Alchemia epigenetycznej regulacji pluripotencji

Alchemia epigenetycznej regulacji pluripotencji Joanna Bem Iwona Grabowska * Zakład Cytologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, Warszawa * Zakład Cytologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Ilji Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa; tel.: (22) 55 42 203, e-mail: igrabowska@biol.uw.edu.pl Artykuł otrzymano 8 marca 2013 r. Artykuł zaakceptowano 17 kwietnia 2013 r. Słowa kluczowe: chromatyna, epigenetyka, komórki ES, pluripotencja, samoodnawianie, różnicowanie Wykaz skrótów: CpG dinukleotydy CG; CT obszar chromosomowy; komórki ES zarodkowe komórki macierzyste; komórki ips indukowane komórki pluripotencjalne; PcG białka z grupy Polycomb; TrxG białka z grupy Trithorax Podziękowania: Badania prowadzone przez Autorów niniejszej pracy przeglądowej są finansowane ze środków na naukę przyznanych przez MNiSW grant nr: N N303 548139 oraz NCN grant nr: 2012/05/B/NZ1/00024. Szczególne podziękowania kierujemy do Marii Anny Ciemerych-Litwinienko za wsparcie i cenne wskazówki podczas redagowania manuskryptu. STRESZCZENIE Zarodkowe komórki macierzyste (komórki ES) charakteryzują się zdolnością do samoodnawiania swojej populacji oraz pluripotencją, czyli możliwością różnicowania we wszystkie tkanki budujące dorosły organizm. W odpowiednich warunkach hodowli komórki te pozostają niezróżnicowane. Możliwe jest to dzięki aktywności czynników transkrypcyjnych, takich jak Sox2, Nanog, Klf4, Oct4, które odpowiedzialne są za utrzymanie pluripotencji. Za unikalne cechy komórek ES odpowiadają również mechanizmy epigenetyczne, które regulują także funkcjonowanie zróżnicowanych komórek budujących tkanki. Modyfikacje te umożliwiają zarówno intensywną proliferację, jak i zachowanie pluripotencji, a więc utrzymanie komórek ES w stanie ciągłej gotowości do różnicowania. W tej pracy przeglądowej przedstawione zostały takie mechanizmy epigenetyczne jak metylacja DNA, potranslacyjne modyfikacje histonów, remodeling chromatyny zależny od ATP oraz oddziaływania z mirna. Omówiono te procesy, które mają wpływ na pluripotencję i samoodnawianie mysich oraz ludzkich komórek ES. WPROWADZENIE Określenie epigenetyka zostało po raz pierwszy zastosowane w 1942 roku przez Waddingtona, który nazwał w ten sposób procesy pozwalające na powstanie różnych fenotypów komórek pomimo tej samej sekwencji DNA [1]. W latach 90-tych definicja ta została zawężona do modyfikacji w obrębie chromatyny (Ryc. 1), które regulują czas i miejsce ekspresji genów, i które są przekazywane komórce potomnej [2]. Modyfikacje epigenetyczne mogą podlegać dziedziczeniu, nie są jednak związane ze zmianą sekwencji DNA. Zalicza się do nich m.in. metylację DNA, kowalencyjne modyfikacje histonów oraz zależną od ATP przebudowę (ang. remodeling) chromatyny [3]. Modyfikacje epigenetyczne stanowią ślad, który podlegając dziedziczeniu warunkuje tzw. pamięć komórkową oraz zachowanie tożsamości przez komórki zarówno w trakcie rozwoju zarodkowego jak i w tkankach dorosłego organizmu. Regulacja epigenetyczna odgrywa rolę w procesach takich jak: różnicowanie, rozwój zarodkowy, transformacja nowotworowa, czy odpowiedź komórek na stres [4-7]. Niezwykle istotny wpływ regulacji epigenetycznej na losy komórek widoczny jest w trakcie rozwoju zarodkowego ssaków. Z zygoty, na skutek podziałów powstają komórki, dające początek listkom zarodkowym ekto-, endo- i mezodermie, których dalsze różnicowanie umożliwia wykształcenie tkanek dorosłego organizmu. DNA zygoty oraz wyspecjalizowanych komórek tworzących tkanki ma identyczną sekwencję, a ogromna różnorodność komórek budujących dorosły organizm 144 www.postepybiochemii.pl

możliwa jest właśnie dzięki modyfikacjom epigenetycznym, które modulują ekspresję genów kodujących zarówno białka jak i regulatorowe RNA. Zarodkowe komórki macierzyste (komórki ES, ang. embryonic stem cells), uzyskiwane są z przedimplantacyjnych zarodków ssaków, np. z węzłów zarodkowych blastocyst. Unikalne cechy tych komórek sprawiają, że są one doskonałym modelem do badania procesów zachodzących podczas różnicowania. Komórki ES mogą różnicować we wszystkie rodzaje komórek budujących dorosły organizm, cecha ta jest zwana pluripotencją. Ponadto, liczba podziałów, jakie mogą przejść komórki ES jest nieograniczona. Oznacza to, że komórki te są w stanie odnawiać swoją populację niemal w nieskończoność. W związku z tym, przy zachowaniu odpowiednich warunków w trakcie hodowli in vitro (np. w przypadku mysich komórek ES konieczna jest obecność czynnika LIF w pożywce), populacja niezróżnicowanych komórek ES nie ulega wyczerpaniu. Kolejną cechą komórek ES są niezwykle krótkie cykle komórkowe (Ryc. 2) [8,9]. Komórki ES są utrzymywane w stanie niezróżnicowanym dzięki aktywności czynników transkrypcyjnych, takich jak Nanog, Oct4, czy Sox2. Czynniki te regulują ekspresję wielu genów, także tych kodujących enzymy warunkujące modyfikacje epigenetyczne. Wpływają w ten sposób na proliferację i hamują różnicowanie. Podczas powstawania wyspecjalizowanych komórek poziom czynników