Key words: etoposide, antioxidant enzyme activities, malondialdehyde,

Streszczenie Tworzenie reaktywnych form tlenu (RFT) w komórkach nowotworowych występuje podczas ekspozycji na leki przeciwnowotworowe takie jak: etopozyd, doksorubicyna, holoksan. Hodowlę prowadzono na komórkach ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45 w warunkach standardowych. Komórki traktowano dwoma stężeniami etopozydu: 20 μg/ml medium i 200 μg/ml medium. Grupę kontrolną stanowiły komórki nie zawierające w medium hodowlanym leku cytostatycznego. Medium zbierano po 24 godzinach od podania preparatu, wirowano i w supernatantach oznaczano aktywności badanych enzymów antyoksydacyjnych: mangano- zależnej (MnSOD) i cynkowo-miedziowej (Cu/ZnSOD) dysmutazy ponadtlenkowej, peroksydazy glutationu (GSH-Px), reduktazy glutationu (GR), katalazy (CAT) oraz stężenie dialdehydu malonowego (MDA). Aktywność enzymów antyoksydacyjnych (MnSOD, CuZnSOD, CAT, GSH-Px) uległa podwyższeniu po 24 godzinach stymulacji etopozydem zależnie od użytej dawki leku. Aktywność GR uległa obniżeniu w mediach hodowlanych komórek linii Me45 stymulowanych etopozydem w porównaniu do grupy kontrolnej. Etopozyd w stężeniu 20 μg/ml powoduje obniżenie stężenia MDA w mediach hodowlanych komórek linii Me45. Etopozyd doprowadza do zwiększenia aktywności enzymów antyoksydacyjnych (MnSOD, Cu/ZnSOD, CAT, GSH-Px) i zapobiega procesowi peroksydacji lipidów w mediach hodowlanych komórek linii Me45. Etopozyd obniża aktywność reduktazy glutationu (GR) w mediach hodowlanych ludzkich komórek czerniaka złośliwego linii Me45. Słowa kluczowe: etopozyd, enzymy antyoksydacyjne, dialdehyd malonowy, peroksydacja lipidów Abstract Reactive oxygen species (ROS) production in cancer cells usually occurs following anticancer drug exposure such as: etoposide, doxorubicin and holoxan treatment. The culture of human melanoma Me45 cell line was performed in standard conditions. The colonies were treated with two concentrations of etoposide: 20 μg/ml and 200 μg/ml of the culture medium. The control group were colonies without a cytostatic in the culture medium. The medium was collected at 24 hours from addition of the preparation and used for determination of activity in the supernatants of the following antioxidative enzymes: manganese dependent (MnSOD) and copper and zinc containing (Cu/ ZnSOD) superoxide dismutase, glutathione peroxidise (GSH-Px), glutathione reductase (GR), catalase (CAT) as well as the concentration of the malonate dialdehyde (MDA). Following etoposide treatment, activity of the antioxidant enzymes (SOD isoenzymes, CAT, GSH-Px) is increased in an dose - dependent manner compared with the untreated group. GR media activity was significant decreased in both etoposide treated group when compared to the control. Etoposide treatment in concentration of 20 μg/ ml decreased level of MDA concentration in Me45 media cells. Etoposide leading to an increase antioxidative enzyme activities (MnSOD, CuZn/SOD, CAT, GSH-Px) and prevent to lipid peroxidation in Me45 media cells. Etoposide leading to a decrease activity of glutathione reductase (GR) in Me45 media cells. Key words: etoposide, antioxidant enzyme activities, malondialdehyde, lipid peroxidation

Wstęp Leki cytostatyczne takie jak: 5-fluorouracyl, pochodne platyny, trójtlenek arsenu, doksorubicyna, etopozyd a także holoksan indukują powstawanie reaktywnych form tlenu (RFT) w komórkach nowotworowych poddanych chemioterapii [1]. Etopozyd jest lekiem cytostatycznym, półsyntetyczną pochodną podofilotoksyny, mechanizm jego działania nie jest do końca poznany, wykazuje działanie uszkadzające względem jadrowego DNA. Leki z grup aminoakrydyn, antracyklin i podofilotoksyn oddziałują prawdopodobnie z kompleksami rozszczepialnymi w DNA. Kompleksy rozszczepialne (z ang. cleavable complexes) tworzone są przez kowalencyjne związanie DNA i topoizmerazy II. Leki te stabilizują kompleksy rozszczepialne uniemożliwiając prawidłowe funkcjonowanie topoizomerazy II, skutkiem czego jest powstawanie uszkodzeń w DNA. Ubocznym działaniem leków cytostatycznych w tym etopozydu jest powstający stres oksydacyjny w komórkach nowotworowych generowany przez powstające reaktywne formy tlenu [2]. Głównym źródłem reaktywnych form tlenu są mitochondria, gdzie powstają podczas procesu oddychania komórkowego, zarówno w komórkach prawidłowych jak i w komórkach nowotworowych in vivo oraz in vitro. Reaktywne formy tlenu ulegają detoksyfikacji za pomocą enzymów antyoksydacyjnych takich jak: izoenzymy dysmutazy ponadtlenkowej SOD, peroksydazy glutationowej (GSH-Px), katalazy (CAT). Reaktywne formy tlenu są wysoce toksyczne dla komórek; przyczyniają