Rok akad. 2014/2015 Semestr zimowy, czwartek, 8.30-10.00

PROWADZĄCY: Prof. Nadzieja Drela Prof. Krystyna Skwarło-Sońta dr Magdalena Markowska dr Paweł Majewski Rok akad. 2014/2015 Semestr zimowy, czwartek, 8.30-10.00

Przykłady chorób związanych z chronicznym stanem zapalnym, Modelowe oddziaływania między układem neuroendokrynowym i odpornościowym, Układ odpornościowy w depresji, Rozwój psycho-neuro-immunologii.

Elementy zaangażowane w regulację reakcji zapalnej Points of control in inflammation Nature 420, 846-852 (19 December 2002) Carl Nathan

Elementy zaangażowane w regulację reakcji zapalnej MAKROFAG nerw błędny Ach NA Ach Ach NA adrenalina, glukokortykoidy, -endorfina NA TNF-, IL-1, IL-6, nerw współczulny KOMÓRKI TUCZNE SP SP białka ostrej f a z y włókna czuciowe n e r w u b ł ę d n e g o histamina, eikozanoidy, chemokiny,tnf- SP neurony bólowe

Points of control in inflammation Nature 420, 846-852 (19 December 2002) Carl Nathan

Alzheimer s disease choroba Alzheimera Osteoarthritis - zapalenie kostno-stawowe Anaphylaxis - anafilaksja (nadwrażliwość) Pemphigus - pęcherzyca Ankylosing spondylitis - zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa Periodic fever syndromes syndrom okresowych gorączek Asthma - astma Psoriasis - łuszczyca Atherosclerosis - miażdżyca Rheumatoid arthritis reumatoidalne zapalenie stawów Atopic dermatitis - atopowe zapalenie skóry Sarcoidosis sarkoidoza (ziarniaki) Chronic obstructive pulmonary disease - przewlekła obstrukcyjna choroba płuc Systemic lupus erythematosus - toczeń rumieniowaty układowy Crohn s disease (regional enteritis) - choroba Leśniewskiego-Crohna Type I diabetes mellitusoroba cukrzyca typu I Gout gościec/podagra Ulcerative colitis wrzodziejące zapalenie jelita grubego Hashimoto s thyroiditis - zapalenie tarczycy Hashimoto Vasculitides (Wegener s syndrome), - układowe zapalenia naczyń (ziarniakowatość) Ischaemia-reperfusion injury choroby niedokrwienne Xenograft rejection odrzucenie przeszczepu Multiple sclerosis - stwardnienie rozsiane Points of control in inflammation Nature 420, 846-852 (19 December 2002) Carl Nathan

Miażdzyca

Chorzy na IBD (Inflammatory Bowel Desease - nieswoiste zapalenie jelit) Ulcerative colitis - Wrzodziejące zapalenie jelita grubego Crohn Desease - Choroba Leśniowskiego-Crohna Antoni Leśniowski 1904 rok Burrill Bernard Crohn 1932 rok

Choroby związane z chronicznym stanem zapalnym można podzielić na: Choroby, których etiologia wiąże się ściśle z rozwojem rekcji zapalnej, Choroby, których etiologia wiąże się z rekcją zapalną oraz obecnością patogenu, Choroby, o różnej etiologii, podczas których zwłóknienie (fibrosis) jest ich podstawową przyczyną.

Choroby związane z chronicznym stanem zapalnym można podzielić na choroby wywołane uszkodzeniem: czynników zaangażowanych w regulację procesu apoptozy, czynników uczestniczących w usuwaniu elementów zaangażowanych w reakcję zapalną oraz występujących w komórkach apoptotycznych, cytokin, receptorów dla cytokin i innych receptorów błonowych, czynników występujących wewnątrz leukocytów i komórek nabłonkowych, czynników wpływających na poziom stresu oksydacyjnego.

