Opracował dr inż. Tadeusz Janiak

Opracował dr inż. Tadeusz Janiak 1 Uwagi dla wykonujących ilościowe oznaczanie metodami spektrofotometrycznymi 3. 3.1. Ilościowe oznaczanie w metodach spektrofotometrycznych Ilościowe określenie zawartości substancji w analizowanym materiale przy pomocy spektroskopii absorpcyjnej opiera się na pomiarze ilości światła pochłoniętego przez oznaczany związek lub jon metalu. Pomiaru dokonuje się dla odpowiednio przygotowanej próbki analitycznej. Korzysta się z absorpcji światła przez badaną substancję albo przeprowadza się badany związek lub jon metalu w barwne połączenie i mierzy absorpcję dla tego indywiduum chemicznego. Podstawowymi wielkościami opisującymi absorpcję światła są transmitancja i absorbancja. Transmitancja (T), inaczej przepuszczalność, jest określona wyrażeniem (1): I T = 100 (1) I 0 w którym (I) oznacza natężenie światła, które przeszło przez absorbującą warstwę, (I 0 ) natężenie światła padającego. Absorbancja (A) określona jest zależnością: I0 A = log (2) I Zgodnie z prawem Lamberta-Beera (3) absorbancja jest proporcjonalna do stężenia substancji pochłaniającej oraz do drogi na jakiej jest pochłaniane promieniowanie: A = ε c l (3) W powyższym wyrażeniu (A) oznacza absorbancję (wielkość niemianowaną) a (ε) jest współczynnikiem proporcjonalności, którego wielkość oraz jednostka zależy od

2 sposobu określenia stężenia (c) i drogi absorpcji światła (l). Dla stężenia (c) wyrażonego w mol dm -3 i drogi absorpcji (l) w cm, (ε) jest molowym współczynnikiem absorpcji w mol -1 dm 3 cm -1. Jeżeli stężenie absorbującej substancji wyrażone jest w µg cm -3 długość drogi absorpcji w cm, to współczynnik proporcjonalności wyrażony w cm 2 µg -1 nazywany jest absorbancją właściwą a jego wartość liczbowa oznacza absorbancję roztworu o stężeniu 1µg cm -3 zmierzoną w kuwecie o długości 1 cm. Prawo Lamberta-Beera nie zawsze jest spełnione. Odchylenia od tego prawa wynikają z szeregu przyczyn, np.: ze zbyt dużego stężenia barwnej substancji, pomiaru absorbancji przy długości fali znajdującej się na zboczu pasma absorpcji, lub braku monochromatyczności wiązki promieniowania użytego do pomiaru. W przypadku nie spełniania prawa Lamberta -Beera zależność absorbancji od stężenia przestaje być liniowa. W tej sytuacji należy zawęzić przedział stężeń dla którego dokonuje się pomiarów. W oznaczeniach ilościowych, za pomocą spektroskopii absorpcyjnej można wykorzystywać następujące metody: metodę krzywej wzorcowej, metodę dodawania wzorca, metodę roztworów ograniczających. Wszystkie powyższe metody są metodami porównawczymi, w których porównuje się sygnał zmierzony dla oznaczanej substancji z sygnałem otrzymanym dla wzorca, zawierającego znaną ilość analitu. Dokonuje się więc pomiaru absorbancji roztworu substancji, którą chcemy ilościowo określić. Następnie mierzymy absorbancję roztworu lub roztworów zawierających znane ilości oznaczanej substancji i korzystając z odpowiedniej zależności wyznaczamy zawartość badanej substancji. W opracowaniu wyników ćwiczeń wykorzystuje się metodę krzywej wzorcowej. W metodzie krzywej wzorcowej, (kalibracyjnej), sporządza się barwne reakcje dla kilku znanych ilości analitu w kolbkach miarowych o określonej pojemności. Ilości substancji dającej barwne reakcje oraz pojemności kolb miarowych są tak dobrane aby dla największego stężenia oznaczanej substancji, stosowanego do wykonywania krzywej wzorcowej, absorbancja była poniżej wartości 0,8. Przeważnie wykonuje się

