Genogatunki Borrelia burgdorferi sensu lato patologiczne dla człowieka

Transkrypt

1 Zakażenia Borrelia

2 Genogatunki Borrelia burgdorferi sensu lato patologiczne dla człowieka Przenoszone przez kleszcze we wszystkich formach rozwojowych USA Borrelia burgdorferi sensu stricto Europa Borrelia burgdorferi sensu stricto Borrelia garinii Borrelia afzelii Borrelia spielmani

3 Zgłoszone zachorowania na boreliozę w Polsce Zachorowalność na boreliozę w latach Liczba nowych zachorowań Rok

4 Kleszcz Kleszcz wbija głęboko rurkę ssącą w skórę ofiary. Ślina dostająca się do rany zapobiega krzepnięciu krwi i ułatwia ssanie. Z jelit i śliny kleszcza bakterie i wirusy przedostają się do organizmu ofiary. Kleszcz na skórze

5 Kleszcz

6 Objawy boreliozy Faza I: charakterystyczny rumień wędrujący erythema migrans, towarzyszące niespecyficzne objawy grypopodobne: gorączka, osłabienie, dreszcze, bóle głowy, mięśni i stawów Faza II: tygodnie lub miesiące po ukłuciu przez kleszcza: objawy neurologiczne (meningitis, cranial neuropathy, facial nerve palsy, radiculoneuritis), układu ruchu i serca Faza III: Arthritis (przejściowe obrzęki i bóle jednego lub kilku stawów), Acrodermatitis chronica atrophicans, Enzephalomyelitis

7 Manifestacje kliniczne boreliozy w czasie Ukłucie kleszcza Infekcja lokalna Rumień wędrujący Ostra manifestacja narządowa Rozsianie do CUN, stawów, serca Przewlekła manifestacja narządowa Zajęcie CUN, stawów, skóry Krętki we krwi NAWROTY!!! Przebieg choroby w czasie

8 Metody wykrycia Borrelia burgdorferi s.l. BEZPOŚREDNIE POŚREDNIE Badanie mikroskopowe ilość bakterii zbyt niska do bezpośredniego wykrycia Hodowla - czasochłonna - niska czułość Polymerase chain reaction (PCR) nie określono standardowych warunków reakcji (wpływ ekstrakcji DNA, wybór starterów, transport próbek, rodzaj materiału (biopsje, surowica, płyn stawowy, płyn m-rdz.) czułość diagnostyczna PCR nie została udowodniona nawet, gdy stosowano więcej niż jedną sekwencję PCR umożliwia różnicowanie podgatunków ELISA Western-blot Line-blot

9 Zalecenia diagnostyczne Rok 1995 Rekomendacje CDC (Center for Disease Control, Atlanta) ELISA/IIFT IgM, IgG Wynik pozytywny/wątpliwy Western-blot Rok 2000 Quality Standards for the Microbiological Diagnosis of Infectious Diseases German Society for Hygiene and Microbiology (DGHM) ELISA/IIFT IgM, IgG Wynik pozytywny/wątpliwy Western-blot Rok 2007 Rekomendacje Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych (PTEiLCZ) ELISA IgM, IgG Wynik pozytywny/wątpliwy Western-blot

10 Immunofluorescencja pośrednia (IIFT): zasada testu Komórka z antygenem Specyficzne ludzkie przeciwciało Znakowane fluoresceiną przeciwciało antyludzkie FITC

11 Immunofluorescencja pośrednia EUROPLUS Mozaika BIOCHIP zawiera następujące substraty: B. burgdorferi OspC B. afzelii VlsE

12 Immunofluorescencja pośrednia: ocena testu Ocena wzrokowa pod mikroskopem Wynik jakościowy: dodatni / wątpliwy / ujemny Wynik półilościowy: miano przeciwciał - najwyższe rozcieńczenie surowicy, przy którym widoczne jest jeszcze specyficzne świecenie