odpowiedzialnych za utrzymanie pluripotencji ulega obniżeniu. Tempo proliferacji różnicujących komórek zmienia się, inicjowana jest również ekspresja genów odpowiedzialnych za powstawanie określonych tkanek. Jednak od wielu lat wiadomo, że zmiany te są odwracalne. Dowiodły tego zarówno doświadczenia, w których dokonywano transferu jądra komórkowego uzyskanego z komórki somatycznej do oocytu pozbawionego materiału genetycznego, fuzja komórek pluripotencjalnych z komórkami somatycznymi skutkująca powstaniem hybryd komórkowych [10] jak i uzyskanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (komórki ips, ang. induced pluripotent stem cells). Tak więc, zróżnicowane komórki mogą zostać reprogramowane i osiągnąć stan niezróżnicowany [11]. Analiza pluripopostępy Biochemii 59 (2) 2013 tencjalnych komórek ES oraz ips umożliwia poznanie mechanizmów odpowiedzialnych za rozwój zarodków, różnicowanie komórek a także utrzymanie pluripotencji i niezróżnicowanego stanu komórek macierzystych. Jednym z istotnych wątków tych badań jest poznanie roli modyfikacji epigenetycznych w tych procesach. ARCHITEKTURA JĄDRA ORAZ STRUKTURA CHROMATYNY A LOSY KOMÓREK Lokalizacja DNA w obrębie jądra komórkowego jest nieprzypadkowa i wpływa na ekspresję genów. Każdy chromosom zajmuje określony obszar w obrębie jądra komórkowego (CT, ang. chromosome territory) [12]. Rejony aktywne transkrypcyjnie znajdują się obok siebie umożliwiając jednoczesną ekspresję genów zlokalizowanych na różnych chromosomach. Ponadto, uważa się, że w jądrze komórkowym rejony aktywne transkrypcyjnie położone są centralnie, natomiast peryferycznie ułożone fragmenty DNA mogą charakteryzować się niską aktywnością transkrypcyjną. W przypadku mysich komórek ES peryferyczne położenie genów w jądrach nie ma tak hamującego wpływu na ich ekspresję jak dzieje się to w przypadku komórek zróżnicowanych np. fibroblastów [13]. Wiadomo również, że przesunięcie obszaru DNA zawierającego dany gen poza obszar CT może prowadzić do jego zwiększonej ekspresji [12,14,15]. Analizy ludzkich komórek wykazały, że położenie wielu CT zarówno w komórkach ES jak i komórkach somatycznych jest podobne [16,17]. Jednak położenie genów kodujących białka kluczowe dla funkcjonowania komórek ES jest inne niż w jądrach komórek somatycznych. Na przykład, obszar chromosomu 12, w którym znajduje się gen kodujący białko Nanog jest zlokalizowany bardziej centralnie w jądrach komórek ES niż w jądrach ludzkich fibroblastów [16]. Położenie genu POU5F1 kodującego białko Oct4 względem środka jądra komórkowego jest takie samo w komórkach ES jak i w komórkach somatycznych. Jednak w komórkach ES gen ten jest zlokalizowany poza obszarem CT charakterystycznym dla komórek zróżnicowanych. Wiąże się to z wysoką aktywnością transkrypcyjną tego genu [16]. Tak więc, umiejscowienie genów kluczowych dla utrzymania niezróżnicowanego stanu w komórkach ES jest inne niż w komórkach zróżnicowanych. Umożliwia to wysoką eks- 145

presję tych genów, a tym samym warunkuje zachowanie pluripotencji. Wykazano, że podczas różnicowania ludzkich komórek ES położenie genów NANOG oraz POU5F1 zmienia się: fragment DNA zawierający NANOG zajmuje bardziej peryferyczną pozycję w jądrze komórkowym. Gen POU5F1 lokalizuje się natomiast w swoim obszarze CT charakterystycznym dla komórek zróżnicowanych [16,17]. Nie należy także pomijać faktu, że rozluźnienie struktury chromatyny ułatwia replikację materiału genetycznego, a co za tym idzie ma wpływ na proliferację komórek [18,19]. Uważa się, że na przebieg proliferacji komórek ES wpływa także umiejscowienie obszarów centromerowych, łączących ze sobą chromatydy siostrzane. W jądrach komórek ES obszary te są zlokalizowane bardziej centralnie niż w komórkach zróżnicowanych, co prawdopodobnie jest korzystne w komórkach, które intensywnie się dzielą. Podczas różnicowania obszary centromerowe przemieszczają się na peryferie jądra komórkowego [16,20]. Różnice między komórkami zróżnicowanymi, a pluripotencjalnymi komórkami ES manifestują się także na poziomie przedziałów jądra komórkowego. W jądrze komórkowym większości komórek znajdują się wyspecjalizowane obszary, takie jak jąderko, ciałka PML (ang. promyelocytic leukemia nuclear bodies), struktury SC-35 (zwane także splicing speckle ), oraz ciałka Cajala. Struktury te zawierają białka oraz RNA, które pełnią funkcje regulujące m.in. transkrypcję, splicing, potranslacyjne modyfikacje białek oraz ich degradację. W jądrach komórek ES obserwuje się obecność tych samych ciałek, co w komórkach somatycznych. Jednak w komórkach pluripotencjalnych mogą one mieć inny skład lub morfologię. W komórkach ES jąderko, zaangażowane w biogenezę rrna, obfituje w nukleosteminę, GTPazę regulującą aktywność białka p53, które jest czynnikiem transkrypcyjnym uczestniczącym w regulacji syntezy m.in. inhibitora cyklu komórkowego p21cip1 [21,22]. Nukleostemina pośrednio hamuje aktywność p53, przez co zapobiega zahamowaniu cyklu komórkowego. Wyciszenie ekspresji genu kodującego nukleosteminę w komórkach ES hamuje zarówno ich samoodnawianie jak i