POLITECHNIKA GDAŃSKA WYDZIAŁ CHEMICZNY KATEDRA TECHNOLOGII CHEMICZNEJ INSTRUKCJA DO ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH METODY BIOTECHNOLOGICZNE W OCHRONIE ŚRODOWISKA BADANIE AKTYWNOŚCI DEHYDROGENAZ MIKROORGANIZMÓW OSADU CZYNNEGO METODĄ SPEKTROFOTOMETRYCZNĄ Z TTC PRZYGOTOWAŁA mgr inż. Marta Chrzanowska mgr inż. Justyna Łuczak
1. Wprowadzenie Oczyszczanie biologiczne ścieków za pomocą osadu czynnego polega na wychwytywaniu zanieczyszczeń przez mikroorganizmy osadu czynnego i ich dalszym rozkładzie w celu wbudowania ich w biomasę. Oczyszczanie jest możliwe jeżeli zapewnimy mikroorganizmom odpowiednią ilość substratów, które są źródłem C:N:P oraz innych makro i mikroelementów, a proces prowadzimy w warunkach tlenowych przy ph 6-8. Reakcje rozkładu zanieczyszczeń przebiegają przy udziale enzymów, występujących w komórkach drobnoustrojów. O efektywności utleniania substratów decyduje aktywność enzymów łańcucha oddechowego mikroorganizmów. W procesie tlenowym odłączony od utlenionego substratu atom wodoru jest przenoszony przez łańcuch oddechowy na końcowy akceptor, którym jest tlen. Pierwszymi enzymami łańcucha oddechowego są dehydrogenazy, enzymy z grupy oksydoreduktaz, które biorą udział w procesach utleniania komórkowego, katalizując odłączanie atomu wodoru od substratu i przenoszenie protonów i elektronów na dalsze ogniwa łańcucha oddechowego. Aktywność dehydrogenaz może służyć jako wskaźnik aktywności mikroorganizmów osadu czynnego. Aktywność dehydrogenaz jest zależna od rodzaju mikroorganizmów, ich fazy wzrostu i żywotności oraz składu fizyko-chemicznego ścieków, a także od obciążenia osadu ładunkiem zanieczyszczeń. W celu wykonania oznaczenia konieczne jest rozbicie kłaczków osadu ze względu na zlokalizowanie enzymów łańcucha oddechowego. Metoda spektrofotometryczna z chlorkiem trójfenylotetrazoliowym (TTC) służy do kontroli procesu oczyszczania ścieków metodą osadu czynnego. Badanie to jest szczególnie konieczne w przypadku oczyszczania ścieków zawierających szereg związków toksycznych, inhibitorów reakcji biochemicznych. Metoda oznaczania dehydrogenaz służy do oceny aktywności biochemicznej mikroorganizmów w procesach utleniania związków organicznych. Oznaczanie tych enzymów stosuje się do kontroli prawidłowości przebiegu procesu oczyszczania ścieków oraz określania stopnia adaptacji osadu czynnego do ścieków przemysłowych. W przypadkach pogarszania się efektu oczyszczania ścieków, pomiar aktywności dehydrogenaz daje podstawę do wprowadzania zmian parametrów technicznych. Czynnikami przeszkadzającymi w oznaczaniu są światło i tlen. 2. Degradacja fenolu Fenole są związkami toksycznymi (powodującymi uszkodzenia narządów miąższowych) stosowanymi w przemyśle jako półprodukty. Występują głównie w ściekach pochodzących z przemysłu petrochemicznego, farmaceutycznego, papierniczego, hutniczego, tworzyw sztucznych. Największe ilości znajdują się w ściekach pochodzących z produkcji fenolu i acetonu stężenie 3000-15000 ppm. Po wstępnym usuwaniu fizyko-chemicznym (adsorpcja na wymieniaczu anionowym) stężenie fenolu często nadal jest wysokie i wynosi od 300 do 400 ppm. Prowadzonych jest wiele badań dotyczących biodegradacji fenolu w procesach mikrobiologicznych lub enzymatycznych. Za degradację związku odpowiedzialne są m.in. bakterie Actinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas sp. CF600, Pseudomonas putida WAS2, drożdże np. Trichosporon oraz enzymy m.in. oksydaza o-dwufenolanowa otrzymywana z grzybów, oksydaza polifenolowa lub peroksydazy. Ograniczenia metod mikrobiologicznych, to przede wszystkim możliwość oczyszczania ścieków o niskich stężeniach fenolu (do 30 ppm) oraz małej objętości. Metody te charakteryzują się długim czasem reakcji, dużą wrażliwością na zmiany temperatury i ph. Szeroko stosowaną obecnie metodą oczyszczania ścieków zarówno miejskich jak i przemysłowych jest biologiczna metoda oczyszczania ścieków z wykorzystaniem osadu czynnego. Zasadą oczyszczalni biologicznej jest otrzymanie zawiesiny osadu w ściekach podczas mieszania i napowietrzania. Ilość osadu czynnego w oczyszczalni jest regulowana
poprzez odprowadzanie tzw. osadu nadmiernego oraz recylkulację. Układy technologiczne oczyszczania ścieków metodą osadu czynnego różnią się między sobą stopniem biologicznego oczyszczenia. Systemy oczyszczania ścieków metodą osadu czynnego różnią się między sobą: - stopniem obciążenia osadu ładunkiem zanieczyszczeń - wiekiem osadu - czasem napowietrzania - sprawnością i efektywnością oczyszczania ścieków. Usuwanie węglowodorów ze ścieków metodą osadu czynnego polega na ich adsorpcji na kłaczkach oraz rozkładzie biologicznym. Wymagana jest wstępna aklimatyzacja osadu do danego rodzaju ścieków. 3. Zasada metody (PN-82 C-04616.08) Oznaczenie aktywności dehydrogenaz w osadzie czynnym polega na pomiarze ilości trójfenyloformazanu (TF) wytworzonego z chlorku trójfenylotetrazoliowego (TTC). Aktywność dehydrogenaz przejawia się w procesie odwodornienia substratu glukozy, dodanego do próbki osadu czynnego i przeniesienia wodoru na bezbarwny związek biologicznie czynny TTC, który ulega redukcji do TF o zabarwieniu czerwonym. Reakcja odwodornienia glukozy przez dehydrogenazy zachodzi podczas inkubacji odtlenionych próbek w określonym czasie, temperaturze i odczynie. Intensywność zabarwienia zależy od ilości wytworzonego formazanu i jest proporcjonalna do aktywności enzymatycznej mikroorganizmów. TF zostaje wyekstrahowany z próbki za pomocą alkoholu n-butylowego. Intensywność zabarwienia ekstraktu oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali 490 nm. W oznaczeniu uwzględnia się badanie próbki kontrolnej bez dodatku substratu egzogennego glukozy, w celu określenia intensywności oddychania endogennego mikroorganizmów osadu czynnego. Jeżeli aktywność dehydrogenaz w próbce z dodatkiem glukozy jest równa lub niższa niż aktywność dehydrogenaz w próbce bez dodatku glukozy, w której zachodzi oddychanie endogenne, oznacza to że dodana glukoza nie stanowi źródła dla mikroorganizmów osadu, a więc osad czynny wykazuje aktywność tylko w stosunku do substratów wewnątrz komórkowych. Ze względu na trudności w określaniu żywej biomasy, oznaczane są zawartości zawiesin ogólnych osadu, w których skład wchodzą żywe organizmy i zawiesiny. Jako wynik oznaczenia przyjmuje się iloraz ilości trójfenyloformazanu do zawartości zawiesin ogólnych. 4. Literatura 1. Norma PN-82 C-04616.08. Woda ścieki. Badania specjalne osadów. Badanie aktywności dehydrogenaz w osadzie czynnym metodą spektrofotometryczną z TTC. 2. Hermanowicz W., Fizyczno-chemiczne badanie wody i ścieków, Arkady, Warszawa, 1999. 3. Dymaczewski Z., Poradnik eksploatatora oczyszczalni ścieków, Polskie Zrzeszenie Inż. i Tech. Sanitarnych, Poznań,1997.
