkanki mózgowej były homogenizowane w 40 ml hipotonicznego buforu (30 mm NaHCO 3 and 0,5 mm PMSF, ph 7,1), i odwirowywane 100,000 x g. Poziom białka oceniano przy pomocy urządzenie GeneQuant (Pharmacia), i tę samą ilość białka nanoszono na kanał i poddawano elektroforezie i ocenie Western blot. Białka z lizatów tkankowych, jak i z PMR, były rozdzielane na żelu poliakrylamidowym SDS-PAGE, i przenoszone na membranę PVDF, blokowane 5% mlekiem w PBS-Tween 20 przez noc w temperaturze 4 C. Membranę wywoływano pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko Nogo, Nogo-A, Nogo-R, MAG, MOG oraz MBP (μg/ml in 5% NFDM in PBS-Tween) przez 1 h. W eksperymentach z blokowaniem przeciwciało anty-nogo-a inkubowano z peptydem blokującym przez 2h w temperaturze pokojowej i dopiero używano go do wywoływania membrany. Po kilkukrotnym płukaniu membranę inkubowano z drugorzędowym przeciwciałem przez 1 h. Po ponownym kilkukrotnym płukaniu membranę wywoływano ECL Plus i chemiluminescencje oceniano na kamerze. Do oceny istotności statystycznej użyto testu Fishers'a. Wyniki opisanych eksperymentów obrazujących realizację zastrzeganych aspektów wynalazku podsumowano w poniższej tabeli oraz na figurach 1-3.
6 PL 210 751 B1 T a b e l a 1 Obecności fragmentu białka Nogo-A według wynalazku w CSF od różnych grup pacjentów, badane techniką Western blot Pacjenci wynik pozytywny Nogo-A wynik negatywny SM 110 4 CIS (zespół izolowany klinicznie) 11 0 Zapalenie opon mózgowo- -rdzeniowych ostre bóle głowy po wykluczeniu krwotoku podpajęczynówkowego 0 18 0 49 choroba Creuzfeldt-Jakob 0 3 padaczka 0 3 zespoły bólowe kręgosłupa 0 17 udar niedokrwienny 0 35 porażenie nerwów czaszkowych 0 8 choroba Behce'a 0 2 toczeń układowy SLE 0 4 zapalenie naczyń mózgowych 0 3 neurosarkoidoza 0 1 CIDP 0 7 Zespół Devic'a 0 3 Zastrzeżenia patentowe 1. Izolowany fragment białka Nogo-A posiadający masę cząsteczkową 20 000 i posiadający sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję peptydu SEQ ID No. 1. 2. Izolowana cząsteczka polinukleotydu kodującego fragment białka Nogo-A posiadający masę cząsteczkową 20 000 i posiadający sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję peptydu SEQ ID No. 1. 3. Cząsteczka polinukleotydu kodującego polipeptyd SEQ ID No. 1. 4. Sposób diagnozowania stwardnienia rozsianego lub polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej, znamienny tym, że w próbce płynu mózgowo-rdzeniowego pacjenta bada się obecność fragmentu białka Nogo-A posiadającego masę cząsteczkową 20 000 i posiadającego sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję peptydu SEQ ID No. 1, przy czym jego obecność świadczy o występowaniu stwardnienia rozsianego lub polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że do obecności fragmentu białka Nogo-A stosuje się przeciwciało specyficzne wobec tego fragmentu. 6. Sposób otrzymywania przeciwciała do wykrywania lub leczenia stwardnienia rozsianego lub polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej obejmujący immunizację ssaka specyficznym antygenem oraz izolację przeciwciał specyficznych wobec stosowanego antygenu, znamienny tym, że do immunizacji stosuje się fragment białka Nogo-A posiadający masę cząsteczkową 20 000 i posiadający sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję peptydu SEQ ID No. 1 albo fragment tego białka zawierający SEQ ID No. 1, korzystnie peptyd składający się z SEQ ID No. 1. 7. Przeciwciało otrzymane sposobem jak określono w zastrz. 6 do stosowania w diagnostyce lub terapii stwardnienia rozsianego lub polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej. 8. Zastosowanie przeciwciała specyficznego wobec fragmentu białka Nogo-A posiadającego masę cząsteczkową 20 000 i posiadającego sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję pep-
PL 210 751 B1 7 tydu SEQ ID No.1 albo przeciwciała specyficznego wobec fragmentu tego białka zawierającego SEQ ID No. 1 do wytwarzania preparatu do leczenia lub diagnozowania stwardnienia rozsianego lub polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej. 9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że stosowane przeciwciało jest specyficzne wobec peptydu składającego się z SEQ ID No. 1. 10. Zastosowanie fragmentu białka Nogo-A posiadającego masę cząsteczkową 20 000 i posiadającego sekwencję aminokwasową zawierającą sekwencję peptydu SEQ ID No. 1 albo fragmentu tego białka zawierającego SEQ ID No. 1 do wytwarzania preparatu do leczenia lub diagnozowania stwardnienia rozsianego lub polineuropatii zapalno-demielinizacyjnej. 11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że stosowany fragment białka jest peptydem składającym się z SEQ ID No. 1. Rysunki
8 PL 210 751 B1
PL 210 751 B1 9
10 PL 210 751 B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)