13 Immunofluorescencja pośrednia: ocena testu Rozcieńczenie: 1:100 1:1000 1: MIANO

14 Immunofluorescencja pośrednia: ocena testu Dla Borrelia: Dodatni dla IgG: Miano 1:100 lub wyższe Dodatni dla IgM: Miano 1:10 lub wyższe

15 Zasada testu immunoenzymatycznego Płyta mikrotitracyjna / membrana opłaszczona antygenem Specyficzne ludzkie przeciwciało Znakowane enzymem przeciwciało antyludzkie POD/AP substrat chromogen zabarwienie

16 Dlaczego dodatni wynik testu ELISA należy potwierdzić? Wspólne przeciwciało!!! przeciwciała Borrelia Inna bakteria Wspólny antygen!!!

17 Dlaczego dodatni wynik testu ELISA należy potwierdzić? Wynik Borrelia pozytywny Surowica ludzka Antygeny z Borrelia Studzienka ELISA Przykład 1

18 Dlaczego dodatni wynik testu ELISA należy potwierdzić? Wynik Borrelia pozytywny Surowica ludzka Antygeny z Borrelia Studzienka ELISA Przykład 2

19 Dlaczego dodatni wynik testu ELISA należy potwierdzić? Wynik Borrelia pozytywny Surowica ludzka Antygeny z Borrelia Studzienka ELISA Przykład 3

20 Dlaczego dodatni wynik testu ELISA należy potwierdzić? Wynik Borrelia pozytywny Surowica ludzka Antygeny z Borrelia Studzienka Pełne spektrum antygenów zapewnia maksymalnie czułą diagnostykę!!!! ELISA Przykład 4

21 ELISA Trójstopniowa kalibracja, znaczone kolorami, gotowe do użycia reagenty, osobno odłamywane studzienki Antygen: optymalna mieszanka pełnego ekstraktu Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii i garinii Anty-Borrelia ELISA IgM z absorbentem czynnika reumatoidalnego i IgG w buforze do próbek (zapobiega wiązaniu czynnika reumatoidalnego lub IgG i fałszywym wynikom) ELISA z rekombinowanym antygenem VlsE

22 Anty-Borrelia ELISA Neuroborreliosis Wykrycie wewnątrzoponowo syntetyzowanych przeciwciał przeciwko Borrelia burgdorferi dzięki jednoczesnemu badaniu płynu mózgowordzeniowego (CSF) i surowicy Obliczanie wskaźnika specyficzności przeciwciał: Borrelia-specific liquor / serum quotient (LSQpath-spec.) LSQrel. = LSQpath-spec. (IgG) / LSQtotal (IgG) Wartości > 1.3 wskazują na wewnątrzoponową syntezę przeciwciał przeciwko Borrelia

23 Test ELISA: ocena Fotometryczny pomiar zabarwienia (absorbancja) Wynik półilościowy: Współczynnik R (Ratio) R = absorbancja próbki / absorbancja Cut-off Wynik ilościowy: RU/ml dla IgG i IgM: Dodatni >22 RU/ml 16 < Graniczny < 22 Ujemny <16 RU/ml

24 Anty-Borrelia - rodzaje testów Klasyczne testy Western Blot Antygeny natywne Western Blot EUROLINE Antygeny natywne + antygeny rekombinowane Testy EUROLINE Antygeny rekombinowane

25 Dlaczego dodatni wynik testu ELISA należy potwierdzić? Aby stwierdzić czy dodatni wynik testu ELISA jest spowodowany przez specyficzne przeciwciała anty-borrelia czy niespecyficzne wytworzone na skutek innych infekcji, należy wykonać test Western-blot

26 Produkcja testów Western Blot

27 Produkcja testów Western Blot: 1.Elektroforeza Rozdzielenie elektroforetyczne białek na żelu poliakryloamidowym (PAGE). Antygeny są rozdzielone według ich masy cząsteczkowej. Ekstrakt białek Żel poliakryloamidowy