Choroby, w których stan zapalny może uczestniczyć w rozwoju patologii wraz z toksycznością mikroorganizmów Points of control in inflammation Nature 420, 846-852 (19 December 2002) Carl Nathan

Choroby, o różnej etiologii, podczas których zwłóknienie (fibrosis) jest ich podstawową przyczyną Points of control in inflammation Nature 420, 846-852 (19 December 2002) Carl Nathan

Choroby, których etiologia wiąże się ściśle z czynnikami zaangażowanymi w regulację procesu apoptozy Points of control in inflammation Nature 420, 846-852 (19 December 2002) Carl Nathan

Choroby, których etiologia wiąże się ściśle z czynnikami zaangażowanymi w usuwanie elementów zaangażowanych w reakcję zapalną oraz występujących w komórkach apoptotycznych, Points of control in inflammation Nature 420, 846-852 (19 December 2002) Carl Nathan

Choroby, których etiologia wiąże się ściśle z upośledzeniem funkcji cytokin, receptorów dla cytokin i innych receptorów błonowych Points of control in inflammation Nature 420, 846-852 (19 December 2002) Carl Nathan

Choroby, których etiologia wiąże się ściśle z upośledzeniem czynników występujących wewnątrz leukocytów i komórek nabłonkowych, Points of control in inflammation Nature 420, 846-852 (19 December 2002) Carl Nathan

Points of control in inflammation Nature 420, 846-852 (19 December 2002) Carl Nathan

Elementy zaangażowane w regulację reakcji zapalnej MAKROFAG nerw błędny Ach NA Ach Ach NA adrenalina, glukokortykoidy, -endorfina NA TNF-, IL-1, IL-6, nerw współczulny KOMÓRKI TUCZNE SP SP białka ostrej f a z y włókna czuciowe n e r w u b ł ę d n e g o histamina, eikozanoidy, chemokiny,tnf- SP neurony bólowe

The vagus nerve and the nicotinic anti-inflammatory pathway Luis Ulloa Nature Reviews Drug Discovery 4, 673-684 (August 2005) Pro-inflammatory cytokines are one of the major causes of human morbidity and mortality, and they are successful pharmacological targets for the treatment of a variety of human infectious and inflammatory disorders. Shock, trauma, ischaemia and sepsis activate the innate immune system to trigger a defensive inflammatory response that is normally regulated by physiological anti-inflammatory mechanisms. Overwhelming production of pro-inflammatory cytokines (interferon- (INF), tumour-necrosis factor (TNF), interleukin 1 (IL-1) and high-mobility group box 1 (HMGB1)) can be more dangerous than the original stimuli and cause the characteristic cardiovascular collapse and multiple organ failure associated with severe sepsis. Anti-inflammatory strategies to control the production of these pro-inflammatory cytokines represent a therapeutic approach for infectious and inflammatory disorders.

The vagus nerve and the nicotinic anti-inflammatory pathway Luis Ulloa Nature Reviews Drug Discovery 4, 673-684 (August 2005) The vagus nerve can modulate the innate immune response and prevent inflammation through a physiological mechanism that can be translated into a pharmacological strategy. Acetylcholine, the principal neurotransmitter of the vagus nerve, signals through either muscarinic or nicotinic receptors, and so selective agonists (atropine, -conotoxin or mecamylamine) were used to identify the receptors involved in the control of macrophages. This mechanism has been called the 'nicotinic anti-inflammatory pathway' because acetylcholine can inhibit the production of pro-inflammatory cytokines from macrophages through a nicotinic acetylcholine receptor. Nicotine, a more selective cholinergic agonist, is more efficient than acetylcholine at inhibiting the production of pro-inflammatory cytokines from macrophages through a mechanism that is dependent on the 7-nicotinic acetylcholine receptor (7nAChR).

