Instrukcja do testu Anty-Borrelia burgdorferi VIsE ELISA (IgG) NUMER KATALOGOWY PRZECIWCIAŁA PRZECIW KLASA IG SUBSTRAT FORMAT EI 2132-9601-1 G antygen Borrelia VlsE IgG Opłaszczona antygenem płyta mikrotitracyjna 96 x 01 (96) Zasada testu ELISA: Zestaw testowy ELISA służy do półilościowego lub ilościowego oznaczania in vitro ludzkich przeciwciał klasy IgG przeciwko antygenowi VlsE Borrelia w surowicy lub plazmie. Opakowanie zawiera mikropłytkę z paskami mikroprobówek każdy z 8 osobno odłamywanymi studzienkami reakcyjnymi opłaszczonymi VlsE. W pierwszym etapie studzienki reakcyjne inkubuje się z rozcieńczonymi próbkami pacjentów. W pozytywnych przypadkach swoiste przeciwciała klasy IgG (także IgA i IgM) wiążą się z obecnymi na powierzchni studzienki antygenami. Związane przeciwciała wykrywa się podczas drugiego etapu inkubacji z przeciwciałami skierowanymi przeciwko ludzkim IgG, znakowanymi enzymem (koniugat enzymatyczny), który następnie katalizuje reakcję barwną. Zawartość zestawu testowego: Składnik Kolor Format Symbol 1. Studzienki reakcyjne opłaszczone antygenem: 12 pasków mikroprobówek, każdy z 8 osobno odłamywanymi --- 12 x 8.STRIPS. studzienkami reakcyjnymi w ramce, gotowe do użycia 2. Kalibrator 1 200 RU/ml (ludzki, IgG), gotowy do użycia ciemnoczerwony 1 x 2,0 ml.cal 1. 3. Kalibrator 2 20 RU/ml (ludzki, IgG), gotowy do użycia czerwony 1 x 2,0 ml.cal 2. 4. Kalibrator 3 2 RU/ml (ludzki, IgG), gotowy do użycia jasnoczerwony 1 x 2,0 ml.cal 3. 5. Kontrola pozytywna (ludzka, IgG), gotowa do użycia niebieski 1 x 2,0 ml.pos CONTROL. 6. Kontrola negatywna (ludzka, IgG), gotowa do użycia zielony 1 x 2,0 ml.neg CONTROL. 7. Koniugat enzymatyczny znakowane peroksydazą przeciwciała przeciw zielony 1 x 12,0 ml.conjugate. ludzkim IgG (królicze), gotowy do użycia 8. Bufor do rozcieńczania próbek gotowy do użycia jasnoniebieski 1 x 100 ml.sample BUFFER. 9. Bufor do płukania 10-krotnie skoncentrowany bezbarwny 1 x 100 ml.wash BUFFER 10x. 10. Roztwór chromogenu/substratu TMB/H 2 O 2, gotowy do użycia bezbarwny 1 x 12 ml.substrate. 11. Roztwór przerywający reakcję 0,5 M kwas siarkowy, gotowy do użycia bezbarwny 1 x 12 ml.stop SOLUTION. 12. Instrukcja wykonania testu --- 1 ulotka 13. Certyfikat kontroli jakości --- 1 protokół.lot. Numer seryjny Temperatura przechowywania.ivd. Do oznaczeń in vitro Data ważności Przechowywanie i trwałość: Należy przechowywać w temperaturze pomiędzy +2 C i +8 C, nie zamrażać! Nieotwarty zestaw testowy jest trwały do daty ważności podanej na opakowaniu. Usuwanie odpadów: Próbki pacjentów, kalibratory, kontrole oraz zainkubowane paski ze studzienkami reakcyjnymi powinny być traktowane jak odpady zakaźne. Wszystkie odczynniki muszą być utylizowane zgodnie z obowiązującymi przepisami.