28 Produkcja testów Western Blot: 1.Elektroforeza Rozdzielenie elektroforetyczne białek na żelu poliakryloamidowym (PAGE). Antygeny są rozdzielone według ich masy cząsteczkowej. Ekstrakt białek Żel poliakryloamidowy

29 Produkcja testów Western Blot: 2.Elektroblotting Przeniesienie białek z żelu na membranę (electroblotting). Membrana

30 Produkcja testów Western Blot: 2.Elektroblotting Przeniesienie białek z żelu na membranę (electroblotting). Pasma antygenowe Membrana

31 Produkcja testów Western Blot: 3.Paski testowe Membrana jest cięta na paski testowe

32 Western Blot: EUROIMMUN Anti-Borrelia-burgdorferi WESTERNBLOT Evaluation template, Ch.-B. : 10308z-64 Wyraźne i łatwe do oceny specyficzne i niespecyficzne prążki antygenów p 75 p 62 p 57/59 p 50 p 47 p 43 p 36 p 32 p 29 p 28 p 83 p 41, Flag. p 39, Bmp A p 34, Osp B p 31, Osp A Obecne wszystkie antygeny Borrelia (pełen ekstrakt) Szablon do oceny dla każdego żelu (membrany) zapewnia pewną ocenę pasm Brak efektu uśmiechu p 17 p 25, Osp C p 21/22 p 18 Linia pozycji

33 Układ prążków, a faza boreliozy Pacjent 1 (Erythema migrans, świeże zakażenie) w klasie IgM tylko prążek Osp C pozytywny Pacjent 2 (Arthritis, późna faza boreliozy) w klasie IgG liczne pasma Osp C negatywne (marker wczesnej fazy)!

34 Ocena Western Blot: EUROLineScan

35 Pacjent 1: Erythema migrans, świeża borelioza IgM Western Blot: - Osp C pozytywny

36 Pacjent 2: Arthritis, późne stadium borreliozy IgG Western Blot: - liczne specyficzne i niespecyficzne pasma pozytywne - Osp C negatywne!

37 Borrelia burgdorferi Western Blot IgM Surowice pacjentów ze świeżą boreliozą (CDC) OspC

38 Borrelia burgdorferi Western Blot IgG Surowice zdrowych dawców krwi p41 flagelina pozytywna surowica kontrolna

39 Western Blot: odsetek potwierdzenia pozytywnych wyników testu ELISA Borrelia burgdorferi 63 pacjentów z podejrzeniem boreliozy i 27 zdrowych ochotników 63 pacjentów z ELISA podejrzeniem boreliozy i 27 ELISA poz neg zdrowych ochotników poz neg WB Bb (IgG) poz 27 0 poz 12 0 gran 11 1 WB Bb (IgM) gran 2 1 neg 8 43 neg 0 75 Odsetek potwierdzeń testu ELISA: IgG 83%, IgM 100%

40 Podsumowanie: zalety strategii dwuetapowej W USA na początku lat 90 dwuetapowe badania uporządkowały chaotyczną diagnostykę boreliozy Układ pasm zależy od fazy choroby i jest istotny diagnostycznie Algorytm postępowania ma wysoką czułość i swoistość (poza przypadkami wczesnej boreliozy) Blot daje swoistość. Zgodnie z danymi CDC spadek swoistości testów serologicznych o 1 % prowadzi do fałszywie pozytywnych wyników

41 Chronologia odkrycia VlsE Zmienność antygenowa białek powierzchniowych jest jednym z najważniejszych mechanizmów ucieczki patogenów przed odpowiedzią immunologiczną W 1985 Plasterk opisał tzw. variable major proteins (Vmp) Borrelia hermsii (nie jest patogenna dla człowieka), które pozwalają na przełączanie różnych serotypów W 1997 Zhang zidentyfikował tzw. vmp like sequence (vls) u B.burgdorferi Lokus vls B. burgdorferi wykazuje podobieństwo sekwencji i sposobu rekombinacji z układem vmp B. hermsii Białko będące produktem ekspresji locus vls Borrelia burgdorferi nazywane jest VlsE Variable major protein-like sequence, Expressed