The vagus nerve and the nicotinic anti-inflammatory pathway Luis Ulloa Nature Reviews Drug Discovery 4, 673-684 (August 2005) a Endotoxin (End) induces the transcription of a number of inflammatory cytokines (tumour-necrosis factor (TNF), interleukin 1 (IL-1) and IL-6). Acetylcholine and nicotine can inhibit the production of these cytokines through a post-transcriptional mechanism that is dependent on the 7 nicotinic acetylcholine receptor (7nAChR). Neither acetylcholine nor nicotine decreases the mrna levels of these cytokines but they both significantly inhibit their protein synthesis. This mechanism is specific for proinflammatory cytokines and neither acetylcholine nor nicotine inhibits the production of anti-inflammatory cytokines such as IL-10.b Nicotinic posttranscriptional regulation of pro-inflammatory cytokines. Acetylcholine inhibits endotoxin-induced HMGB1 secretion from human macrophages. This mechanism is especially significant because, unlike other pro-inflammatory cytokines, the continuous protein synthesis of HMGB1 is required for survival and the normal transcriptional regulation of macrophages. Acetylcholine inhibits HMGB1 secretion from human macrophages by signalling through a nicotinic acetylcholine receptor (nachr). Nicotine, a more selective cholinergic agonist, is more efficient than acetylcholine, and inhibits HMGB1 release induced by either endotoxin or tumour-necrosis factor (TNF). Nicotine prevents endotoxin-induced activation of the nuclear factor-b (NF-B) pathway and inhibits HMGB1 secretion through a specific 'nicotinic anti-inflammatory pathway' dependent on the 7nAChR. HMGB1, highmobility group box 1; TLR, toll-like receptor; NF-B, nuclear factor-b.

The vagus nerve and the 'nicotinic antiinflammatory pathway' represent a physiological mechanism that might be useful for the treatment of different infectious and inflammatory diseases. The vagus nerve represents a physiological target for pharmacological anti-inflammatory compounds. CNI-1493 and melanocortin peptides control systemic inflammation through a mechanism that is dependent on the vagus nerve. Electrical stimulation of the vagus nerve is currently used for the treatment of refractory epilepsy and depression. Acetylcholine and nicotine activates the 7nAChR in macrophages and controls the production of inflammatory cytokines. Nicotine has already been used in clinical trials and provided a therapeutic effect against ulcerative colitis. Similar to nicotine, ethyl pyruvate limits systemic inflammation by inhibiting the nuclear factor-b (NF-B), and controlling the production of a variety of inflammatory cytokines including tumour-necrosis factor (TNF) and high-mobility group box 1 (HMGB1). These inflammatory cytokines are therapeutic targets for the treatment of diverse inflammatory diseases, including rheumatoid arthritis and Crohn's disease. The vagus nerve and the nicotinic anti-inflammatory pathway Luis Ulloa Nature Reviews Drug Discovery 4, 673-684 (August 2005)

Elementy zaangażowane w regulację reakcji zapalnej Points of control in inflammation Nature 420, 846-852 (19 December 2002) Carl Nathan

High-mobility group box 1 protein (HMGB1): nuclear weapon in the immune arsenal Michael T. Lotze and Kevin J. Tracey Nature Reviews Immunology 5, 331-342 (April 2005)

TOLL-like receptors - ekspresja cytokin, - chemokin, - czynników hemotaktycznych, - białek ostrej fazy, - wzrost aktywności fagocytarnej, - uwolnienie enzymów (proteaz, hydrolaz), antybiotyków (defensyny, azurocysyna), - czynników utleniających (nadtlenek wodoru, chloraminy).

Postępy Fitoterapii 2/2004, s. 87-90 Przedstawienie kluczowej roli czynnika NF-KB w przekazywaniu sygnałów prowadzących do indukcji transkrypcji wielu genów, m.in. COX-2 (cyklooksygenaza 2) i inos (indukowalna syntaza tlenku azotu), cytokin prozapalnych (m.in. TNFa, IL-lb) i rozwoju stanu zapalnego, angiogenezy, onkogenezy i metastazy. IkB inhibitor czynnika NF-kB; IKK kompleks kinaz inhibitora IKB; AP-l -czynnik transkrypcyjny; MAPK aktywowana mitogenem kinaza białkowa (wg 7 i 17).

Chorzy na IBD (Inflammatory Bowel Desease - nieswoiste zapalenie jelit) Ulcerative colitis - Wrzodziejące zapalenie jelita grubego Crohn Desease - Choroba Leśniowskiego-Crohna Antoni Leśniowski 1904 rok Burrill Bernard Crohn 1932 rok

menopauza (zwłaszcza wczesna), zaawansowany wiek, mukowiscydoza. Czynniki ryzyka wystąpienia osteoporozy: uwarunkowania genetyczne, nieprawidłowa dieta, długotrwałe unieruchomienie, przyjmowanie leków: kortykosteroidów, nasennych, hormonów tarczycy choroby tj.: cukrzyca, reumatoidalne zapalenie stawów, kamica nerkowa, IBD (Inflammatory Bowel Desease - nieswoistych zapaleń jelit), niedobór witaminy D