się do utleniania zasad azotowych w DNA jądrowym i mitochondrialnym, mogą także oddziaływać chemicznie i inaktywować białka czy fosfolipidy komórkowe [3]. Alexandre i wsp., na podstawie swoich badań wysunęli trzy hipotezy mówiące o prawdopodobnej roli reaktywnych form tlenu w nowotworach [1]. Pierwsza hipoteza zakłada, że powstające reaktywne formy tlenu w komórkach są prekursorami procesu uszkodzenia tkanek; współistnieją tu w nierównowadze obok procesu tworzenia reaktywnych form tlenu, procesy detoksyfikacji i naprawy uszkodzeń oksydacyjnych. Druga hipoteza zakłada, że powstające reaktywne formy tlenu stanowią przekaźnik w transdukcji sygnału prowadzącego do regulacji szybkości proliferacji poprzez oddziaływania na geny cyklu komórkowego. Niski wewnątrzkomórkowy poziom nadtlenku wodoru (H 2 ) będący wynikiem wysokiej aktywności enzymów katalazy, peroksydazy glutationu, zwiększa szybkość proliferacji komórek nowotworowych in vitro. Przeciwnie wysokie stężenie H 2 w mitochondriach, zaburza metabolizm komórek. Trzecia hipoteza zakłada, że powstające reaktywne formy tlenu są drugorzędowym markerem śmierci komórek ulegających apoptozie lub nekrozie w wyniku toksycznego działania substancji chemicznej [1]. Wskaźnikiem stresu oksydacyjnego jest wzrost lub obniżenie aktywności enzymatycznej bariery antyoksydacyjnej; izoenzymy dysmutazy ponadtlenkowej, MnSOD, CuZn/SOD, katalazy (CAT) oraz peroksydazy glutationu (GSH-Px). Izoenzymy dysmutazy ponadtlenkowej, katalizuje reakcję dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego do nadtlenku wodoru i tym samym uniemożliwia powstawanie innych toksycznych reaktywnych form tlenu między innymi., rodnika hydroksylowego (OH* - ). Mangano - zależna (MnSOD) oraz miedziowo - cynkowa (Cu/ZnSOD) dysmutaza ponadtlenkowa, jak również zewnątrzkomórkowa izoforma dysmutazy ponadtlenkowej (EcSOD) wykazują ścisłą kompartmentację w komórce redukując stres oksydacyjny w różnych przedziałach subkomórkowych [4, 5]. Katalaza (CAT) jest enzymem antyoksydacyjnym, katalizującym reakcję dysproporcjonowania nadtlenku wodoru. Reakcja przebiega w dwóch etapach z udziałem jonów żelaza (II). Katalaza organizmów eukariotycznych jest homotetramerem o masie od 220 do 350 kda. Każda podjednostka posiada układ hemowy z centralnie położonym atomem żelaza (II), związanym z miejscem aktywnym wiązaniami koordynacyjnymi, z enzymem połączone są także cząsteczki NADPH + H +. Miejsce występowania katalazy to peroksysomy, ER, mitochondria komórek wątroby, nerek, erytrocytów czy komórek szpiku [4, 6]. Peroksydazy glutationu (GSH-Px), stanowią pierwszą i drugą linię obrony przed reaktywnymi formami tlenu. Białka te wykazują zdolność redukcji nadtlenków nieorganicznych (H 2 ) oraz nadtlenków organicznych (ROOH) z wytworzeniem kwasu selenowego, jako produktu pośredniego. Peroksydazy glutationowe (GSH-Px); selenopeptydazy posiadają w centrum aktywnym selen pod postacią selenocysteiny, występują w kilku izoformach w różnych kompartymentach i rodzajach komórek. Katalizują reakcję pomiędzy nadtlenkiem wodoru a glutationem. W wyniku reakcji redukcji nadtlenku wodoru, powstaje utleniona forma glutationu - disulfid glutationu (GSSG), wykazujący działanie toksyczne względem białek komórkowych.w odtworzeniu zredukowanego glutationu pomaga enzym reduktaza glutationu (GR), przy współudziale NAD- PH + H +. Oba enzymy GSH-Px oraz GR wykazują działanie kompensacyjne i stanowią układ enzymatyczny usuwający nadtlenek wodoru z komórek [4, 7]. Peroksydacja lipidów jest procesem utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych obecnych w lipidach. Peroksydacji podlegają reszty wielonienasyconych kwasów tłuszczowych wchodzących w skład fosfolipidów błon komórkowych. Jednym ze związków powstających w wolnorodnikowym procesie peroksydacji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych jest dialdehyd malonowy MDA (z ang. malondialdehyde). MDA jest związkiem bardzo reaktywnym względem białek, może dezaktywować enzymy komórkowe. Wykazano, że reaguje także z zasadami azotowymi kwasów nukleinowych [8]. Znaczenie w patogenezie choroby nowotworowej odgrywają szczególnie dwa izoenzymy SOD: mangano - zależna (MnSOD) oraz cynkowo - miedziowa (Cu/ZnSOD) dysmutaza ponadtlenkowa. Aktywność enzymów antyoksydacyjnych MnSOD, CuZnSOD CAT, GSH-Px w komórkach nowotworowych jest zmienna. Wyniki licznych prac wskazują, że zmiany aktywności izoenzymów SOD występują w wielu typach nowotworów: rak trzustki [9], gruczołu krokowego [10], nowotwory żołądka [11] oraz jamy ustnej [12] i przewodu pokarmowego [13], na różnych etapach zaawansowania choroby nowotworowej: rak in situ, przerzuty [14, 12].