42 Co to jest VlsE i jaką spełnia funkcję? VlsE jest białkiem powierzchniowym Borrelia, którego ekspresja zachodzi tylko in vivo! Stale zachodząca rekombinacja VlsE chroni bakterię przed atakiem układu immunologicznego

43 Struktura krystalograficzna VlsE Christoph Eicken et.al. Crystal Structure of Lyme Disease Variable Surface Antigen VlsE of Borrelia burgdorferi*. The Journal of Biological Chemistry, 14: , 2002

44 Borrelia EUROLINE -WB klasyczny Western Blot Anty-Borrelia + chip zawierający : VlsE = Borrelia EUROLINE-WB

45 Western Blot z natywnym antygenem Borrelia i rekombinantem VlsE Variable major protein like sequence Expressed VlsE Cel: wysoka czułość i łatwy odczyt Western Blot z pełnym ekstraktem (wyższa czułość) plus oczyszczony antygen (łatwa ocena) Najlepsze rezultaty daje antygen VlsE (zastępuje wszystkie inne)

46 Borrelia EUROLINE-WB Szybka ocena IgG VlsE IgM Osp C Ocena innych specyficznych pasm w przypadkach wątpliwych

47 Borrelia EUROLINE-WB - ocena BADANIE IgM IgG Pasmo OspC pozytywne VlsE i OspC negatywne Pasmo VlsE pozytywne Dodatni wynik anty-borrelia IgM Ocena innych pasm Dodatni wynik anty-borrelia IgG

48 Prewalencja przeciwciał anty-vlse Prof. Norris, University of Texas, Houston VlsE ELISA IgG poz (%) Faza ostra EM: 2-4 dni (20) 30 EM po leczeniu (20) 45 pierwotnie rozsiana (9) 78 neuroborelioza (13) 100 Lyme Arthritis (14) 93 zdrowi (48) 2

49 VlsE: badania centrum referencyjnego J Clin Microbiol 2003 Mar;41(3): Schulte-Spechtel U, Lehnert G, Liegl G, Fingerle V, Heimerl C, Johnson BJ, Wilske B. Deutsches Referenzzentrum für Borrelien Pacjenci z neuroboreliozą (n=36) i zdrowi (n=67) Antygen czułość [%] VlsE 86.1 Western Blot z pełnym antygenem 63,8 Rekombinowane antygeny 52,7

50 Wzrost czułości dzięki VlsE EUROIMMUN: Pacjenci z podejrzeniem choroby z Lyme IgG B. afzelii IgG Westernblot Poz. Gran. Neg. Poz VlsE Gran Neg Meyer, W. et al., 32. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Rheumatologie (Frankfurt/Main, September 2003) Wzrost czułości o 12% przy zachowanej specyficzności

51 EUROLINE-WB Borrelia Pełen ekstrakt B. afzelii (pełne spektrum antygenowe) wysoka czułość pozwala na identyfikacje reakcji atypowych VlsE jest najważniejszym antygenem rekombinowanym, specyficznym dla gatunku VlsE jest niezależnym markerem o najwyższej czułości

52 EUROLINE-WB Borrelia Jakość zgodna z zaleceniami Niemieckiego Towarzystwa Higieny i Mikrobiologii Szybka ocena IgG i IgM