Chorzy na IBD (Inflammatory Bowel Desease - nieswoiste zapalenie jelit) 70% chorych ze zmniejszoną gęstością kości (BMD), 31-59% chorych jest klasyfikowana jako osoby z osteopenią, 5-41% chorych na IBD ma osteporozą, Przyczyny zmian w gęstość kości Słaba zdolność do przyswajania składników odżywczych z diety, Wpływ leczenia glukokortykoidami, Zmniejszona aktywność gonad, Niski poziom witaminy D i wapnia, Unieruchomienie, Wysoki poziom cytokiny prozapalnych (IL-6, IL-1b, TNF).

Wysoki poziom cytokiny prozapalnych TNF Powoduje aktywację osteoklastów poprzez zwiększenie ekspresji RANKL (receptor activator of NF-κB ligand) w osteoblastach, Hamuje apoptozę osteoklastów, Stymuluje apoptozę osteoblastów, Zwikszenie ekspresji IL-6 pod wpływem TNFa dodatkowo aktywuje osteoklasty, Przeciwciała przeciwko TNF (Infliximab) przeciwdział zminiejszeniu gęstości kości u chorych z IBD

Poly(ADP-ribosyl)ation Figure 1 Metabolism of poly(adp-ribose) during DNA damage and repair. In response to DNA-strand breaks

Poly(ADP-ribosyl)ation Figure 4 PARP-1 in the repair of single-strand breaks. Following the detection of single-strand-dna breaks (SSBs)

Wpływa na strukturę chromatyny, Może być czynnikiem transkrypcyjnym, Poly(ADP-ribosyl)ation Poprzez swoją aktywność PAR-ylację może zmieniać interakcje między białkami, w tym czynników trankrypcyjnych.

Fig. 1. Distinct patterns of genomic localization for H1 and PARP-1. (A)Heat maps of H1 and PARP-1 ChIP-chip data shown from 10 to +5 kb relative to the TSS. The data are limited to 758 promoters with the highest PARP-1 ChIP-chip signals and are ordered based on the intensity of the PARP-1 signal at the promoter. (B) Histograms showing the number of statistically significant peaks and troughs of PARP-1 and H1 across the entire 30-kb tiled region for the 1517 promoters on the ChIP-chip array.

Fig. 2. Averaging analysis of the log2 enrichment ratiosfrom H1 and PARP-1 ChIP-chip for genes

PHEX Phosphate-regulating gene with homologies to Endopeptidases on the X chromosom) Gen koduje Zn-metalopeptydazę, Ekspresja w osteoblastach i odontoblastach, Mutacja genu Phex u ludzi powoduje: - krzywicę oporną na witaminę D, - hypofosfatemię, - niski poziom witaminy D, - rozmiękczenie kości, - zmniejszoną aktywność i ekspresję NaPi IIa w kanalikach nerkowych,

Homeostaza Pi MEPE Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein ASARM Acidic-Serine- Aspartate- Rich-MEPE associated motif

Podawanie leków przeciwdepresyjnych działa na hipokamp neuroprotekcyjnie Luo L., 2001

Podanie zdrowym ochotnikom LPS A. Reichenberg et al., 2001

Podanie zdrowym ochotnikom LPS wywołało zmianę zachowania, pojawienie się lęku oraz objawy depresyjne. WNIOSEK: Pobudzenie syntezy cytokin lub podawanie cytokin prozapalnych prowadzi do rozwoju objawów depresyjnych. A. Reichenberg et al., 2001

U zwierząt centralne podanie TNF powoduje stan depresyjny Kaster MP., 2012

Podanie etanarceptu (antagonisty TNF) zmniejsza objawy depresyjne pojawiające się po zawale serca u szczurów. Grippo AJ., 2003

Rozwój psycho-neuro-immunologii Dziedzina obejmująca elementy: Immunologii Neurobiologii Psychiatrii Psychologii