różnicowanie [21-23]. Natomiast doprowadzając do nadekspresji genów kodujących nukleosteminę, POU5F1 i SOX2, w ludzkich komórkach nabłonka gruczołu mlekowego reprogramowano je w komórki ips [22]. Struktury SC-35 to skupiska czynników związanych z transkrypcją oraz dojrzewaniem mrna. W ich skład wchodzi m.in. SC35 (ang. splicing component, 35 kda), białko biorące udział w powstawaniu spliceosomu i w pierwszych etapach splicingu. W sąsiedztwie struktur SC-35 lokalizują się geny aktywne transkrypcyjnie [24]. W jądrach komórek somatycznych można zlokalizować od 10 do 50 wyraźnych struktur SC-35. W ludzkich komórkach ES białka SC35 są albo rozproszone w nukleoplazmie nie tworząc charakterystycznych ciałek, albo nie są wykrywane [20,25]. Indukcja różnicowania komórek ES powoduje, że struktury SC-35 zaczynają się wyodrębniać [20]. Butler i Lawrence sugerują, że SC-35 to struktury regulujące ekspresję genów specyficznych dla określonych rodzajów zróżnicowanych komórek, dlatego w komórkach pluripotentnych nie są wykrywane [20]. W transkrypcję oraz w splicing zaangażowane są także ciałka Cajala. Charakterystyczne są one zwłaszcza dla komórek, których aktywność metaboliczna jest wysoka, a więc np. dla neuronów czy komórek nowotworowych. Jednak w ludzkich komórkach ES, nie zaobserwowano ciałek Cajala. Koilina, białko charakterystyczne dla tych ciałek jest obecne w jądrach komórek ES, pozostaje jednak rozproszone w nukleoplazmie. Podobnie jak w przypadku SC-35, ciałka Cajala zaczynają być widoczne dopiero w komórkach różnicujących [20]. Ciałka PML to struktury biorące udział w wielu procesach, np. replikacji i naprawie DNA, przebudowie chromatyny, transkrypcji. W komórkach somatycznych w skład ciałek wchodzą takie białka jak Pml (ang. promyelocytic leukemia protein), Sumo-1, Sp100, p53, prb, HP1 oraz Daxx, które są m.in. regulatorami transkrypcji. W komórkach tych obserwuje się od 5 do 30 ciałek PML o charakterystycznym kolistym bądź pierścieniowym kształcie [20,26]. Natomiast, analizy ludzkich komórek ES wykazały różnice zarówno w składzie jak i morfologii ciałek PML w porównaniu do komórek somatycznych. W ludzkich komórkach ES ciałka te są mniej liczne (1 3), większe, tworzą rozgałęzione rozety lub długie pałeczki. Nie zawierają one Sumo-1, Sp100 czy Daxx [20]. Znaczenie tych różnic nie zostało jednak jeszcze wyjaśnione. Pod wpływem czynników indukujących różnicowanie komórek ES ciałka PML upodobniają się do ciałek PML obecnych w jądrach komórek zróżnicowanych [20]. Komórki ES charakteryzują dwie pozornie wykluczające się cechy: zahamowanie ekspresji genów odpowiedzialnych za różnicowanie, przy jednoczesnym utrzymaniu tych genów w stanie ciągłej gotowości, umożliwiającej natychmiastowe niemal podjęcie różnicowania. Uważa się, że te właściwości komórek ES wynikają z unikalnych cech ich chromatyny. W komórce zróżnicowanej chromatyna obejmująca te geny, których ekspresja jest charakterystyczna dla innych rodzajów komórek pozostaje skondensowana w heterochromatynie. Natomiast cechą komórek ES jest to, że w ich jadrze komórkowym dominuje euchromatyna [27]. Prawdopodobnie to dlatego aktywność transkrypcyjna komórek ES jest znacząco wyższa niż komórek, które nie są pluripotencjalne, np. neuronalnych czy hematopoetycznych komórek macierzystych [27,28]. W komórkach ES ekspresji ulegają sekwencje nieaktywne transkrypcyjnie w komórkach zróżnicowanych, takie jak np. satelitarne sekwencje powtórzone występujące w obszarach centromerowych, czy niektóre transpozony [27,29]. W komórkach ES można także wykryć ekspresję, chociaż na bardzo niskim poziomie, genów tkankowo specyficznych. Przykładowo, wykrywano w nich transkrypty genu kodującego miogeninę (MyoG), czyli czynnik transkrypcyjny charakterystyczny dla mięśni szkieletowych, czy też genu Col1a1 (ang. collagen type I alpha), kodującego charakterystyczny dla tkanki łącznej kolagen I [27,28]. Wciąż nie jest jasne, czy niespecyficzna ekspresja tak wielu genów jest konieczna dla prawidłowego funkcjonowania komórek ES (np. umożliwiając produkcję regulatorowych RNA), czy też jest tylko skutkiem ubocznym rozluźnionej struktury chromatyny [27]. W komórkach ES niewiele jest obszarów heterochromatyny, a ich pojawienie się jest związane z procesem różnicowania. Za utrzymanie heterochromatyny odpowiadają 146 www.postepybiochemii.pl