3 od czterech do ośmiu roztworów wzorcowych. Stosując identyczne warunki oraz ilość i kolejność dodawania odczynników, tak jak dla wzorców wykonuje się reakcję barwną dla badanej próbki. Zawartość substancji odczytuje się bezpośrednio z krzywej wzorcowej lub, co daje dokładniejsze wyniki wylicza na drodze matematycznej (o czym będzie poniżej). Jeżeli stężenie analitu w badanej próbce jest zbyt duże lub zbyt małe i absorbancja otrzymanego roztworu znajdzie się nieznacznie poza zakresem krzywej wzorcowej należy do oznaczenia pobrać odpowiednio mniejszą lub większą ilość próbki. W przypadku dużej różnicy absorbancji dla próbki i dla krzywej wzorcowej należy próbkę rozcieńczyć lub wzbogacić. 3.2. Sporządzanie roztworów analitycznych Ilości oznaczanej substancji, niezbędne dla wykonania krzywej wzorcowej odmierza się stosując uprzednio przygotowane roztwory: podstawowy i robocze. W zależności od czułości stosowanej metody stosuje się roztwory robocze o stężeniu 10 µg/cm 3 lub 100 µg/cm 3. Roztwór podstawowy dla którego stężenie analitu wynosi 1 g/dm 3 (1 mg/cm 3 czyli 1.000 µg/cm 3 ) otrzymuje się naważając taką ilość gramów substancji czystej o stałym składzie, z dokładnością do czwartego miejsca po przecinku (to jest z dokładnością do 0,1 mg), aby zawierała 1 g analizowanej substancji. Na przykład aby otrzymać roztwór podstawowy Cr(VI) odważa się 2,8300 g K 2 Cr 2 O 7 wysuszonego w temperaturze 140 0 C i rozpuszcza w wodzie w kolbie miarowej o pojemności 1 dm 3. Następnie z roztworu podstawowego otrzymuje się roztwór roboczy o stężeniu 100 µg/cm 3 poprzez dziesięciokrotne rozcieńczenie. Na przykład pobiera się 10 cm 3 roztworu podstawowego i rozcieńcza do objętości 100 cm 3 odpowiednim rozpuszczalnikiem (w ćwiczeniach jest to woda podwójnie destylowana). Dla metod o dużej czułości roztwór roboczy o stężeniu 100 µg/cm 3 rozcieńcza się jeszcze dziesięciokrotnie i uzyskuje się roztwór roboczy o stężeniu 10 µg/cm 3. Roztwory robocze o niskich stężeniach są nietrwałe i muszą być przygotowywane w dniu wykonywania analizy. Roztwór podstawowy może być przechowywany przez dłuższy czas. Proces rozcieńczania roztworu podstawowego w celu uzyskania roztworów roboczych wygodnie jest przedstawić graficznie w postaci diagramu rozcieńczeń. Na

4 rysunku (rys.3) przedstawiono diagram rozcieńczeń dla wykonania krzywej wzorcowej oznaczania Cr(VI) w ćwiczeniu 1. Diagram należy rozumieć w następujący sposób. Nad strzałką umieszczone jest stężenie roztworu wyrażone w µg/cm 3 oraz jego nazwa. Obok strzałki podana jest objętość pobieranego roztworu. Poniżej strzałki umieszczono objętość do jakiej rozcieńcza się roztwór wyjściowy, stężenie uzyskanego w wyniku rozcieńczania roztworu w µg/cm3 oraz jego nazwę. Poniżej końcowych strzałek podane są ilości analitu w µg jakie uzyskuje się odpipetowując objętości roztworu roboczego podane obok strzałek i które wykorzystuje się dla oznaczeń. {1 000 µg /cm 3 }, Roztwór podstawowy 10 cm 3, pipeta Mohra 100 cm 3, {100 µg /cm 3 }, Roztwór A 10 cm 3, pipeta Mohra 100 cm 3, {10 µg /cm 3 }, Roztwór B 1 cm 3 2 cm 3 3 cm 3 4 cm 3 10 µg 20 µg 30 µg 40 µg Rys. 3 Diagram rozcieńczeń roztworu podstawowego.

5 {C x [µg /cm 3 ]}, Roztwór odpadu [Cr(VI)] 5 cm 3, pipeta Mohra 500 cm 3, {C x /100 [µg /cm 3 ]}, Roztwór C 2 cm 3 5 cm 3, pipeta Mohra 100 cm 3, {(C x /2 000) [µg /cm 3 ]}, Roztwór D {(2 cm 3 C x /100) [µg/cm 3 ]} =m x [µg ] 8 cm 3 (4 cm 3 C x /2 000) [µg/cm 3 ] =m x [µg ] Rys. 4 Diagram rozcieńczeń odpadu. Na rysunku (rys.4) przedstawiony jest diagram rozcieńczeń badanego odpadu. Sposób posługiwania się diagramem jest identyczny jak diagramem rozcieńczeń dla krzywej wzorcowej. W oparciu o powyższy diagram można wyznaczyć wzór służący do obliczenia stężenia analitu w odpadzie. Jeżeli w oparciu o pomiary absorbancji 4 cm 3 rozcieńczonego roztworu D odpadu określi się, że zawartość analitu w tej rozcieńczonej próbce wynosi m x to stężenie oznaczanego składnika określa zależność (4): 3 2000 Cx [ µ g / cm ] = m x[ µ g]) (4) 3 4cm We wzorze tym liczba 2000 oznacza krotność rozcieńczenia badanej próbki, 4 cm 3 to objętość rozcieńczonego odpadu pobrana do analizy, m x [µg] jest ilością analitu określoną w oparciu o pomiary krzywej wzorcowej a C x oznacza zawartość µg analitu w 1 cm 3 badanego roztworu. Dla bardziej ogólnego przypadku wzór przedstawia się następująco: 3 K x Cx [ µ g / cm ] = m x[ µ g] (5) 3 V [cm ] x