Komórki nowotworowe wskutek podwyższonej aktywności enzymów antyoksydacyjnych mogą skutecznie adaptować się do stresu oksydacyjnego in vitro oraz in vivo [15]. Wzrost aktywności izoenzymów dysmutazy ponadtlenkowej, peroksydazy glutationu oraz katalazy w komórkach nowotworowych może indukować chemooporność komórek nowotworowych, warunkującą powstawanie populacji komórek opornych na działanie użytego leku cytostatycznego [16-19]. Celem pracy jest określenie wpływu różnych stężeń etopozydu na aktywność enzymów antyoksydacyjnych (MnSOD, CuZnSOD, CAT, GSH-Px, GR) oraz stężenie MDA (marker procesu peroksydacji lipidów) w mediach hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45 in vitro. Materiał i metody Hodowla komórkowa Po odbankowaniu komórek z ciekłego azotu, komórki zostały namnożone w butelkach hodowlanych o powierzchni wzrostowej 25 cm 2 (T25). Po namnożeniu komórki zostały wybarwione 0,25 % roztworem błękitu trypanu i policzone metodą bezpośrednią w komorze Bürkera (1 mm 2 ) w celu określenia ilości komórek żywych i martwych. Procent martwych komórek wynosił mniej niż 5 %. Hodowla komórek czerniaka złośliwego Me45 prowadzona była w standardowych warunkach w 37 ºC oraz 5 % nasyceniem C. Komórki hodowane były w medium DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium) ze zwiększoną zawartością glukozy 4,5 g/l (z dodatkiem 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS GOLD) pochodzącej z firmy (Sigma-Aldrich, St Louis. Mo). Do medium hodowlanego z surowicą dodano antybiotyki: penicylina (100 U/mL), streptomycyna (100 μg/ml) oraz amfoterycyna B (200000 jednostek/l). Komórki czerniaka złośliwego linii Me45 zostały umieszczone w butelkach hodowlanych (T25) firmy Sarsted w ilości 1x10 6. Komórki linii Me45 są komórkami adherentnymi i w czasie wzrostu przylegają do dna butelki. Pasażu komórek adherentach dokonywano przed uzyskaniem całkowitej monowarstwy na dnie butelki (80 % konfluencji), w czasie wykładniczej fazy wzrostu. Na początku usuwano pożywkę z naczynia hodowlanego, za pomocą sterylnych pipet. Następnie hodowle zalewano 1 ml roztworu trypsyny, w celu odklejenia komórek od dna butelki hodowlanej i inkubowano w cieplarce ok. 3 min. Po inkubacji zalewano próbki 3 ml medium z surowicą, w celu inaktywacji trypsyny. Następnie zawiesinę komórek w medium rozdzielano w zależności od potrzeb i przenoszono do nowych butelek hodowlanych, dodając odpowiednią ilość świeżego medium. Przebieg doświadczenia Komórki czerniaka złośliwego linii Me45 uzyskujące 90 % konfluencji, traktowano dwoma stężeniami etopozydu: 20 μg/ml oraz 200 μg/ml medium przez okres 24 godzin (wykonano 6 powtórzeń). Grupę kontrolną stanowiły komórki nie zawierające w medium hodowlanym etopozydu (wykonano 6 powtórzeń). Medium hodowlane zbierano po 24 godzinach po podaniu etopozydu a następnie wirowano 2000 rpm/ 5 min. Po wirowaniu pobierano supernatant i przystępowano do oznaczenia aktywności enzymów antyoksydacyjnych oraz stężenia MDA. Podział na grupy badawcze K - kontrola, komórki czerniaka złośliwego linii Me45 nie traktowane etopozydem B1 - komórki czerniaka złośliwego linii Me45 stymulowane etopozydem w stężeniu 20 μg/ml B2 - komórki czerniaka złośliwego linii Me45 stymulowane etopozydem w stężeniu 200 μg/ml Po wirowaniu medium hodowlanego w supernatantach oznaczono 1. Aktywność całkowitą dysmutazy ponadtlenkowej (SOD). 2. Aktywność mangano- zależnej dysmutazy ponadtlenkowej (MnSOD). 3. Aktywność cynkowo-miedziowej dysmutazy ponadtlenkowej (Cu/ZnSOD). 4. Aktywność peroksydazy glutationu (GSH-Px). 5. Aktywność reduktazy glutationu (GR). 6. Aktywność katalazy (CAT). 7. Stężenie dialdehydu malonowego (MDA), jako markera peroksydacji lipidów. Aktywność izoenzymów dysmutazy ponadtlenkowej została oznaczona wg metody Oyanagui [20], zmodyfikowanej w Katedrze i Zakładzie Biochemii Ogólnej w Zabrzu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach wykorzystując różną podatność enzymu (MnSOD) na inhibicję cyjankiem potasu (KCN) i została wyrażona w jednostkach: nitrowych/ml medium hodowlanego [NU/ml]. Jednostka nitrowa jest to taka ilość enzymu, która rozkłada w jednostce czasu 50 % ilości powstającego anionorodnika ponadtlenkowego w warunkach metody. Metoda ta jest w pełni swoista dla dysmutazy ponadtlenkowej. Aktywność Cu/ZnSOD została oszacowana zgodnie ze wzorem: Aktywność Cu/ ZnSOD = aktywność całkowita SOD aktywność MnSOD Aktywność peroksydazy glutationu (GSH-Px) oraz reduktazy glutationu (GR) została oznaczona wg metody Paglia i Valentine a [21]. Zasadą metody jest reakcja zredukowanego glutationu (GSH), w obecności peroksydazy, z ponadtlenkiem t-butylu. Aktywność GSH-Px została wyrażona w jednostkach międzynarodowych/ l [IU/l]. Aktywność katalazy (CAT) oznaczono w oparciu o metodę kinetyczną Aebie go [22] i wyrażono w jednostkach [kiu/l]. Stężenie dialdehydu malonowego oznaczano wg metody Ohkawy i wsp. [23], wykorzystując jego reakcję z kwasem tiobarbiturowym i wyrażono w μmolach MDA/ml medium hodowlanego. Pomiarów dokonano przy długości fali 515nm (absorbancja) i 522nm (emisja). Stężenie MDA odczytano z krzywej standardowej, stosując jako standard 1,1,3,3 tetraetoksypropan i zostało wyrażone w jednostkach [μmol /ml]. Analiza statystyczna Dane zgromadzono w arkuszu kalkulacyjnym Excel 2007 firmy Microsoft.