takie białka jak np. HP1 (ang. heterochromatin protein 1). Białko to rozpoznaje modyfikacje histonów, takie jak metylacja H1K26, lub metylacja H3K9, charakterystyczne dla obszarów DNA o niskiej aktywności transkrypcyjnej [30,31]. Ponadto HP1 może oddziaływać z metylotransferazami histonowymi, które katalizują powstawanie H3K9me, przyczyniając się w ten sposób do heterochromatynizacji [31]. W jądrach komórek ES białko HP1 przejściowo oddziałuje z chromatyną, w związku z tym większość białka jest rozproszona w nukleoplazmie [14,32]. Prawdopodobnie pula białka HP1, która pozostaje niezwiązana z chromatyną umożliwia szybką heterochromatynizację towarzyszącą różnicowaniu komórek ES. Jest to dowód na to, że w jądrach komórek ES obecne są czynniki warunkujące gotowość do różnicowania. METYLACJA DNA Metylacja cytozyny jest powszechnie występującą modyfikacją DNA. Polega ona na przyłączeniu reszty metylowej w pozycji 5 pierścienia pirymidynowego cytozyny i najczęściej zachodzi w obrębie powtórzeń dinukleotydów C-G (CpG). W komórkach somatycznych ok. 70-80% wszystkich dinukleotydów CpG ulega metylacji [18]. Metylacja DNA katalizowana jest przez metylotransferazy DNA Dnmt (ang. DNA methyltransferase). W genomie ssaków zidentyfikowano cztery geny kodujące te enzymy (Dnmt1, Dnmt2, Dnmt3a, Dnmt3b). Spośród nich Dnmt3a i Dnmt3b modyfikują DNA de novo, Dnmt1 utrzymuje prawidłową metylację genomu po jego replikacji, natomiast Dnmt2 metyluje trna, przez co stabilizuje te cząsteczki i promuje translację [33-36]. Metylacja sekwencji kodującej lub promotora genu hamuje jego ekspresję [37-39], np. blokując rozpoznanie sekwencji docelowych przez czynniki transkrypcyjne [40-42]. Ponadto ze zmetylowanymi cytozynami specyficznie wiążą się białka z grupy MBD (ang. methyl binding domain), które oddziałują z deacetylazami histonów, enzymami które usuwają acetylowane reszty z N terminalnych końców histonów [43-45]. Przykładowo białko Mbd1 wraz z Hdac3 (ang. histone deacethylase 3) lokalizując się w obszarze promotorowym przyczyniają się do heterochromatynizacji i wyciszenia ekspresji genu [44]. MBD, mogą także oddziaływać z innymi białkami uczestniczącymi w heterochromatynizacji, jak HP1, czy z metylotransferazą lizyny 9 histonu H3 - Suv39h1 [46]. Mogą także wraz z deacetylazami histonowymi oraz białkami z grupy CHD (ang. chromodomain helicase DNA-binding) wchodzić w skład kompleksu NURD, który hamuje ekspresję genów poprzez zwiększenie upakowania nukleosomów [47,48]. Analizy myszy pozbawionych genów kodujących metylotransferazy DNA wykazały, że enzymy te są kluczowe dla rozwoju zarodkowego i funkcjonowania wielu tkanek. Mutacje w genach kodujących Dnmt1 i Dnmt3b są letalne na postimplantacyjnych stadiach rozwoju zarodkowego. W przypadku utraty funkcji Dnmt3a myszy rodzą się, ale przeżywają jedynie około 4 tygodnie [33,49]. Wiadomo, że w przedimplantacyjnych zarodkach myszy poziom metylacji genów jest niższy w porównaniu do komórek organizmów dorosłych. Na tym etapie rozwoju usuwane są reszty metylowe, a globalna demetylacja DNA umożliwia ekspresję genów kluczowych dla pluripotencji. Następnie, jeszcze przed implantacją zarodka dochodzi do ponownej metylacji DNA. Niektóre allele są metylowane w zależności od tego, czy pochodzą od organizmu matczynego czy ojcowskiego, mechanizm ten zwany imprintingiem umożliwia prawidłowy rozwój zarodkowy [38,50,51]. Co ciekawe, choć komórki ES uzyskiwane są z przedimplantacyjnego zarodka, którego genom uległ demetylacji, genom komórek ES jest zmetylowany, co dowodzi że demetylacja DNA nie jest niezbędnym warunkiem do utrzymania stanu pluripotencji [33]. Dodatkowo, cechą komórek ES jest prawie czterokrotnie wyższy poziom metylacji poza dinukleotydami CpG w stosunku do komórek budujących tkanki [52], jednak znaczenie funkcjonalne tej różnicy nie zostało jeszcze zbadane. Podczas różnicowania metylacja w obszarach ubogich w CpG zanika. W komórkach ES geny odpowiedzialne za utrzymanie pluripotencji nie są metylowane, natomiast podczas różnicowania geny kodujące markery pluripotencji Nanog i Oct4 ulegają metylacji, co blokuje ich ekspresję i umożliwia różnicowanie [50,53,54]. Komórki ES pozbawione funkcjonalnego genu kodującego metylotransferazę Dnmt1, lub Dnmt3a, lub Dnmt3b, jak i komórki jednocześnie pozbawione wszystkich tych genów, proliferują i pozostają niezróżnicowane [33,49,54,55]. Jednak w warunkach indukujących różnicowanie komórki te inicjują apoptozę [49,56]. Dane te wskazują, że metylacja DNA nie jest niezbędna do zachowania pluripotencji i samoodnawiania populacji komórek ES. Jest natomiast kluczowa podczas różnicowania. Hipometylacja spowodowana brakiem obu metylotransferaz Dnmt3a, Dnmt3b zaburza różnicowanie komórek ES uniemożliwiając hamowanie ekspresji genów związanych z pluripotencją, kodujących Nanog i Oct4 [53]. MODYFIKACJE HISTONÓW Potranslacyjne modyfikacje histonów stanowią kolejny element epigenetycznej regulacji ekspresji genów. Aminokwasy znajdujące się na N końcach histonów podlegają modyfikacjom, takim jak m.in. acetylacja, metylacja, fosforylacja, ADP-rybozylacja, ubikwitylacja, czy sumoilacja. Modyfikacje te mogą bezpośrednio wpływać na strukturę chromatyny, np. acetylacja lizyn neutralizuje dodatni ładunek histonów, co zmniejsza ich powinowactwo do DNA [57,58]. Zmodyfikowane reszty aminokwasów mogą być także rozpoznawane przez inne białka. Na przykład, kompleksy remodelujące chromatynę typu SWI/SNF, dzięki obecności bromodomeny rozpoznają acetylowane lizyny na N końcach histonów, następnie przesuwają nukleosomy, rozluźniając bądź zwiększając upakowanie struktury chromatyny. W związku ze swoimi właściwościami, niektóre modyfikacje, jak np. acetylacja lizyn (np. H3K9ac) lub trimetylacja lizyny 4 histonu H3 (H3K4me3) uznawane są za aktywatory ekspresji genów. Z kolei metylacja lizyny 27 histonu H3 (H3K27me2/3), katalizowana przez kompleks Polycomb, lub metylacja lizyny 9 histonu H3 (H3K9me), hamują ekspresję genów. Część badaczy uważa, że modyfikacje tworzą rodzaj kodu histonowego, którego zrozumienie pozwoli na odszyfrowanie wzoru ekspresji genów. Jednakże ów kod nie jest jednoznaczny i nie należy tego określenia rozumieć w sposób dosłowny. Wiele modyfikacji może Postępy Biochemii 59 (2) 2013 147