53 EUROLINE-WB Borrelia Możliwość oceny elektronicznej, archiwizacji i wydruku wyniku za pomocą programu EuroLineScan

54 Testy EUROLINE: Antygeny rekombinowane

55 Antygeny natywne czy rekombinowane? Antygeny natywne Wysoka czułość i swoistość (pełen ekstrakt zawiera wszystkie antygeny, dlatego można wykrywać więcej istotnych przeciwciał) + VlsE - wzrost czułości przy zachowaniu wysokiej swoistości Często wyniki graniczne z powodu mniej swoistych pasm jak p30, p31 Trudność w różnicowaniu swoistych i nieswoistych pasm z uwagi na bliskie położenie ZALETY Antygeny rekombinowane Białka różnych gatunków mogą być wykrywane jednocześnie Łatwy odczyt Prosta produkcja Lepsza standaryzacja i powtarzalność WADY Czułość uważana za niższą niż natywnych antygenów Trudny wybór kilku najważniejszych białek: czułych, swoistych, stabilnych i możliwych do produkcji

56 EUROLINE-WB EUROLINE EUROIMMUN jest ekspertem w produkcji testów typu LINE BLOT Przykłady: HEp-2 EUROLINE-WB ANA EUROLINE Liver EUROLINE-WB EUROLINE Autoimmune liver Neuronal EUROLINE-WB EUROLINE Neuronal Antigens EBV Western Blot EBV EUROLINE Borrelia EUROLINE-WB EUROLINE Borrelia

57 Powstanie EUROLINE Borrelia Synteza 68 rekombinowanych antygenów Borrelia (biologia molekularna/ biochemia) Oczyszczanie natywnych antygenów i lipidów Borrelia Wycinanie pasm z klasycznego Westernblot (technika inżynieryjna) Opłaszczanie antygenami membran EUROLINE, optymalizacja warunków, ocena czułości i swoistości, analiza ROC, wybór najważniejszych antygenów Walidacja wybranych antygenów Walidacja programu EUROLineScan

58 EUROLINE Borrelia: wybór antygenów rekombinowanych BB_N38 BB_P38 BB_A36 BB_Q03 BB_A34 BB_A04 BB_A64 BB_H32 BB_K32 BB_K53 gpe BB_I42 LPA/B MlpA MlpD LA-7 ErpD BB_A66 ErpM MlpH ErpX BB_0323 VlsE Bg VlsE Ba MlpI MlpG MlpC Preselekcja, testy stabilności LA-7 VlsE Bg VlsE Ba BB_N38 BB_P8 BB_A36 BB_Q03 BB_A34 BB_A64 BB_K32 BB_K53 BB_I42 Wysoka czułość i swoistość VlsE Bg VlsE Ba BB_P38 BB_N38 BB_Q03 BB_K53 BB_A34

59 EUROLINE Borrelia: przygotowanie natywnych antygenów Borrelia Gram-ujemna błona Borrelia Lipidy Borrelia afzelii, Borrelia burgdorferi Antygeny z wysoką swoistością czułością Natywne OspC Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Borrelia burgdorferi Wewn. Zewn.

60 EUROLINE Borrelia wycinanie pasm antygenowych z Western Blot p39/p41 plotter OspC Program Autosketch

61 EUROLINE Borrelia-IgG Wysokospecyficzne Markery późnego stadium Nowe antygeny rekombinowane OspC-adv (dimer)!!! Swoiste rekombinowane antygeny VlsE Ba VlsE Borrelia afzelii VlsE Bb VlsE Borrelia burgdorferi VlsE Ba VlsE Borrelia garinii Swoiste natywne antygeny Lipid Ba Lipidy Borrelia afzelii Lipid Bb Lipidy Borrelia burgdorferi Antygeny rekombinowane Swoiste rekombinowane antygeny p18, p19, p20, p21, p58 Linie kontrolne dla wszystkich etapów inkunacji Nowe rekombinowane antygeny p39, p41, p83 OspC-adv (advanced) rekombinowany dimer