Rozwój psycho-neuro-immunologii Jako pierwszy rzymski lekarz Galen zauważył, że tylko 20% jego pacjentów ma poważne fizyczne oznaki symptomów medycznych, Galen (130 200 n.e.) Zauważył również, że melancholijne kobiety są bardziej podatne na nowotwory niż kobiety o optymistycznym temperamencie,

Rozwój psycho-neuro-immunologii Pojawienie się doniesień o korelacji występowania depresji z chorobami nowotworowymi, Długość życia pacjentów z zagrażającymi życiu infekcjami podczas takich chorób jak gruźlica czy AIDs jest znacząco zmienian przez stan psychiczny pacjenta, Pod koniec XX w. pojawiły się sugestie, że mózg ma wpływ na układ odpornościowy, a układ odpornościowy reguluje stan psychiczny.

Rozwój psycho-neuro-immunologii Fundamentem rozwoju nowej dzidziny były: Rozwój koncepcji Hansa Seyle (lata 30-te XX w.) homeostazy na stres, w której oś HPA i układ odpornościowy mają kluczowe znaczenie w tzw. odpowiedzi adaptacyjnej, Wykazanie, że układ odpornościowy może być warunkowany klasycznie t.j. odruch Pawłowa (ból i światło bodziec warunkowy i bezwarunkowy), Uszkodzenia mózgu wpływa na aktywność układu odpornościowego (lata 30-te XX w.)

Rozwój psycho-neuro-immunologii Nadal próbuje się określić : Czy możliwą konsekwencją chronicznego stanu zapalnego jest wzrost apoptozy w układzie nerwowym prowadzącym do neurodegeneracyjnych zmian w mózgu? Czy zmniejszona adaptacja na stres jest główną podstawą rozwoju chorób psychiatrycznych? Czy zwiększona odpowiedz na stres prawą półkulą mózgu wpływa na zwiększoną wrażliwość na bodzce negatywne?

Hydroksyapatyt stanowi mineralne rusztowanie tkanki łącznej, odpowiedzialnej za mechaniczną wytrzymałość kości, minerał zbudowany z hydroksyfosforanu wapnia Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 Homeostaza Ca 2+

Hydroksyapatyt stanowi mineralne rusztowanie tkanki łącznej, odpowiedzialnej za mechaniczną wytrzymałość kości, minerał zbudowany z hydroksyfosforanu wapnia Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 Homeostaza Ca 2+ Homeostaza PO 4 30% Pi

Hydroksyapatyt stanowi mineralne rusztowanie tkanki łącznej, odpowiedzialnej za mechaniczną wytrzymałość kości, minerał zbudowany z hydroksyfosforanu wapnia Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2

PHEX Phosphate-regulating gene with homologies to Endopeptidases on the X chromosom) Gen koduje Zn-metalopeptydazę, Ekspresja w osteoblastach i odontoblastach, Mutacja genu Phex u ludzi powoduje: - krzywicę oporną na witaminę D, - hypofosfatemię, - niski poziom witaminy D, - rozmiękczenie kości, - zmniejszoną aktywność i ekspresję NaPi IIa w kanalikach nerkowych,

Homeostaza Pi MEPE Matrix Extracellular Phosphoglycoprotei n ASARM Acidic- Serine-Aspartate- Rich-MEPE associated motif

Cel pracy Identyfikacja molekularnego mechanizmu hamowania ekspresji genu Phex pod wpływem TNF

Eksperymentalnie wywołany stan zapalny okrężnicy u myszy (colitis) wywołuje obniżenie ekspresji genu Phex (mrna) T-cell transfer colitis model T-cell transfer colitis model SPF WT mice dootrzewnowa iniekcja limfocytów (CD4 + CD45RB high ) IL-10 / WT mice kolonizacja bakteriami Rag-2 mice mała liczba LT TCR-CD4-CD8 8 tygodni colitis

Eksperymentalnie wywołany stan zapalny okrężnicy u myszy (colitis) wywołuje obniżenie ekspresji genu Phex (mrna)

TNF obniża ekspresję genu Phex (mrna) i wpływ ten zachodzi na poziomie transkrypcji UMR-106 TNF RNA RT RT-PCR

TNF nie wpływa w znaczący sposób na poziom apoptozy w komórkach UMR-106 (szczurze osteoblasty*) UMR-106 medium apoptoza (Caspase-Glo 3/7 Assay Systems) cytotoksyczność (ToxiLight BioAssay Kit)