być bowiem wynikiem, a nie powodem zmian ekspresji genów [59]. Potranslacyjne modyfikacje histonów regulują wiele procesów zachodzących w obrębie chromatyny, także replikację oraz naprawę DNA [58]. Wiele enzymów modyfikujących histony jest niezbędnych dla prawidłowego przebiegu rozwoju zarodkowego ssaków. Mutacje w genach Ash2l (ang. absent, small, or homeotic, Drosophila, homolog 2-like) lub Ezh2 (ang. enhancer of zeste) kodujących metylotransferazy histonów, prowadzą do śmierci zarodka myszy [60,61]. Natomiast nieprawidłowa synteza enzymów modyfikujących histony w komórkach dorosłych organizmów może się przyczyniać do transformacji nowotworowej [62]. Zarówno ludzkie jak i mysie komórki ES odróżniają się od komórek różnicujących bądź zróżnicowanych charakterystycznym wzorem modyfikacji histonów. W komórkach ES histony związane z DNA w obszarach promotorowych bądź w okolicach startu transkrypcji wykazują bardzo wysoki poziom acetylacji. Acetylacja lizyny 9 histonu H3 (H3K9) wykrywana jest w obszarze promotorów m.in. Nanog, Pou5f1, oraz cmyc [63-65]. Podczas różnicowania mysich komórek ES następuje deacetylacja H3K9, z czym wiąże się spadek ekspresji tych genów [17,64]. Indukcja różnicowania komórek ES, powoduje globalny spadek acetylacji histonów [65]. Analizy mysich oraz ludzkich komórek ES wskazują, że na wielu sekwencjach promotorowych mogą jednocześnie znajdować się histony podlegające przeciwstawnym modyfikacjom. Są to: hamująca ekspresję metylacja lizyny 27 histonu H3 (H3K27me2/3) oraz aktywująca ekspresję trimetylacja lizyny 4 histonu H3 (H3K4me3). Obszary chromatyny, w których znajdują się takie dwuznaczne modyfikacje zwane są domenami biwalentnymi [63,66,67]. Analizy modyfikacji histonów w ludzkich komórkach ES wykazały, że geny regulowane jedynie dzięki trimetylacji lizyny 4 histonu H3 (H3K4me3) są odpowiedzialne przede wszystkim za syntezę i metabolizm białek oraz regulację cyklu komórkowego. Z kolei występowanie histonów zmodyfikowanych biwalentnie (H3K4me3 oraz H3K27me3) wykazano na wielu promotorach genów związanych z różnicowaniem [67]. O ile większość genów, w obrębie których lokalizuje się H3K4me3 ulega transkrypcji, to geny których ekspresja regulowana jest przez biwalentne modyfikacje histonu H3 są w większości nieaktywne transkrypcyjnie [66,67]. W chromatynie komórek różnicujących lub zróżnicowanych, np. w neuronalnych komórkach progenitorowych, mioblastach, bądź fibroblastach obserwuje się niewielką liczbę domen biwalentnych, stąd wniosek że domeny takie charakteryzują komórki pluripotentne [66,67]. Uważa się, że dzięki obecności domen biwalentnych, możliwe jest wyciszenie ekspresji genów kluczowych dla różnicowania. Jednocześnie dzięki obecności modyfikacji H3K4me3, możliwa jest, w odpowiedzi na sygnały indukujące różnicowanie, szybka ekspresja genów regulujących te procesy. Znaczenie domen biwalentych nie zostało jeszcze potwierdzone w rozwoju zarodkowym ssaków. Ich obecność udokumentowano w zarodkach Danio rerio [68], jednak w chromatynie zarodków Xenopus oraz Drosophila takie domeny nie występują [69,70]. BIAŁKA Z GRUP TRITHORAX ORAZ POLYCOMB Nukleosomy umożliwiają ścisłe upakowanie DNA w jądrze. Stanowią jednak fizyczną barierę dla czynników transkrypcyjnych oraz elementów regulatorowych. Jednym z czynników regulujących dostępność DNA dla białek regulatorowych oraz RNA są wielobiałkowe kompleksy remodelujące chromatynę. Są one odpowiedzialne między innymi za przesuwanie nukleosomów oraz potranslacyjne modyfikacje histonów, które skutkują zmianami w kondensacji chromatyny. Zarówno skład jak i aktywność kompleksów zmieniają się trakcie rozwoju zarodkowego ssaków. Kompleksy remodelujące chromatynę pełnią kluczową rolę w pluripotencji oraz różnicowaniu [71,72]. Wśród białek modulujących strukturę chromatyny wyróżnia się dwie, często przeciwstawnie działające grupy: Trithorax oraz Polycomb. Białka obu rodzin zostały po raz pierwszy opisane na przełomie lat 70- i 80-tych, jako regulatory rozwoju D. melanogaster. Mutacje w genach kodujących te białka znacząco wpływały na rozwój larwalny lub też były letalne. Białka Trithorax warunkują prawidłowy rozwoju segmentów głowy, tułowia oraz odwłoka D. melanogaster, natomiast białka Polycomb uczestniczą w ustaleniu symetrii grzbietowobrzusznej [73,74]. Obie grupy białek regulują ekspresję genów Hox (ang. homeobox), kodujących kluczowe dla rozwoju zarodkowego zwierząt czynniki transkrypcyjne, z rodzin takich jak Pax, Pou, Dlx, Irx, Lhx, Six oraz czynniki z rodzin Gata, Sox, Fox [75]. Wszystkie te geny kodują nadrzędne regulatory sieci transkrypcyjnych regulujących rozwój zarodkowy. Białka