Po przeprowadzeniu wstępnej kalkulacji dane przenoszono do bazy danych programu Statistica 7.0 firmy StatSoft, przy pomocy którego przeprowadzono analizę. Zgodność rozkładu zmiennych ciągłych z rozkładem normalnym Gaussa weryfikowano testem zgodności Shapiro-Wilka. Analizę porównawczą dla zmiennych ciągłych realizowano za pomocą testu parametrycznego t-studenta. Wyniki badań przedstawiono, jako średnie arytmetyczne ± SEM (błąd standardowy). Za znamienne statystycznie przyjęto zmiany przy poziomie istotności p<0,05 oraz p<0,001. Wyniki Po stymulacji komórek czerniaka złośliwego linii Me45 etopozydem w stężeniu 20 μg/ml i 200 μg/ml (po 24 godz.) zaobserwowano ponad 2 krotne zwiększenie aktywności całkowitej enzymu dysmutazy ponadtlenkowej SOD w mediach hodowlanych komórek linii Me45 w stosunku do aktywności tego enzymu w grupie kontrolnej, odpowiednio; 11,16 ± 0,34 [NU/ml], 12,04 ± 1,1 [NU/ml] vs 4,85 ± 0,16 [NU/ml] (p<0,001). Zaobserwowano niewielki wzrost aktywności manganozależnej dysmutazy ponadtlenkowej MnSOD w mediach hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45 traktowanych etopozydem w stężeniu 20 μg/ml przez okres 24 godzin względem aktywności tego izoenzymu w grupie kontrolnej, odpowiednio; 4,35 ± 0,22 [NU/ml] vs 3,42 ± 0,12 [NU/ml], (p<0,05). Ponad 2 - krotny wzrost aktywności tego izoenzymu, zaobserwowano w mediach hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45 stymulowanych etopozydem w stężeniu 200 μg/ ml przez okres 24 godzin w stosunku do grupy kontrolnej, odpowiednio; 7,12 ± 0,56 [NU/ml] vs 3,42 ± 0,12 [NU/ml], (p<0,05). Ponadto zaobserwowano wzrost aktywności izoenzymu; cynkowo miedziowej dysmutazy ponadtlenkowej (Cu/ZnSOD) oraz katalazy (CAT) w mediach hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45 traktowanych dwoma stężeniami etopozydu przez okres 24 godzin w stosunku do aktywności tych enzymów w grupie kontrolnej, odpowiednio; (Cu/ ZnSOD; 6,8 ± 0,49 [NU/ml], 4,92 ± 0,88 [NU/ml] vs 1,43 ± 0,27 [NU/ ml], p<0,001), (CAT; 30,49 ± 3,15 [kiu/l], 26,33 ± 2,25 [kiu/l] vs 7,55 ± 0,89 [kiu/l], p< 0,001). Zaobserwowano także ponad 4,5 - krotny wzrost aktywności peroksydazy glutationu (GSH-Px) po 24 godzinnej stymulacji komórek czerniaka złośliwego linii Me45 etopozydem w stężeniu 20 μg/ml w stosunku do aktywności tego enzymu w medium hodowlanym komórek grupy kontrolnej, odpowiednio; 450,45 ± 34 [IU/l] vs 93,51 ± 8,96 [IU/l], (p<0,001). W przypadku zastosowania 10 - krotnie wyższego stężenia etopozydu w hodowli komórek czerniaka złośliwego linii Me45 po 24 godzinach zaobserwowano tylko nieznaczny wzrost aktywności tego enzymu w stosunku do aktywności GSH -Px w medium hodowlanym komórek grupy kontrolnej, odpowiednio; 127,4 ± 9,45 [IU/l] vs 93,51 ± 8,96 [IU/l], (p< 0,001). W niniejszej pracy zaobserwowano, 2 krotnie mniejszą aktywność reduktazy glutationu w medium hodowlanym komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45 stymulowanych etopozydem w stężeniu 20 μg/ml, 200 μg/ ml w stosunku do aktywności GR w grupie kontrolnej, odpowiednio; 5,04 ± 0,15 [IU/l], 4,22 ± 0,22 [IU/l] vs 9,17 ± 0,91 [IU/l], (p<0,001). Ponadto, zaobserwowano zmniejszenie stężenia MDA w mediach hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45 stymulowanych etopozydem w stężeniu 20 μg/ml w stosunku do grupy kontrolnej, odpowiednio; 0,92 ± 0,12 [μmol/ml] vs 1,49 ± 0,41 [μmol/ml], (p<0,05). Wykazano brak znamienności statystycznej na poziomie α=0.05 w grupie komórek stymulowanych etopozydem w stężeniu 200 μg/ml względem kontroli (1,40 ± 0,31 [μmol/ ml] vs 1,49 ± 0,41 [μmol/ml]. Dyskusja Tworzenie RFT w komórkach nowotworowych, rozpoczyna się już w szóstej godzinie po ekspozycji na leki cytostatyczne takie jak: kampotecynę, vinblastynę, cisplatynę, paklitaksel, etopozyd, mechanizm prowadzący do generowania reaktywnych form tlenu w wyniku działania leków cytostatycznych pozostaje jednak nadal nieznany [1]. W niniejszej pracy zaobserwowano po 24 godzinach stymulacji etopozydem komórek ludzkiego czerniaka złośli- Ryc. 1. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na aktywność całkowitą enzymu dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w medium hodowlanym komórek linii Me45 (po 24h) wyrażona w [NU/ml]. Skróty: K - kontrola; B1- Etopozyd (20 μg/ ml); B2 - Etopozyd (200 μg/ml). Wartości średnie ± błąd standardowy (SEM); n=6; test t-studenta: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2. Fig. 1. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on total activity of superoxide dismutase (SOD) in human melanoma Me45 media cells (after 24 h) and expressed in [NU/ml]. Abbreviations: K- control group; B1- Etoposide (20 μg/ml); B2 - Etoposide (200 μg/ml). Mean values ± standard error (SEM); n=6; student s t-test: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2.