Analiza -133/+1 sekwencji nukleotydowej promotora genu Phex (program Match ), wykazała możliwość występowania miejsc wiążacych czynniki transkrypcyjne ścieżki sygnałowej NF-kB Sekwencja promotora mysiego genu mphex jest bardzo podobna do sekwencji szczurzego promotora rphex

Doświadczenia przy użyciu systemu reporterowego p -GAL wykazały, że element pośredniczący w zależnym od TNF hamowaniu genu rphex, znajduje się bardzo blisko miejsca startu transkrypcji. UMR-106 24h Transfekcja p -GAL + mphex RNA 24h TNF poziom -GAL w lizacie

Użycie metody ChIP wykazało, że TNF hamuje ekspresję genu rphex poprzez zmniejszenie aktywności kompleksu transkrypcyjnego (RNA polimeraza II).

Użycie metody EMSA wykazało, że TNF aktywuje ściężkę sygnałową NF-kB bez zmiany poziomu czynnika trankrypcyjnego AP-1 24h UMR-106 TNF białka jądrowe (NP) NP + znakowane izotopem oligonukleotydy elekroforeza

Użycie metody EMSA i WB wykazało, że po taktowaniu komórek UMR-106 TNF indukowane jest transport białek ścieżki NF-kB takich jak RelA i p50 24h UMR-106 TNF białka jądrowe (NP) WESTERN BLOT EMSA

Użycie metody DAPA wykazało, że białko RelA wiże się do promotora genu mphex przynajmniej w dwóch miejscach -76/-57 oraz -35/-16 UMR-106 24h białka jądrowe (NP) NP + oligonukleotyd WESTERN BLOT

Po stymulacji TNF, białko RelA wiąże się do promotora genu Phex w dwóch miejscach -72/-66 oraz -29/-25

Zahamowanie ścieżki NF-kB przez zastosowanie inhibitora proteasomów odwraca efekt TNF na ekspresje genu Phex (mrna) Ekspresja endogenna rphex System reporterowy p -Gal mphex cl L Inhibitor proteasomalnej degradacji białek

Nadekspresja białka RelA jest wystarczająca do obniżenia ekspresji genu Phex Nadekspresja białek RelA i p50 przy zastosowaniu wektora pcmv z sekwencjami kodującymi ludzki RelA lub p50

Białko RelA homo- (RelA/RelA) lub hetero-dimer (RelA/p50) jest konstytutywnym oraz indukowalnym represorem genu Phex

Białko PARP-1 łączy się z regionem PolyA promotora genu mphex

Poly(ADP-ribosyl)ation Figure 1 Metabolism of poly(adp-ribose) during DNA damage and repair. In response to DNA-strand breaks

Poly(ADP-ribosyl)ation Chromatin superstructure relaxation is mediated by the poly(adpribosyl)ation of histone H1 and H2B tails. Figure 4 PARP-1 in the repair of single-strand breaks. Following the detection of single-strand-dna breaks (SSBs)

Wpływa na strukturę chromatyny, Może być czynnikiem transkrypcyjnym, Poly(ADP-ribosyl)ation Poprzez swoją aktywność PAR-ylację może zmieniać interakcje między białkami, w tym czynników trankrypcyjnych.

Zahamowanie aktywności enzymatycznej PARP-1 prowadzi do odwrócenia a nawet zwiększenia ekspresji mphex 24h Transfekcja -GAL pcmv PARG RNA 24h 3-AB TNF poziom -GAL w lizacie 3-AB inhibitor PARylacji PARG enzym zaangażowany w proces odwrotny do PARylacji

Po potraktowaniu komórek UMR-106 TNF, poziom PARylacji białka RelA zwiększa się 24h TNF białko całkowite lub z jąder komórkowych

Dootrzewnowy zastrzyk TNF powoduje obniżenie ekspresji mphex, efekt ten nie jest widoczny u myszy PARP-1 KO WT mice mtnf PBS PARP-1 KO mtnf PBS kość udowa

Enzymatyczna aktywność PARP-1, związana z modyfikacją (PARylacją) białka RelA, zaangażowana jest w represję promotora Phex