Przygotowanie i trwałość reagentów Wskazówka: Wszystkie reagenty muszą osiągnąć temperaturą pokojową (+18 C do +25 C) około 30 minut przed użyciem. Po pierwszym użyciu reagenty są stabilne aż do podanej na opakowaniu daty ważności o ile są składowane w temperaturze +2 C do +8 C i chronione przed zanieczyszczeniem, pod warunkiem, że poniżej nie podano inaczej. - Opłaszczone studzienki reakcyjne: Gotowe do użycia. Zamykaną torebkę ochronną płyty mikrotitracyjnej należy rozerwać w miejscu nacięcia ponad zamknięciem. Otwierać dopiero, gdy osiągnie temperaturę otoczenia, by zapobiec zawilgotnieniu preparatu! Po oderwaniu potrzebnej liczby studzienek od płyty mikrotitracyjnej resztę należy natychmiast włożyć do torebki ochronnej i zacisnąć szew zapinający (nie usuwać torebki osuszającej). Po otwarciu torebki ochronnej opłaszczone antygenem studzienki reakcyjne są trwałe przez 4 miesiące, przy przechowywaniu w temperaturze od +2 C do +8 C w suchym miejscu. - Surowice kalibracyjne i kontrolne: Gotowe do użycia. Odczynniki należy dokładnie wymieszać przed użyciem. - Koniugat enzymatyczny: Gotowy do użycia. Koniugat enzymatyczny należy dokładnie wymieszać przed użyciem. - Bufor do rozcieńczania próbek: Gotowy do użycia. - Bufor do płukania: Bufor do płukania jest 10-krotnie stężony. Jeśli w buforze widoczne są kryształy soli, należy ogrzać go do temp +37 C i dobrze wymieszać przed rozcieńczaniem. Potrzebną ilość buforu należy pobrać z butelki czystą końcówką pipety i rozcieńczyć wodą dejonizowaną lub destylowaną (1 część odczynnika plus 9 części wody destylowanej). Przykład: W celu zainkubowania 1 paska studzienek należy pobrać 5 ml skoncentrowanego buforu i 45 ml wody destylowanej. Gotowy do użycia, rozcieńczony bufor, jest trwały przez 1 miesiąc, jeśli jest odpowiednio przechowywany w temperaturze +2 C do +8 C. - Roztwór chromogenu/substratu: Gotowy do użycia. Butelkę należy zakręcić natychmiast po użyciu, ponieważ roztwór jest wrażliwy na światło. Roztwór chromogenu/substratu musi być przejrzysty; nie wolno go używać, jeśli przed użyciem jest niebieskawo zabarwiony. - Roztwór przerywający reakcję: Gotowy do użycia. Ostrzeżenie: Używane surowice kontrolne i kalibratory dały wyniki negatywne w testach immunoenzymatycznych i w immunofluorescencji pośredniej pod względem: HBsAg, anty-hcv, anty-hiv-1 i anty-hiv-2. Jednakże wszystkie składniki testu należy traktować jak materiał zakaźny i zachowywać ostrożność. Poza tym niektóre z reagentów zawierają toksyczny azydek sodu. Należy unikać kontaktu ze skórą. Przygotowanie i trwałość próbek pacjentów Materiał: Ludzka surowica lub plazma pobrana na EDTA, heparynę lub cytrynian. Trwałość: Przeznaczone do badania próbki pacjentów mogą być przechowywane do 14 dni w temperaturze +2 C do +8 C. Rozcieńczone próbki muszą być zainkubowane w ciągu jednego dnia roboczego. Rozcieńczane próbek: Próbki pacjentów są rozcieńczone w stosunku 1:101 w buforze do rozcieńczania próbek. Przykład: dodać 10 µl surowicy do 1,0 ml buforu do rozcieńczania próbek i dobrze wymieszać, np. na wytrząsarce typu vortex (wymieszanie jedynie końcówką pipety jest niewystarczające). UWA: Kalibratory i kontrole są wstępnie rozcieńczone i gotowe do użycia. Nie rozcieńczać! 2