Ryc. 2. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na aktywność mangano - zależnej dysmutazy ponadtlenkowej (MnSOD) w medium hodowlanym komórek linii Me45 (po 24h) wyrażona w [NU/ml]. Skróty: K - kontrola; B1- Etopozyd (20 μg/ml); B2 - Etopozyd (200 μg/ml). Wartości średnie ± błąd standardowy (SEM); n=6; test t-studenta: * p<0.05 vs K, ^ p<0.05 vs B1, # p<0.05 vs B2. Fig. 2. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on activity of manganese dependent superoxide dismutase isoenzyme (MnSOD) in human melanoma Me45 media cells (after 24 h) and expressed in [NU/ml]. Abbreviations: K- control group; B1- Etoposide (20 μg/ml); B2 - Etoposide (200 μg/ml). Mean values ± standard error (SEM); n=6; student s t-test: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2. Ryc. 3. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na aktywność cynkowo - miedziowej dysmutazy ponadtlenkowej (Cu/ZnSOD) w medium hodowlanym komórek linii Me45 (po 24h) wyrażona w [NU/ml]. Skróty: K - kontrola; B1- Etopozyd (20 μg/ml); B2 - Etopozyd (200 μg/ml). Wartości średnie ± błąd standardowy (SEM); n=6; test t-studenta: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2. Fig. 3. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on activity of copper and zinc containing superoxide dismutase isoenzyme (CuZnSOD) in human melanoma Me45 media cells (after 24 h) and expressed in [NU/ml]. Abbreviations: K- control group; B1- Etoposide (20 μg/ml); B2 - Etoposide (200 μg/ ml). Mean values ± standard error (SEM); n=6; student s t-test: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2. wego linii Me45 znaczący wzrost aktywności enzymów antyoksydacyjnych (MnSOD, CuZnSOD, CAT, GSH-Px) zależny od użytego stężenia leku cytostatycznego. Uzyskany wzrost aktywności enzymów antyoksydacyjnych w hodowli z jednoczesnym obniżeniem intensywności peroksydacji lipidów w mediach hodowlanych najprawdopodobniej wynika z adaptacji komórek czerniaka złośliwego linii Me45 do stresu oksydacyjnego indukowanego przez lek cytostatyczny. W piśmiennictwie dostępna jest praca Polaniak i wsp. [24], w której autorzy porównywali aktywności izoenzymów SOD w mediach hodowlanych komórek mysiego raka płaskonabłonkowego linii AT478 traktowanych holoksanem. Holoksan jest lekiem cytostatycznym, generującym powstawanie RFT w komórkach poddanych terapii in vitro. W pracy tej zaobserwowano wzrost aktywności izoenzymu MnSOD w mediach hodowlanych komórek linii AT478 stymulowanych holoksanem w stężeniu 10 μg/ml oraz 40 μg/ ml przez okres 24 godzin, względem aktywności tego izoenzymu w grupie kontrolnej, odpowiednio; 9,2 NU/ml, 14,69 NU/ml vs 1,2 NU/ml. Jednocześnie zaobserwowano wzrost aktywności izoenzymu Cu/ZnSOD w mediach analizowanych komórek względem aktywności tego enzymu w grupie kontrolnej, odpowiednio; 3,7 NU/ml, 4,1 NU/ml vs 1,4 NU/ml [24]. W niniejszej pracy obserwujemy zróżnicowanie nasilenia aktywności izoenzymów SOD w zależności od użytego stężenia etopozydu w hodowli komórek linii Me45. Obydwa zastosowane stężenia etopozydu powodują większy wzrost aktywności izoenzymu Cu/ZnSOD w mediach komórek linii Me45 względem aktywności tego izoenzymu w mediach komórek linii AT478 poddanych terapii holoksanem opisanej w pracy [24]. W piśmiennictwie dostępnych jest zaledwie kilka prac [24, 27, 28], bezpośrednio analizujących zmiany aktywności enzymów antyoksydacyjnych w mediach hodowlanych komórek nowotworowych in vitro. Dostępne są wyniki badań innych autorów dotyczących wpływu nadekspresji genów kodujących izoenzymy SOD na progresję zmian nowotworowych in vitro oraz in vivo. Wzrost aktywności enzymów antyoksydacyjnych usuwających nadtlenek wodoru w komórkach nowotworowych (CAT oraz GSH-Px) wiąże się z indukcją procesu chemooporności na leki cytostatyczne [15].