62 Nowość OspC-adv dimer Nowy rekombinowany antygen OspC-adv (dimer) OspC-adv (dimmer) zapewnia o 30% większą specyficzność w porównaniu z konwencjonalnym OspC (monomer) przy zachowaniu tej samej czułości Rekombinowane białko stworzone metodami inżynierii molekularnej przez naukowców z EUROIMMUN AG (opatentowane)

63 EUROLINE Borrelia-IgG: czułość i swoistość EUROLINE Borrelia-IgG Przeciwciała klasy IgG czułość [%] swoistość [%] VlsE Ba 65,5 98,6 VlsE Bb 88,5 98,6 VlsE Bg 67,6 95,3 Lipid Ba 25,1 100,0 Lipid Bb 25,1 99,6 p83 53,7 95,3 Analiza ROC, ocena 617 surowic pochodzących od różnych grup pacjentów: podejrzenie boreliozy, klinicznie potwierdzona borelioza, grupa kontrolna (zdrowi dawcy krwi, kobiety ciężarne, inne zakażenia)

64 EUROLINE Borrelia-IgG: czułość i swoistość EUROLINE Borrelia-IgG Przeciwciała klasy IgG czułość [%] swoistość [%] p39 61,3 98,6 OspC 48,7 95,7 p58 (BB_A34) 20,7 97,5 p21 (BB_K53) 8,9 99,3 p20 (BB_Q03) 7,1 100,0 p19 (BB_N38) 9,1 99,3 p18 (BB_P38) 22,4 99,3 Analiza ROC, ocena 617 surowic pochodzących od różnych grup pacjentów: podejrzenie boreliozy, klinicznie potwierdzona borelioza, grupa kontrolna (zdrowi dawcy krwi, kobiety ciężarne, inne zakażenia)

65 EUROLINE Borrelia-IgM Wysokospecyficzny antygen rekombinowany Nowe antygeny rekombinowane Wysokospecyficzne antygeny natywne Natywne antygeny OspC: Borrelia afzelii Borrelia burgdorferi Borrelia garinii Nowe antygeny rekombinowane: p41, p39 Linie kontrolne dla wszystkich etapów inkunacji

66 EUROLINE Borrelia-IgM: czułość i swoistość EUROLINE Borrelia-IgM Przeciwciała klasy IgM czułość [%] swoistość[%] VlsE Bb 4,9 99,4 p39 15,9 99,0 OspC nativ Ba 88,2 99,0 OspC nativ Bb 77,1 99,2 OspC nativ Bg 84,1 96,8 Analiza ROC, 644 surowice pochodzące od różnych grup pacjentów

67 EUROLINE Borrelia-IgM advanced NOWOŚĆ Wysokospecyficzny antygen rekombinowany Nowe antygeny rekombinowane Wysokospecyficzne antygeny rekombinowane OspC advanced (dimer) z czterech genogatunków Borrelia Rekombinowane antygeny OspC-adv: Borrelia afzelii Borrelia burgdorferi Borrelia garinii Borrelia spielmanii Nowe antygeny rekombinowane: p41, p39 Linie kontrolne dla wszystkich etapów inkunacji

68 EUROLINE Borrelia: EUROLineScan IgG IgM

69 EUROLINE Borrelia: linie kontrolne IgG IgM Linie kontrolne

70 Podsumowanie

71 Podsumowanie: EUROIMMUN zgodnie ze standardami Test skryningowy IIFT: technologia BIOCHIP ELISA: pełen ekstrakt Borrelia + VlsE Wynik pozytywny lub wątpliwy Test potwierdzający Western Blot Western Blot EUROLINE EUROLINE wykluczenie reakcji niespecyficznych

72 Podsumowanie: Testy skryningowe

73 Podsumowanie: Testy potwierdzające IgG i IgM Testy Western Blot- EUROLINE

74 Podsumowanie: Testy potwierdzające IgG IgM Testy EUROLINE

75 Podsumowanie: Ocena elektroniczna

76 Dziękuję za uwagę