Inkubacja Dla oceny półilościowej użyć kalibratora 2, kontroli pozytywnej i negatywnej oraz próbek badanych surowic. Dla oceny ilościowej użyć kalibratora 1, 2 i 3, kontroli pozytywnej i negatywnej oraz próbek badanych surowic. Inkubacja próbek: (1. krok) Płukanie: Zgodnie ze schematem odpipetować do studzienek reakcyjnych po 100 µl surowicy kalibracyjnej, pozytywnej i negatywnej surowicy kontrolnej oraz rozcieńczonych próbek pacjentów. Inkubować 30 minut w temperaturze pokojowej (+18 C do +25 C). Manualne: Opróżnić studzienki reakcyjne i trzykrotnie płukać, za każdym razem używając 300 µl rozcieńczonego buforu płuczącego. Automatyczne: Pukać studzienki reakcyjne trzykrotnie za każdym razem używając 400 µl rozcieńczonego buforu płuczącego (ustawienie programu: np. TECAN Columbus Washer Overflow Mode ). Bufor płuczący powinien pozostawać w studzience, co najmniej 30-60 sek. podczas każdego cyklu. Następnie bufor odessać bądź wylać. Bez względu na to czy proces płukania był przeprowadzony manualnie czy automatycznie, płytę mikrotitracyjną należy odwrócić studzienkami w dół i silnie wytrząsnąć nad papierem filtracyjnym, aby całkowicie usunąć resztki buforu płuczącego. Uwaga: Resztki roztworu (> 10 µl), pozostające po płukaniu w studzienkach reakcyjnych mogą mieć wpływ na substrat i prowadzić do fałszywego obniżenia wartości ekstynkcji. Niedostateczne płukanie (mniej niż 3 cykle płukania, za mała objętość buforu płuczącego, za krótkie czasy reakcji) mogą z kolei prowadzić do fałszywie podwyższonych wartości ekstynkcji. Niewypełnione pozycje pasma mikropłytki, na której ułożone są odłamane studzienki reakcyjne, należy wypełnić studzienkami typu blank o formacie odpowiadającym badanemu parametrowi. Inkubacja koniugatu: (2. krok) Płukanie: Inkubacja substratu: (3. krok) Przerwanie reakcji: Pomiar: Odpipetować do każdej studzienki reakcyjnej po 100 µl roztworu koniugatu enzymatycznego (znakowana peroksydazą antyludzka IgG). Inkubować 30 minut w temperaturze pokojowej (+18 C do +25 C). Opróżnić studzienki reakcyjne. Płukać jak wyżej. Odpipetować do każdej studzienki reakcyjnej po 100 µl roztworu substratu/ chromogenu. Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej (+18 C do +25 C); chronić przed nasłonecznieniem. Odpipetować do każdej studzienki reakcyjnej, w tej samej kolejności i z tą samą szybkością, co przy pipetowaniu substratu, po 100 µl roztworu przerywającego reakcję. Fotometryczna ocena intensywności barwy powinna być przeprowadzona w ciągu 30 minut od zastopowania reakcji, przy długości fali 450 nm i referencyjnej długości fali między 620 nm i 650 nm. Przed pomiarem potrząsnąć płytą mikrotitracyjną, by zapewnić równomierne rozłożenie barwnika. 3
Schemat pipetowania 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A K 2 P 6 P 14 P 22 K 1 P 4 P 12 P 20 B poz. P 7 P 15 P 23 K 2 P 5 P 13 P 21 C neg. P 8 P 16 P 24 K 3 P 6 P 14 P 22 D P 1 P 9 P 17 poz. P 7 P 15 P 23 E P 2 P 10 P 18 neg. P 8 P 16 P 24 F P 3 P 11 P 19 P 1 P 9 P 17 G P 4 P 12 P 20 P 2 P 10 P 18 H P 5 P 13 P 21 P 3 P 11 P 19 Schemat pipetowania dla pasków studzienek reakcyjnych 1-4 jest przykładem dla przeprowadzenia oceny testu półilościowej dla 24 surowic pacjentów (P 1 do P 24). Schemat pipetowania dla pasków studzienek reakcyjnych 7-10 jest przykładem dla przeprowadzenia oceny testu ilościowej dla 24 surowic pacjentów (P 1 do P 24). Kalibratory (K 1 do K 3), pozytywne (poz.) i negatywne (neg.) surowice kontrolne jak i surowice pacjentów są oceniane na podstawie jednego pomiaru. Większą pewność testu ELISA można osiągnąć inkubując każdą z próbek dwukrotnie. Studzienki reakcyjne mogą być osobno odłamywane od mikropłytki: aby, nie marnować reagentów należy przygotowywać odpowiednią do liczby badanych próbek ilość substratów. Kontrola