Ryc.4. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na aktywność katalazy (CAT) w medium hodowlanym komórek linii Me45 (po 24h) wyrażona w [kiu/l]. Skróty: K - kontrola; B1- Etopozyd (20 μg/ml); B2 - Etopozyd (200 μg/ml). Wartości średnie ± błąd standardowy (SEM); n=6; test t-studenta: * p<0,001 vs K, ^ p<0.05 vs B1, # p<0.05 vs B2. Fig.4. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on activity of catalase (CAT) in human melanoma Me45 media cells (after 24 h) and expressed in [kiu/l]. Abbreviations: K- control group; B1- Etoposide (20 μg/ml); B2 - Etoposide (200 μg/ml). Mean values ± standard error (SEM); n=6; student s t-test: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2. Ryc.5. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na aktywność peroksydazy glutationu (GSH-Px) w medium hodowlanym komórek linii Me45 (po 24h) wyrażona w [IU/l]. Skróty: K - kontrola; B1- Etopozyd (20 μg/ml); B2 - Etopozyd (200 μg/ml). Wartości średnie ± błąd standardowy (SEM); n=6; test t-studenta: * p<0,001 vs K, ^ p<0,001 vs B1, # p<0,001 vs B2. Fig.5. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on activity of glutathione peroxidase (GSH-Px) in human melanoma Me45 media cells (after 24 h) and expressed in [IU/l]. Abbreviations: K- control group; B1- Etoposide (20 μg/ ml); B2 - Etoposide (200 μg/ml). Mean values ± standard error (SEM); n=6; student s t-test: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2. W niniejszej pracy etopozyd w stężeniu 20 μg/ml oraz 200 μg/ml powoduje blisko 4 - krotny wzrost aktywności CAT w mediach hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45. Etopozyd w stężeniu 20 μg/ml po 24 godzinach spowodował blisko 5 - krotny wzrost aktywność enzymu GSH-Px w mediach hodowlanych komórek względem nie traktowanej kontroli. 10-krotnie wyższe stężenie tego leku cytostatycznego skutkowało tylko nieznacznym wzrostem aktywności tego enzymu względem grupy kontrolnej. W pracach Dusre i wsp [17] oraz Samuels i wsp. [18]., wykazano wpływ aktywności enzymu GSH-Px w komórkach nowotworowych na indukcję procesu chemooporności komórek nowotworowych na leki cytostatyczne. Dusre i wsp. [17] zaobserwowali, że komórki raka piersi linii MCF-7 ADR wykazujące oporność względem mitomycyny C oraz adriamycyny posiadają 14 krotnie większą aktywność enzymu GSH-Px w porównaniu do komórek linii dzikiej. Stężenie mitomycyny C powodujące zahamowanie wzrostu 50 % komórek linii wielolekoopornej MCF-7 ADR w hodowli (IC 50 ) osiągało wartość 22,5 μmol względem stężenia 0,36 μmol tego leku cytostatycznego powodującego ten sam procent zahamowania wzrostu komórek raka piersi linii dzikiej [17]. W pracy Samuels i wsp. [18] wykazano różną cytotoksyczność doksorubicyny względem różnych linii komórek nowotworowych wywodzących się z tkanki łącznej. Komórki nowotworowe linii STSAR90 izolowane z ludzkich mięsaków były 6 krotnie mniej wrażliwe na apoptozę indukowaną przez doksorubicynę, względem komórek nowotworowych linii STSAR11. Traktowanie obydwu linii komórkowych doksorubicyną w stężeniu 100 μg/ml, spowodowało różną odpowiedź komórek na lek. Komórki linii STSAR90, wykazywały 6 - krotnie wyższą aktywność enzymu GSH-Px oraz 2 krotnie wyższe stężenie glutationu w komórkach poddanych terapii doksorubicyną. Wyższa aktywność enzymu GSH-Px w komórkach nowotworowych linii STSAR90 skutkowała większą opornością na apoptozę i nekrozę indukowaną przez ten lek cytostatyczny względem komórek nowotworowych linii STSAR11. Większa aktywność enzymu GSH-Px, skutkuje także obniżeniem stężenia wewnątrzkomórkowego H 2, tym samym zmniejszając

Ryc.6. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na aktywność reduktazy glutationu (GR) w medium hodowlanym komórek linii Me45 (po 24h) wyrażona w [IU/l]. Skróty: K - kontrola; B1- Etopozyd (20 μg/ml); B2 - Etopozyd (200 μg/ml). Wartości średnie ± błąd standardowy (SEM); n=6; test t-studenta: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2. Fig.6. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on activity of glutathione reductase (GR) in human melanoma Me45 media cells (after 24 h) and expressed in [IU/l]. Abbreviations: K- control group; B1- Etoposide (20 μg/ml); B2 - Etoposide (200 μg/ml). Mean values ± standard error (SEM); n=6; student s t-test: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2. Ryc.7. Wpływ różnych stężeń etopozydu (B1 - B2) na stężenie dialdehydu malonowego (MDA) w medium hodowlanym komórek linii Me45 (po 24h) wyrażone w [μmol/ml]. Skróty: K - kontrola; B1- Etopozyd (20 μg/ml); B2 - Etopozyd (200 μg/ml). Wartości średnie ± błąd standardowy (SEM); n=6; test t-studenta: * p<0.05 vs K, ^ p<0.05 vs B1, # p<0.05 vs B2. Fig.7. Influence of different concentration of etoposide (B1-B2) on malondialdehyde concentration (MDA) in human melanoma Me45 media cells (after 24 h) and expressed in [μmol/ml]. Abbreviations: K - control group; B1 - Etoposide (20 μg/ml); B2 - Etoposide (200 μg/ml). Mean values ± standard error (SEM); n=6; student s t-test: * p<0,001 vs K, ^ p<0,05 vs B1, # p<0,05 vs B2. intensywność tworzenia rodnika hydroksylowego (OH* - ) w cyklu Fentona w hodowli komórek nowotworowych linii STSAR90. Autorzy dodatkowo zwiększyli wrażliwość komórek nowotworowych linii STSAR90 na doksorubicynę podając do hodowli inhibitor biosyntezy