Polycomb są znane głównie jako represory ekspresji genów, natomiast białka Trithorax jako aktywatory [74]. BIAŁKA Z GRUPY TRITHORAX Do rodziny Trithorax (trxg, ang. trithorax group) należą m.in. białka wykorzystujące energię z hydrolizy ATP do przemieszczania nukleosomów względem nici DNA. Przesunięcie nukleosomów może spowodować odsłonięcie promotora oraz sekwencji regulatorowych, udostępnienie ich czynnikom transkrypcyjnym i zainicjowanie transkrypcji. Przemieszczenie nukleosomów może także przyczynić się do silniejszego upakowania nukleosomów i w efekcie zahamować ekspresję [3]. Uważa się, że sekwencje umożliwiające rozpoczęcie transkrypcji genów tkankowo specyficznych znajdują się w obrębie nukleosomu, a ich ekspresja wymaga aktywności kompleksów remodelujących chromatynę. W regulacji dostępności tych sekwencji uczestniczą kompleksy remodelujące, w skład których wchodzą niektóre białka TrxG [3,76]. Białka TrxG tworzą wieloskładnikowe kompleksy, które w zależności od rodzaju obecnej w kompleksie ATPazy dzieli się na kompleksy typu SWI/SNF (ang. mate type switching/sucrose non fermentable), CHD (ang. chromodomain helicase DNA-binding), INO80 oraz ISWI (ang. imitation switch) [71,77,78]. Najlepiej zbadanymi kompleksami z rodziny trxg są SWI/SNF, u ssaków należą do nich kompleksy BAF (ang. Brg1 associated factor) oraz P-BAF (ang. Polybromo - and BAF containing). W skład obu kompleksów wchodzą m.in. ATPaza Brm lub Brg1 (ang. Brahma related gene 1), białka wiążące DNA takie jak Baf250 (ang. Brg1 associated factor) oraz białka umożliwiające oddziaływanie z innymi 148 www.postepybiochemii.pl

podjednostkami np. Baf155 lub Baf170 [76]. Białkami specyficznymi dla kompleksów BAF są Baf250a oraz Baf250b, natomiast białka Baf180 i Baf200 są charakterystyczne dla składu P-BAF [76]. Kompleksy SWI/SNF różnią się składem w zależności od rodzaju komórki. Obecnie wiadomo, że w jednej komórce może występować wiele wariantów BAF oraz P-BAF. Ich skład zmienia się pod wpływem lokalnych oddziaływań z czynnikami transkrypcyjnymi [76,79]. Znaczenie kompleksów SWI/SNF w rozwoju oraz różnicowaniu zostało potwierdzone u wszystkich organizmów wyższych, zarówno u roślin jak i u zwierząt. Badania dotyczące roli kompleksów SWI/SNF w rozwoju zarodkowym myszy udokumentowały rolę ich niektórych podjednostek. U myszy delecje genów kodujących Brg1, Snf5 oraz Baf155/ Srg3 są letalne już na stadium blastocysty, a więc przed implantacją, natomiast zarodki pozbawione Baf250a umierają podczas gastrulacji [80-82]. Mutacje w genach kodujących inne podjednostki, jak np. Brm, nie mają wpływu na rozwój zarodkowy myszy [80]. Badania składu kompleksów SWI/ SNF w mysich komórkach ES (tzw. esbaf, ang. embryonic stem BAF), wykazały że jest on podobny do składu kompleksów wykrywanych na wczesnych etapach rozwoju zarodkowego. Analiza z zastosowaniem ChIP-seq oraz ChIP-chip wykonana dla ATPazy BRG1 oraz białka BAF155 wskazała, że w mysich komórkach ES kompleks esbaf oddziałuje z jedną czwartą promotorów wszystkich genów. Obecność tego kompleksu koreluje ponadto z wysoką ekspresją genów docelowych: kodujących białka pozytywnie regulujące cykl komórkowy, odpowiadających za zachowanie pluripotencji oraz samoodnawianie komórek ES. Wśród nich znalazły się geny kodujące Oct4, Sox2, Nanog, Sall4, Rest, Dppa2, Dppa4, a także geny z rodziny Polycomb [83,84]. Na promotorach wielu genów kompleks esbaf kolokalizuje z czynnikami transkrypcyjnymi Oct4, Sox2, Nanog, STAT3, oraz SMAD1, a z niektórymi bezpośrednio oddziałuje, co sugeruje jego zaangażowanie w utrzymanie pluripotencji i samoodnawianie [83,84]. Co ciekawe, esbaf wykrywany był także na promotorach genów o niskiej aktywności transkrypcyjnej, charakterystycznych dla komórek zróżnicowanych [85]. Znaczącą rolę esbaf w pluripotencji potwierdzono w doświadczeniu, w którym reprogramowano komórki somatyczne uzyskując komórki ips poprzez równoczesną nadprodukcję Oct4, Klf4, Sox2, c-myc, Brg1 oraz Baf155 [86]. Zabieg taki znacząco zwiększył efektywność reprogramowania. Wykorzystanie esbaf pozwoliło także na pominięcie onkogenu c-myc [86]. Podczas różnicowania komórek ES synteza podjednostek BAF180 oraz BAF200, które wchodzą w skład kompleksu P-BAF, rośnie. P-BAF bierze udział w heterochromatynizacji promotorów genów kodujących Oct4 oraz Nanog, przyczynia się także do powstania charakterystycznych dla komórek zróżnicowanych skupisk heterochromatyny [87]. Oprócz wyżej opisanych kompleksów SWI/SNF do rodziny białek Trithorax zaliczanych jest także dziewięć białek z grupy CHD (ang. chromodomain helicase DNA-binding). Są to ATPazy zawierające chromodomenę. Niektóre białka CHD mogą tworzyć kompleksy, jak dzieje się to w przypadku Chd3 (tzw. Mi-2α) oraz Chd4 (tzw. Mi-2β), które wchodzą w skład kompleksu NURD (ang. nucleosome remodeling and histone deacetylation). Inne białka CHD, takie jak Chd1 działają jako monomery [48]. Badania charakteryzujące Chd1 u drożdży, D. melanogaster oraz u ssaków, wskazują że białko to aktywuje ekspresję genów poprzez rozluźnienie struktury chromatyny. Za