pozytywna i negatywna służą, jako kontrole wewnętrzne prawidłowości przeprowadzenia testu. Powinny być używane podczas każdej inkubacji. Ocena testu Ocena półilościowa: Wyniki mogą być oceniane półilościowo poprzez wyliczenie wartości tzw. współczynnika Ratio, czyli stosunku ekstynkcji kontroli lub próbki pacjenta do ekstynkcji kalibratora 2. Do wyliczenia Ratio stosuje się następujący wzór: Ekstynkcja kontroli lub próbki pacjenta Ekstynkcja kalibratora 2 = Ratio rekomenduje następującą interpretację wyników: Ratio <0,8: Ratio 0,8 do <1,1: Ratio 1,1: negatywny graniczny pozytywny W przypadku granicznego wyniku testu, po 7 dniach należy pobrać kolejną próbkę od pacjenta i zbadać ją równolegle z pierwszą próbką. Wyniki obu badań pozwolą na właściwą oceną zmian miana przeciwciał. Ocena ilościowa: Odwzorowując w linearnym układzie współrzędnych wartości ekstynkcji 3 surowic kalibracyjnych i odpowiadające im względne jednostki a następnie łącząc naniesione punkty, wykreśla się krzywą wzorcową, z której można odczytać stężenie przeciwciał w surowicy. Należy użyć opcji point to point w przypadku wykreślania krzywej za pomocą programu komputerowego. Poniżej przedstawiono przykładową krzywą wzorcową o typowym przebiegu. Nie należy używać tej krzywej do oceny ilościowej stężenia przeciwciał w surowicy pacjentów. 4
Ekstynkcja Extinction 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 RU / ml Jeśli ekstynkcja próbki surowicy pacjenta przewyższa wartość kalibratora 1 (200 RU/ml), wynik powinien być wydany, jako >200 RU/ml. Poleca się powtórne przeprowadzenie testu z próbką rozcieńczoną np. w stosunku 1:400. Wynik w RU/ml odczytany z krzywej należy pomnożyć przez 4. Górna granica normy dla osób niezakażonych (wartość cut-off) rekomendowana przez wynosi 20 jednostek relatywnych (RU)/ml. rekomenduje następująca interpretację wyników: <16 RU/ml: negatywny 16 do <22 RU/ml: graniczny 22 RU/ml: pozytywny W przypadku podwójnych oznaczeń należy wyciągnąć średnią z dwóch pomiarów. Jeśli wartości znacznie się różnią próbka musi być przebadana ponownie. W diagnostyce wyniki badań serologicznych zawsze należy brać pod uwagę łącznie z objawami klinicznymi. Charakterystyka testu Kalibracja: Ponieważ, nie istnieje międzynarodowa surowica referencyjna do oceny przeciwciał przeciwko antygenowi VlsE z Borrelia, kalibrację przeprowadza się w jednostkach względnych (relativ unit; RU/ml). W każdym przeprowadzonym teście wartości ekstynkcji surowic kalibracyjnych, jak również względne jednostki/ratio pozytywnych i negatywnych surowic, kontrolnych muszą leżeć w określonym dla każdej serii zakresie tolerancji, który podany jest w załączonym certyfikacie kontroli jakości. Jeśli wymóg ten nie jest spełniony dla kontroli, wyniki testu mogą być niedokładne i analiza powinna być powtórzona. Aktywność stosowanego enzymu zależy od temperatury, dlatego wartości ekstynkcji mogą być zmienne, jeśli, nie używa się termostatu. Im wyższa jest temperatura pokojowa (+18 C to +25 C) podczas poszczególnych kroków inkubacji, tym wyższe będą wartości ekstynkcji. Odpowiednie różnice dotyczą też czasu inkubacji. Surowice kalibracyjne poddane są tym samym wpływom, dlatego różnice te równoważą się w dużym stopniu przy obliczaniu wyników. Antygen: Studzienki mikropłytki zostały opłaszczone rekombinowanym antygenem VIsE (varible major protein-like sequence, expressed) Borrelia burgdorferi. VIsE jest nowo scharakteryzowanym białkiem powierzchniowym Borrelia, które ulega ekspresji jedynie in vivo. VlsE zawiera konserwatywne i wysoko immunogeniczne epitopy. 5