glutationu, butioninosulfoksymine (BSO) [18]. Z powyższych obserwacji wynika, że wysoka aktywność enzymu GSH-Px w komórkach nowotworowych może być jednym z czynników warunkujących indukcję procesu oporności na leki cytostatyczne w hodowli in vitro. Kofaktorem enzymatycznym GSH -Px jest enzym reduktaza glutationu (GR), który współdziała z GSH-Px w odtworzeniu zredukowanego glutationu [7]. W niniejszej pracy uzyskaliśmy obniżenie aktywności GR w mediach hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka linii Me45 traktowanych etopozydem względem komórek grupy kontrolnej. Być może w skutek niższej aktywności GR w hodowli stężenie disulfidu glutationu (GSSG) wzrasta. GSSG jest ubocznym produktem reakcji enzymu GSH-Px z nadtlenkiem wodoru i może on reagować z grupami tiolowymi białek doprowadzając do ich dezaktywacji [4]. Niemniej jednak jak wynika z obserwacji dokonanych przez innych autorów indukcja oporności na leki cytostatyczne w komórkach nowotworowych może wynikać ze zwiększonej aktywności GSH-Px, GR, CAT oraz S-transferazy glutationu [25]. W niniejszej pracy wykazano, że jedynie etopozyd w stężeniu 20 μg/ ml powodował istotne statystycznie zmniejszenie intensywności procesu peroksydacji lipidów w mediach komórkowych linii Me45 in vitro. Obniżenie intensywności peroksydacji lipidów w komórkach linii Me45, oceniane poprzez obserwowany spadek stężenia MDA wynika z wysokiej aktywności GSH-Px w mediach hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45. Zależność pomiędzy aktywnością GSH-Px a stężeniem końcowym MDA wynika z faktu, że peroksydaza glutationu redukuje nie tylko nadtlenek wodoru (H 2 ), ale także nadtlenki organiczne (ROOH). Nadtlenek organiczny (ROOH) zostaje zredukowany do odpowiedniego alkoholu (ROH), stąd wysoka aktywność enzymu GSH-Px jest czynnikiem hamującym proces peroksydacji lipidów błonowych w komórkach [8]. W piśmiennictwie dostępne są prace dotyczące wpływu pola elektromagnetycznego o niskiej częstotliwości (ELF-

MF) w kombinacji z różnymi antyoksydantami: witaminą E [27] oraz melatoniną [28] na stężenie MDA w mediach hodowlanych komórek mysiego raka płaskonabłonkowego linii AT478. W obydwu cytowanych pracach wykazano, że 16 minutowa ekspozycja komórek nowotworowych linii AT478 na ELF-MF w kombinacji z antyoksydantem zwiększa aktywność enzymów antyoksydacyjnych oraz powoduje obniżenie stężenia MDA w mediach hodowlanych W pracy Polaniak i wsp. [27], wykazano obniżenie stężenia MDA w mediach hodowlanych komórek linii AT478 stymulowanych ELF-MF oraz witaminą E (10%) względem grupy kontrolnej, odpowiednio; 4,42 μmol MDA/ml vs 6,8 μmol MDA/ ml. Aktywność enzymu GSH-Px w mediach hodowlanych komórek linii AT478 po stymulacji ELF-MF oraz witaminą E w stosunku do kontroli wzrosła aż 9-krotnie [27]. Melatonina w stężeniu 10-5 M oraz 10-4 M w kombinacji z ELF-MF w tych samych warunkach doświadczalnych efektywniej obniżała stężenie MDA w mediach komórek linii AT478 w stosunku do nie traktowanej kontroli, odpowiednio; 1,64 μmol MDA/ ml, 3,65 μmol MDA/ml vs 6,79 μmol MDA/ ml [28]. Reasumując, w niniejszej pracy wykazaliśmy, że etopozyd zależnie od użytego stężenia powoduje zwiększenie aktywności enzymów antyoksydacyjnych za wyjątkiem GR, oraz obniża stężenie MDA w mediach hodowlanych komórek ludzkiego czerniaka złośliwego linii Me45. Ponieważ w piśmiennictwie istnieją doniesienia dotyczące zależności pomiędzy aktywnością enzymów antyoksydacyjnych komórek nowotworowych a procesem oporności na leki cytostatyczne, w dalszej kolejności należy sprawdzić możliwość zwiększania cytotoksyczności etopozydu w terapii czerniaka in vitro z użyciem inhibitorów enzymów antyoksydacyjnych. Konieczność poszukiwania alternatywnych, markerów rozwijającej się oporności na leki stosowane w terapii przeciwnowotworowej koresponduje z możliwością monitorowania aktywności enzymów antyoksydacyjnych w mediach hodowlanych komórek nowotworowych in vitro. Istnieją liczne doniesienia dotyczące prób zwiększenia skuteczności czy wrażliwości komórek nowotworowych na leki cytostatyczne w metodzie opartej na modulacji stanu oksydacyjnego opornych na chemioterapeutyki komórek nowotworowych (ROS mediated cancer therapy). Konieczność poszukiwania alternatywnych leków przeciwnowotworowych o niskiej toksyczności względem prawidłowych komórek jest ściśle uzasadniona. Podczas konwencjonalnych cykli chemioterapii, tworzą się w wyniku selekcji, klony komórek nowotworowych opornych na stosowane cytostatyki w skutek rozwoju oporności wielolekowej (MDR) [15]. Efferth i wsp. [26] wykazali skuteczność w eliminacji doksorubicyno - opornych komórek białaczkowych za pomocą leku przeciwmalarycznego (ART) Artesunate. Lek ten wywołuje apoptozę doksorubicyno - opornych komórek T białaczkowych, poprzez tworzenie i akumulacje RFT w mitochondriach. Zastosowanie silnego antyoksydantu (NAC) N - acetylocysteiny; prekursora glutationu, uniemożliwia tworzenie i akumulacje RFT i znosi toksyczny efekt ART względem komórek białaczkowych. Toksyczne, synergistyczne działanie (DOX) oraz (ART.) wynika z różnych mechanizmów generowania mitochondrialnego stresu oksydacyjnego w komórkach i może stanowić podstawę nad badaniami klinicznymi nad włączeniem ART, jako leku drugiego rzutu w białaczkach [26]. Wnioski 1. Etopozyd zwiększa aktywność enzymów antyoksydacyjnych (MnSOD, CuZnSOD, CAT, GSH-Px) w mediach hodowlanych komórek czerniaka złośliwego linii Me45 i zapobiega procesowi peroksydacji lipidów. 