6 We wzorze tym K x oznacza krotność rozcieńczenia i jest to stosunek objętości końcowej do objętości próbki pobranej w pierwotnym rozcieńczeniu pomnożony przez taki sam stosunek dla wtórnego rozcieńczenia. V x [cm 3 ] oznacza objętość pobraną do analizy. 3.3. Obliczenia zawartości oznaczanych substancji Krzywą wzorcową można otrzymać graficznie. Dzieli się na połowę odcinki sąsiadujących ze sobą punktów pomiarowych po czym otrzymane punkty pomocnicze łączy się odcinkami i dzieli się je na połowę. Operację tę powtarza się tak długo aż uzyska się punkty pomocnicze leżące na linii prostej. Przez te punkty przeprowadza się krzywą wzorcową. Postać graficzną oraz równanie krzywej wzorcowej można uzyskać korzystając z odpowiedniego programu komputerowego: Excel, Sigma-Plot, Origin lub innego. Równanie krzywej wzorcowej wyznacza się w oparciu o metodę najmniejszych kwadratów. Zakłada ona, że najlepszym równaniem dostosowującym przebieg krzywej do punktów pomiarowych jest to dla którego suma kwadratów różnicy między wartościami obliczonymi w oparciu o to równanie a doświadczalnymi osiąga minimum. W równaniu (6), parametry a i b dopasowujące prostą do naszych wyników doświadczalnych wyznacza się w oparciu o wzory (7) i (8) (ich wyprowadzenie jest podane na przykład w skrypcie Ćwiczenia laboratoryjne z chemii fizycznej pod redakcją W. Moski): y = a + bx (6) b nσ(x y ) Σx Σy i i i i = (7) 2 2 nσx i ( Σx i ) Σy i bσx i a = (8) n We wzorach (7) i (8) (x i ) oznacza określoną w doświadczeniu zmienną niezależną na przykład zawartość analitu w µg, natomiast (y i ) jest wartością wyznaczoną w doświadczeniu na przykład absorbancją analitu. Poniżej przedstawiono wyznaczenie krzywej wzorcowej dla przykładowych wyników doświadczalnych, uzyskanych podczas oznaczania chromu(vi) metodą chromianową w środowisku zasadowym.

7 Tabela 1 Wartości absorbancji uzyskane podczas oznaczania Cr(VI) metodą chromianową. Pojemność kolbki 50cm 3, kuweta 1cm, ph=12. L.p. (m i ) iloś ć Cr(VI) [µg] Absorbancja (A) 1 100 0,176 2 200 0,336 3 300 0,470 4 400 0,610 5 m x 0,245 Przy wyznaczaniu parametrów krzywej wzorcowej posłużymy się tabelą 2 a w której wartości liczbowe uzyskujemy w oparciu o wyniki pomiarów zamieszczone w tabeli 1. Korzystając ze wzoru (7) i (8) oraz wartości zawartych w tabeli 2 otrzymujemy: b = 4 469,8 1000 1,592 4 300000 1000000 1,592 0,001436 1000 a = = 0,039 4 = 1879,2 1592 1200000 1000000 287 = 200000 = 0,001436 Tabela 2 Dane dla krzywej wzorcowej uzyskane w oparciu o wyniki zamieszczone w Tabeli 1 L.p. m i A i m i* A i m i 2 1 100 0,176 17,6 10 000 2 200 0,336 67,2 40 000 3 300 0,470 141,0 90 000 4 400 0,610 244,0 160 000 Σ 1 000 1,592 469,8 300 000 Krzywa wzorcowa dla wyników przedstawionych w tabeli 1 ma postać: A=0,039 + 1,44 10-3 m i A m x = i 0,039 3 1,44 10

8 zawartość chromu(vi) w próbce analitycznej wynosi więc: 0,245 0,039 m x = =143,5 µg 3 1,44 10 Stężenie Cr(VI) w odpadzie otrzymujemy w oparciu o równanie (5), dla którego (K x =100), (V x =2 cm 3 ), (patrz rys. 4): C x = m x 100 = m x 50 = 143,5 50=7 175 µg/cm 3 2 W czasie wykonywania analizy podczas ćwiczeń student powinien najpierw wykonać roztwory robocze dla krzywych wzorcowych a następnie dokonać rozcieńczenia odpadu zgodnie z zaleceniami instrukcji. W dalszej kolejności powinien pobrać do kolbek miarowych zadane przez prowadzącego ilości analitu dla krzywej wzorcowej. Do kolejnej kolby pobrać wyszczególnioną dla danego odpadu i metody ilość rozcieńczonego odpadu. Po wykonaniu powyższych czynności należy dodać określone w instrukcji odczynniki potrzebne do uzyskania barwnej reakcji w każdej z kolb oraz jeżeli istnieje taka konieczność dodać takie same ilości odczynników do kolby zawierającej niewielką ilość wody destylowanej (ślepa próba). Postępując w ten sposób łatwo uzyskuje się identyczne warunki wytwarzania barwnych połączeń (ilości odczynników, temperaturę, czasy tworzenia się barwnych połączeń, czasy od momentu powstania barwnego połączenia do momentu pomiaru absorbancji) niezbędne dla uzyskania rzetelnych wyników.