Linearność: W celu określenia linearności testu Anty-Borrelia plus VIsE ELISA (IgG) zbadano szereg rozcieńczeń próbki pacjenta o wysokim stężeniu przeciwciał. Test Anty-Borrelia VIsE ELISA (IgG) przebiega linearnie, przynajmniej w badanym zakresie pomiaru (7-127 RU/ml). Granica wykrywalności: Dolna granica wykrywalności zdefiniowana, jako trzykrotna wartość odchylenia standardowego próby ślepej i stanowi najniższą wartość oznaczalnego miana przeciwciał. Dolna granica czułości testu Anty-Borrelia VIsE ELISA (IgG) wynosi ok. 1 RU/ml. Reakcje krzyżowe: Opisywany test ELISA nie wykazał żadnych reakcji krzyżowych. Interferencje: Hemolityczne, lipemiczne oraz surowice z hiperbilirubinemią, do stężenia hemoglobiny 10 mg/ml, trójglicerydów 20 mg/ml, bilirubiny 0,4 mg/ml nie wpływały w żaden sposób na wyniki analityczne prezentowanego testu ELISA. Powtarzalność: W celu kontroli powtarzalności oceniono współczynnik zmienności (CV) pomiarów w obrębie tego samego testu (Intra-Assay-Variation) i współczynnik zmienności pomiarów przeprowadzanych w odstępach czasu (Inter-Assay-Variation) używając 3 surowic. Do wyliczenia CV Intra-Assay wykonano dla każdej surowicy 20 oznaczeń, zaś w przypadku CV Inter-Assay przeprowadzono 4 oznaczenia każdej surowicy w ciągu 6 różnych dni. Intra-Assay-Variation, n = 20 Inter-Assay-Variation, n = 4 x 6 Surowica Średnia CV Średnia CV Surowica (RU/ml) (%) (RU/ml) (%) 1 58 3,4 1 58 3,4 2 73 3,1 2 68 4,2 3 93 3,3 3 95 3,7 Czułość i swoistość: 71 próbek pacjentów oraz zdrowych dawców krwi zostało przebadanych za pomocą Anty-Borrelia VIsE ELISA (IgG) oraz Anty-Borrelia ELISA. Czułość opisywanego testu wyniosła 96,6% a sowistość 95,2%. n = 71 Anty-Borrelia VlsE ELISA Anti-Borrelia ELISA pozytywny negatywny pozytywny 28 2 negatywny 1 40 Grupa referencyjna: Oceniono poziom przeciwciał przeciwko Borrelia VlsE (IgG) u 300 zdrowych dawców krwi za pomocą testu opisywanego testu ELISA. Przy przyjęciu cut-off 20 RU/ml, 1,71% dawców krwi było pozytywnych wobec przeciwciał przeciw Borrelia VlsE (IgG), co odpowiada danym epidemiologicznym dotyczącym osób dorosłych. Znaczenie kliniczne Borrelia burgdorferi jest gatunkiem bakterii zaliczanym do rodziny Spirochaetaceae. Rodzina ta obejmuje pięć rodzajów: Borrelia, Spirochaeata, Cristispira, Treponema i Leptospira. Borrelia burgdorferi jest patogenem wywołującym boreliozę (chorobę z Lyme), przenoszonym przez ukąszenie kleszcza. Przeciwciała przeciwko Borrelia burgdorferi pojawiają się w surowicy znacznego odsetka zakażonych. Częstość występowania tych przeciwciał w populacji niemieckiej wynosi przeciętnie poniżej 15% nie wliczając obszarów endemicznych. Osoby pracujące w leśnictwie wykazują przeciwciała przeciw borrelia w 40% przypadków. Zakażenie krętkami Borrelia burgdorferi może wywoływać objawy dermatologiczne, neurologiczne, okulistyczne, reumatologiczne i internistyczne. Obraz kliniczny boreliozy dzieli się na trzy stadia: 6