2. Etopozyd zmniejsza aktywność reduktazy glutationu (GR) w mediach hodowlanych ludzkich komórek czerniaka złośliwego linii Me45. Praca została wykonana w ramach badań statutowych (umowa KNW - 1-078/09), sfinansowana ze środków Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Piśmiennictwo 1. Alexandre J i wsp. Improvement of the therapeutic index of anticancer drugs by the superoxide dismutase mimic mangafodipir. J Natl Cancer Inst 2006; 98(4): 236-244. 2. Gupta A i wsp. Oxidative stress in non-small cell lung cancer patients after chemotherapy: association with treatment response. Respirology 2010; 15(2): 349-356. 3. Calabrese V, Cornelius C, Mancuso C, Lentile R, Stella AM, Butterfield DA. Redox homeostasis and cellular stress response in aging and neurodegeneration. Methods Mol Biol 2010; 610: 285-308. 4. Gałecka E, Jacewicz R, Mrowicka M, Florkowski A, Gałecki P. Enzymy antyoksydacyjne, struktura, właściwości, funkcje. Pol Merkur Lek 2008; 25(147): 266-268. 5. Valdivia A, Pérez-Alvarez S, Aroca-Aguilar JD, Ikuta I, Jordán J. Superoxide dismutases: a physiopharmacological update. J Physiol Biochem 2009; 65(2): 195-208. 6. Kirkman HN, Gaetani GF. Mammalian catalase: a venerable enzyme with new mysteries. Trends Biochem Sci 2007; 32(1): 44-50. 7. Michelson AM. Selenium glutathione peroxidase: some aspects in man. J Environ Pathol Toxicol Oncol 1998; 17(3-4): 233-239. 8. Gaweł S, Wardas M, Niedworok E, Wardas P. Dialdehyd malonowy (MDA) jako wskaźnik procesów peroksydacji lipidów w organizmie. Wiad Lek 2004; 57(9-10): 453-455. 9. Weydert C et al. Suppression of the malignant phenotype in human pancreatic cancer cells by the overexpression of manganese superoxide dismutase. Mol Cancer Ther 2003; 2(4): 361-369. 10. Yilmaz MI et al. Antioxidant system activation in prostate cancer. Biol Trace Elem Res 2004; 98(1): 13-19. 11. Hur GC et al. Manganese superoxide dismutase expression correlates with chemosensitivity in human gastric cancer cell lines. Clin Cancer Res 2003; 9(15): 5768-5775.

12. Yokoe H et al. Characterization of intracellular superoxide dismutase alterations in premalignant and malignant lesions of the oral cavity: correlation with lymph node metastasis. J Cancer Res Clin Oncol 2009; 135(11): 1625-1633. 13. Kekec Y, Paydas S, Tuli A, Zorludemir S, Sakman G, Seydaoglu G. Antioxidant enzyme levels in cases with gastrointesinal cancer. Eur J Intern Med 2009; 20(4): 403-406. 14. Nelson KK et al. Elevated sod2 activity augments matrix metalloproteinase expression: evidence for the involvement of endogenous hydrogen peroxide in regulating metastasis. Clin Cancer Res 2003; 9(1): 424-432. 15. Trachootham D, Alexandre J, Huang P. Targeting cancer cells by ROS-mediated mechanisms: a radical therapeutic approach? Nat Rev Drug Discov 2009; 8(7): 579-591. 16. Connor KM et al. Manganese superoxide dismutase enhances the invasive and migratory activity of tumor cells. Cancer Res 2007; 67(21): 10260-10267. 17. Dusre L et al. DNA interstrand cross-link and free radical formation in a human multidrug-resistant cell line from mitomycin C and its analogues. Cancer Res 1990; 50(3): 648-52. 18. Samuels BL et al. Increased glutathione peroxidase activity in a human sarcoma cell line with inherent doxorubicin resistance. Cancer Res 1991; 51(2): 521-527. 19. Lenehan PF et al. Resistance to oxidants associated with elevated catalase activity in HL-60 leukemia cells that overexpress multidrug-resistance protein does not contribute to the resistance to daunorubicin manifested by these cells. Cancer Chemother Pharmacol 1995; 35(5): 377-386. 20. Oyanagui Y. Reevaluation of assay methods and establishment of kit for superoxide dismutase activity. Anal Biochem 1984; 142(2): 290-296. 21. Paglia DE, Valentine WN. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 1967; 70(1): 158-169. 22. Aebi H. Catalase in vitro. Methods Enzymol 1984; 105: 121-126. 23. Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 1979; 95(2): 351-358. 24. Polaniak R i wsp. Wpływ holoksanu na aktywność izoenzymów dysmutazy ponadtlenkowej i stężenie dialdehydu malonowego w hodowli megakolonii komórek raka płaskonabłonkowego in vitro. Bromat Chem Toksykol 2008; 1: 89-94. 25. Oberley TD, Oberley LW. Antioxidant enzyme levels in cancer. Histol Histopathol 1997; 12(2): 525-535. 26. Efferth T et al. Artesunate induces ROS-mediated apoptosis in doxorubicin-resistant T leukemia cells. PLoS One. 2007; 2(1): e693. 27. Polaniak R et al. Influence of an extremely low frequency magnetic field (ELF-EMF) on antioxidative vitamin E properties in AT478 murine squamous cell carcinoma culture in vitro. Int J Toxicol 2010; 29(2): 221-230. 28. Zwirska-Korczala K et al. Influence of extremelylow-frequency magnetic field on antioxidative melatonin properties in AT478 murine squamous cell carcinoma culture Biol Trace Elem Res 2004; 102(1-3): 227-243. data otrzymania pracy: 02.06.2010 r. data akceptacji do druku: 16.11.2010 r. Adres do korespondencji: mgr Rafał Jakub Bułdak Katedra i Zakład Fizjologii Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 41-808 Zabrze, ul. Jordana 19 Tel.: +48 32 272 23 62 e-mail: rbuldak@tlen.pl