pomocą dwóch chromodomen ATPaza ta rozpoznaje H3K4me2/3, a więc modyfikacje charakterystyczne dla rejonów DNA aktywnych transkrypcyjnie. Przyłączenie się Chd1 do tak zmodyfikowanych histonów zlokalizowanych w obszarach promotorowych powoduje dysocjację nukleosomów, co umożliwia rozpoczęcie transkrypcji [88]. Rola Chd1 w rozwoju zarodkowym ssaków nie została dotychczas poznana [48,88]. Wiadomo jednak, że białko to jest jednym z głównych regulatorów rozluźnionego stanu chromatyny w mysich komórkach ES. Wyciszenie ekspresji genu kodującego Chd1 w tych komórkach powoduje globalną heterochromatynizację powodującą m.in. obniżenie ekspresji genu kodującego czynnik Oct4, co prowadzi do spadku zdolności zarówno do samoodnawiania, jak i do różnicowania tych komórek [89]. Zaburzenia organizacji chromatyny spowodowane wyciszeniem ekspresji genu kodującego Chd1 ograniczają różnicowanie tych komórek w pierwotną endodermę. Ponadto ekspresja genu kodującego Chd1 jest zależna m.in. od Oct4, Sox2 oraz Nanog. W momencie różnicowania i spadku ekspresji tych czynników, zmniejsza się także poziom białka Chd1, co umożliwia heterochromatynizację charakterystyczną dla komórek zróżnicowanych budujących tkanki [89]. Kompleks NURD działa przeciwstawnie do CHD1, uczestniczy bowiem w hamowaniu ekspresji genów. U ssaków w skład NURD oprócz Chd3 i Chd4 mogą wchodzić białka MBD (Mbd2 i Mbd3) oraz deacetylazy histonowe (Hdac1 i Hdac2). Prawdopodobnie ATPazy CHD przesuwając nukleosomy umożliwiają dostęp kompleksu NURD do DNA. Białka MBD umożliwiają natomiast rekrutację kompleksu NURD do zmetylowanego DNA [43,44]. Z kolei deacetylazy histonowe usuwają acetylowane reszty z lizyn histonów rdzeniowych, przez co przyczyniają się do większego skondensowania nukleosomów i inhibicji transkrypcji [48,57,58]. U myszy mutacja w genie kodującym podjednostkę Mbd3, odpowiedzialną za formowanie kompleksu NURD, jest letalna - zarodki obumierają wkrótce po implantacji [47]. Podłoże obserwowanego fenotypu może wiązać się z rolą Mbd3 w różnicowaniu komórek. Mysie komórki ES pozbawione Mbd3 nie wykazują zaburzeń samoodnawiania, jednak charakteryzują się obniżoną zdolnością do różnicowania [90]. Sugeruje to, że NURD nie jest niezbędny do inicjacji różnicowania, odpowiada natomiast za dalsze etapy tego procesu. Mechanizm działania kompleksu NURD w komórkach ES nie został dotychczas wyjaśniony. Wiadomo, że hamowanie ekspresji genów przez NURD nie jest zjawiskiem tak globalnym jak obserwowano to w przypadku aktywacji ekspresji przez Chd1. Rolą kompleksu NURD jest zahamowanie ekspresji genów odpowiedzialnych za pluripotencję, a tym samym umożliwienie różnicowania [90]. Poszukiwanie bezpośrednich partnerów kompleksu NURD doprowadziło do identyfikacji odziaływań między Chd4 i Hdac1, a takimi białkami jak Nanog, Oct4, Sal4, Esrrb, czy c-myc [91,92]. Jednak znaczenie tych oddziaływań w komórkach ssaków wciąż nie jest znane. Postępy Biochemii 59 (2) 2013 149

Innym kompleksem remodelującym chromatynę biorącym udział w utrzymaniu samoodnawiania i pluripotencji, zaliczanym do grupy INO80, jest Tip60-p400. W jego skład wchodzą m.in. ATPaza p400, acetylotransferaza Tip60, oraz białko Dmap1 (ang. Dnmt1 - associated protein). Mysie zarodki pozbawione funkcjonalnego genu Tip60 lub genu Dmap1 umierają przed implantacją [93,94]. Wyciszenie za pomocą sirna ekspresji Dmap1 oraz Tip60 w komórkach ES, powoduje zaburzenia samoodnawiania oraz spadek pluripotencji komórki dzielą się wolniej, nie różnicują. Co ciekawe komórki te eksprymują gen kodujący Oct4 oraz Nanog na poziomie podobnym do kontrolnych komórek ES [93]. Badania te pokazały, że kompleks Tip60-p400 odpowiada za hamowanie genów eksprymowanych podczas różnicowania takich jak Gata6 (ang. GATA binding protein 6) czy Snai1 (ang. snail homolog 1). Kompleks ten kolokalizuje ponadto z czynnikiem transkrypcyjnym Nanog, z którym współdziała w hamowaniu ekspresji genów związanych z różnicowaniem [93]. BIAŁKA Z GRUPY POLYCOMB Białka Polycomb (PcG, ang. polycomb group) są uniwersalnymi represorami genów. U ssaków regulują m.in. różnicowanie oraz pamięć komórkową, regulują także inaktywację chromosomu X [95-97]. Białka PcG tworzą dwa rodzaje kompleksów zwane Polycomb Repressive Complex 1 oraz 2 (PRC1, PRC2). U ssaków PRC1 składa się z czterech rdzeniowych podjednostek Ph, Pc, Psc, oraz dring [98]. Ostatnia z nich jest ligazą ubikwitynową typu E3, która katalizuje monoubikwitylację lizyny 119 histonu H2A (H2AK119u) [99]. Natomiast rdzeń kompleksu PRC2 tworzą białka Eed (ang. embryonic ectoderm development), Suz12 (ang. suppressor of zeste 12 protein homolog) oraz Ezh2. Ezh2 jest metylotransferazą katalizującą metylację lizyny 27 histonu 3 (H3K27me2/3), natomiast białka Eed oraz Suz12 są potrzebne do aktywności Ezh2. Suz12 umożliwia oddziaływanie między Ezh2 i Eed, hamuje również degradacje Ezh2 w proteasomie 26S i jest ponadto niezbędne do aktywności metylotransferazy Ezh2 [60,100,101]. Kompleks białek PcG, modyfikuje N końce histonów znajdujące się w pobliżu genu docelowego, co zmienia strukturę chromatyny