Stadium I: Typową pierwotną manifestacją zakażenia Borrelia burgdorferi jest rumień wędrujący (erythema migrans), czyli zaczerwienienie skóry, które pojawia się kilka dni do kilku tygodni po ukąszeniu przez kleszcza i rozszerza się pierścieniowato wokół tego miejsca. Rumieniowi towarzyszą grypopodobne objawy ogólne takie jak gorączka, dreszcze, bóle głowy, wymioty. W niektórych przypadkach dochodzi do limfadenopatii (Lymphadenosis cutis benigna). Stadium I może ulec spontanicznemu wyleczeniu bądź przejść w uogólnioną boreliozę. Faza przejściowa jest zwykle bezobjawowa. Serologicznie u 50% do 90% pacjentów w stadium I stwierdza się przeciwciała klasy IgM przeciwko Borrelia burgdorferi. Prewalencja swoistych przeciwciał IgG jest dużo niższa. Jednakże wyniki testów serologicznych często okazują się negatywne na tym etapie choroby. Jeżeli występują odpowiednie objawy choroby, zaleca się skontrolowanie poziomu przeciwciał po kilku tygodniach. Stadium II: Kilka tygodni lub miesięcy po ukąszeniu przez kleszcza mogą pojawić się różnorodne objawy. Na pierwszym planie znajdują się objawy neurologiczne: zapalenie opon mózgowych, zapalenie mózgu, asymetryczne zapalenie wielonerwowe, porażenia nerwów czaszkowych, limfocytarne zapalenie opon i korzeni nerwowych Bannwartha. Często występuje również zapalenie stawów, szczególnie kolanowych, a także niezlokalizowane bóle kości, mięśni i stawów. Rzadsze są manifestacje kardiologiczne takie jak: zapalenie mięśnia sercowego lub zapalenie osierdzia. Przeciwciała przeciw Borrelia burgdorferi wykrywa się u 50-90% pacjentów w II stadium. We wczesnej fazie tego stadium przeciwciała klasy IgM przeważnie są jeszcze pozytywne, w późnej fazie występują często już tylko przeciwciała IgG. Przeciwciała klasy IgM mogą jednak przetrwać dłużej. Stadium III: Typowymi objawami zakażenia Borrelia burgdorferi w stadium III są przewlekle nawracające nadżerkowe zapalenia stawów, zanikowe zapalenie skóry obwodowych części kończyn, postępujące zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego o przebiegu podobnym do stwardnienia rozsianego. Bez leczenia stadium III może rozwijać się przez lata i dziesiątki lat po ukąszeniu. W tym stadium przeciwciała klasy IgG są wyraźnie podwyższone u 90% do 100% pacjentów, podczas gdy przeciwciała klasy IgM wykrywane są bardzo rzadko. Infekcję Borrelia burgdorferi można zdiagnozować serologicznie u wielu pacjentów z różnorodnymi objawami (np. z różnymi bólami reumatycznymi lub poważnymi symptomami neurologicznymi), których przyczyny nie udało się ustalić. W diagnostyce neuroboreliozy decydujące znaczenie, dużo ważniejsze od badań serologicznych, ma oznaczenie przeciwciał w płynie mózgowo-rdzeniowym. Reakcje krzyżowe przeciwciał w płynie mózgowo-rdzeniowym pojawiają się znacznie rzadziej niż w przypadku surowicy, dlatego też reakcji pozytywnych oczekuje się tylko u pacjentów z neuroboreliozą. Piśmiennictwo 1. Lawrenz MB, Hardham JM, Owens RT, Nowakowski J, Steere AC, Wormser GP, Norris SJ. Human antibody responses to VlsE antigenic variation protein of Borrelia burgdorferi. J Clin Microbiol; 37: 3997-4004 (1999). 2. Magnarelli LA, Lawrenz MB, Norris SJ, Fikrig E. Comparative reactivity of human sera to recombinant VlsE and other Borrelia burgdorferi antigens in class-specific enzyme-linked immunosorbent assays for Lyme borreliosis. J Med Microbiol; 51: 649-655 (2002). 3. Schulte-Spechtel U, Lehnert G, Liegl G, Fingerle V, Heimerl C, Johnson BJB, Wilske B. Significant improvement of the recombinant Borrelia-specific immunoglobulin G immunoblot test by addition of VlsE and a DbpA homologue derived from Borrelia garinii for diagnosis of early neuroborreliosis. J Clin Microbiol; 41: 1299-1303 (2003). 7
WYTWÓRCA: Seekamp 31, D-23560 Luebeck Tel: 00 49 451 5855 0, fax: 00 49 451 5855 591 www.euroimmun.de Dystrybutor w Polsce: Polska Sp. z o.o. Ul. Widna 2a, 50-543 Wrocław Tel: 00 48 71 373 08 08, fax: 00 48 71 373 00 11 www.euroimmun.pl EI_2132-1G_A_PL_C03.doc Version: 2016-07-15