5. Przebieg ćwiczenia Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zbadanie zmian aktywności dehydrogenaz mikroorganizmów osadu czynnego metodą spektrofotometryczną z TTC podczas oczyszczania ścieków zawierających fenol. Sposób przeprowadzenia pomiarów Zbadać aktywność dehydrogenaz mikroorganizmów osadu czynnego przed oraz po dodaniu fenolu. Do zlewki ustawionej na mieszadle wlać 500 cm 3 osadu czynnego, dodać fenol w ilości podanej przez prowadzącego. Oznaczyć aktywność dehydrogenaz po 5, 10 i 15 min. 4.2.1. Przygotowanie skali wzorców i sporządzenie krzywej wzorcowej Do siedmiu cylindrów Nesslera pojemności po 50 cm 2 odmierzyć kolejno: 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0 cm 2 roztworu wzorcowego roboczego TF i uzupełnić alkoholem n-butylowym do objętości 50 cm 2. Tak przygotowane wzorce zawierają odpowiednio: 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 2,0 μmola TF we wzorcu. Z każdego przygotowanego wzorca pobrać próbkę i zmierzyć jej absorbancję przy długości fali 490 nm, w kuwetach o grubości warstwy absorbującej 1 cm, stosując jako odnośnik alkohol n-butylowy. Krzywa wzorcową wykreślić odkładając na osi odciętych zawartość TF w μmolach, a na osi rzędnych, odpowiadające im wartości absorbancji. 4.2.2. Przygotowanie próbki osadu do badań Z komory napowietrzania pobrać próbkę ścieków w ilości 50 cm 3 osadu. Całość odwirować w wirówce przy 5000 obr/min przez 10 minut i zdekantować ciecz nadosadową. Osad przenieść ilościowo do cylindra miarowego o pojemności 50 cm 3 i uzupełnić do kreski wodą buforowaną. Całość wymieszać. Przelać zawiesinę do pojemnika homogenizatora nożowego. Homogenizować przez 0,5 min przy 2500 obr/min. 4.2.3. Wykonanie oznaczenia W pięciu probówkach pomiarowych z doszlifowanymi korkami pojemności 25-30 cm 2 przygotować roztwory wg tabeli (objętości poszczególnych składników w cm 3 ): Probówka 1,2 3,4 5 Roztwór (próba ślepa) Bufor Tris-HCl 5 5 5 Homogenat osadu czynnego 5 5 - Woda buforowana - 2 5 Glukoza 2-2 Siarczy sodu 1 1 1 TTC 2 2 2 Po zamknięciu korkiem zawartość próbek dokładnie wymieszać. Inkubować w ciemności w temperaturze 37 o C przez 30 minut. Po upływie tego czasu zatrzymać reakcje dodając do każdej próbki po 0,1 cm 3 stężonego kwasu siarkowego całość dokładnie wymieszać. Do każdej próbki wlać po 10 cm 3 butanolu i wytrząsać tak długo, aż czerwono zabarwiony formazan całkowicie rozpuści się w butanolu. Próbkę termostatować przez 5 minut w temperaturze 90 o C. Pobrać 5 cm 3 ekstraktu butanolowego i odwirować przy 1000 obr przez
15 minut. Zmierzyć absorbancję klarownego roztworu ekstraktu w spektrofotometrze przy długości fali = 490 nm, stosując jako odnośnik próbę ślepą. Z dwóch równoległych pomiarów absorbancji próbek z dodatkiem glukozy odczytać na krzywej wzorcowej zawartość TF w μmolach i obliczyć średnią arytmetyczną. Podobnie obliczyć średnią arytmetyczną dwóch pomiarów dla próbek bez dodatku glukozy. Z krzywej wzorcowej odczytać ilość utworzonego formazanu w obu próbkach. 4.2.4. Obliczenie wyniku oznaczenia Aktywność dehydrogenaz osadu czynnego wobec egzogennego substratu (glukozy) oraz wobec substratów endogennych (substancji zapasowych zawartych w komórkach) obliczyć w μmolach na 1 mg suchej masy osadu wg wzoru: A 1 a1 200 = 5 sm gdzie: a 1 odczytana z krzywej wzorcowej średnia ilość TF w dwóch równoległych próbkach osadu odpowiadająca próbce osadu o objętości 5 cm 3, odpowiednio z glukozą lub bez glukozy, [μm], sm sucha masa osadu, [mg/cm 3 ] 5 współczynnik przeliczeniowy z objętości 10 cm 3 na 50 cm 3 alkoholu n-butylowego, 200 współczynnik przeliczeniowy z objętości 5 cm 3 na 1 dm 3, 4.2.5. Opracowanie wyników a) Wykonać krzywa wzorcową przedstawiająca zależność zawartości TF w μmolach od odpowiadających im wartości absorbancji, b) Podać aktywność dehydrogenaz dla próbek z glukozą oraz dla próbek bez glukozy, wykonać wykres zmiany aktywności dehydrogenaz w czasie, c) Sformułować wnioski.