i hamuje ekspresję danego obszaru DNA. PRC2 katalizuje di- lub trimetylację lizyny 27 histonu H3. Modyfikacja ta stanowi miejsce wiązania kompleksu PRC1, który z kolei katalizuje ubikwitylację lizyny 119 histonu H2, a co za tym idzie zwiększa upakowanie nukleosomów i powoduje dalszą heterochromatynizację [98,101,102]. Kompleksy PRC1 wiążą się preferencyjnie z promotorami bogatymi w CpG, z domenami biwalentnymi (H3K27me2/3, H3K4me3) lub z trimetylowanymi H3K4me3 [98]. PRC2 zazwyczaj inicjuje represję, natomiast PRC1 uczestniczy w jej stabilizacji. Białka z rodziny Polycomb są niezbędne do prawidłowego rozwoju zarodków ssaków. Mutacje w genach Suz12, Ezh2, lub Eed prowadzą do nieprawidłowego rozwoju i śmierci mysich zarodków, a z blastocyst pozbawionych Ezh2 nie udało się uzyskać komórek ES [60,100,101]. Mutacje w tych genach znacząco obniżają proliferację komórek [101]. W mysich komórkach ES w skład kompleksu PRC2 wchodzą dodatkowo białka Pcl2 (ang. polycomb-like protein 2), oraz Jarid2 (ang. jumonji, AT rich interactive domain 2), które uczestniczą w rekrutacji oraz regulacji aktywności kompleksu [103-106]. Brak kompleksu PRC2 w komórkach ES powoduje przedwczesną ekspresję genów warunkujących różnicowanie i zaburza pluripotencję, nie wpływa jednak znacząco na ich samoodnawianie i podziały [98,107]. Jest to o tyle zaskakujące, że analiza funkcji PRC1 wykazała udział tego kompleksu w regulacji proliferacji. Wiadomo, że hamuje on bezpośrednio ekspresję genu kodującego cyklinę D2, a więc czynnika aktywującego kluczowe dla inicjacji fazy G1 kinazy CDK4/6 (ang. Cyclin dependent kinase 4/6), oraz hamuje ekspresję genu inhibitora kinaz CDK - p57kip2 oraz Gadd45g (ang. growth arrest and DNA-damage-inducible, gamma) [98]. Analizy mysich komórek ES wykazały, że białka kompleksów PRC1 oraz PRC2 występują w obszarach DNA, w których zlokalizowanych jest ponad 500 genów kodujących m.in. czynniki transkrypcyjne oraz regulatory różnicowania i rozwoju zarodkowego, takie jak np. geny Hox [75]. Dzięki temu, że hamowanie ekspresji genów utrzymywana przez kompleksy PRC jest odwracalna, podczas różnicowania może zajść ich ekspresja [75,98]. W mysich oraz ludzkich komórkach ES kompleksy PRC1 oraz PRC2 współdziałają z czynnikami odpowiedzialnymi za utrzymanie pluripotencji. PRC1 współwystępuje z czynnikami Oct4 oraz Nanog, a PRC2 znajdowany jest na promotorach wraz z Oct4, Sox2 i Nanog [98,107]. Pod nieobecność PRC1, czynniki Nanog oraz Oct4 nie są w stanie hamować ekspresji genów kodujących czynniki warunkujące różnicowanie, takie jak Gata3, Eif4g3, Bmp7, Bmi1, czy Gadd45g [98]. Ponadto Walker i jej współpracownicy wykazali, że kompleks PRC2 uczestniczy w regulacji ekspresji genów Pou5f1, Sox2, oraz Nanog. PRC2 metyluje, bowiem lizynę 27 histonu H3 (H3K27) lokalizującego się na promotorach genów Klf4, Tbx3, Foxd3. Produkty tych genów to czynniki aktywujące ekspresję Sox2, Nanog oraz Oct4. Z tego powodu wyciszenie ekspresji podjednostek PRC2 w komórkach ES powoduje obniżenie ich zdolności do różnicowania [106]. Dodatkowo, ekspresja podjednostek kompleksu PRC2 jest regulowana przez czynniki Oct4, Sox2, Nanog, co jest kolejnym dowodem na istnienie sprzężenia zwrotnego regulującego poziom czynników pluripotencji [104,106]. Kompleksy PRC pełnią dwie z pozoru przeciwstawne funkcje: hamując geny różnicowania utrzymują stan pluripotentny, oraz hamując aktywatory pluripotencji takie jak Sox2, Nanog czy Oct4 umożliwiają różnicowanie. Wciąż nie jest pewne co jest czynnikiem przełączającym między stanem pluripotentnym, a inicjacją różnicowania, wiadomo natomiast że kompleksy PRC pełnią kluczową funkcję w utrzymaniu kruchej równowagi między tymi stanami, oraz są niezbędne do podjęcia decyzji dotyczącej różnicowania. MIKRORNA W ZARODKOWYCH KOMÓRKACH MACIERZYSTYCH MikroRNA wpływają na ekspresję wielu genów kodujących regulatory epigenetyczne w tym m.in. metylotransferazy DNA, acetylazy histonów oraz białka Polycomb. Także 150 www.postepybiochemii.pl

ekspresja samych mikrorna podlega regulacji epigenetycznej [108]. W związku z tym mikrorna bywają zaliczane do czynników uczestniczących w regulacji epigenetycznej. MikroRNA to krótkie (21-25 pz), jednoniciowe cząsteczki regulujące stabilność oraz translację mrna. Obecnie wiadomo, że cząsteczki te regulują ekspresję białek kontrolujących wszystkie procesy zachodzące w komórce, w tym także różnicowanie komórek towarzyszące rozwojowi zarodkowemu. Powstawanie mikrorna (mirna) zachodzi wieloetapowo [109,110]. W wyniku transkrypcji genów kodujących mikrorna powstają pierwotne transkrypty tzw. pri-mikrorna (ang. primary microrna). Pri-mikroRNA są cięte przez kompleks białek zwanych Microprocesorem, w którego skład wchodzą m.in. Dgcr8 (ang. DiGeorge syndrome critical region gene 8) oraz RNAza typu III - Drosha. W wyniku cięcia powstaje pre-mikrorna. Początkowe etapy obróbki prekursorów mikrorna odbywają się w jądrze komórkowym, pre-mikrorna jest następnie transportowany przy udziale Eksportyny 5 do cytoplazmy, gdzie w wyniku cięcia kolejną nukleazą Dicer, powstaje dwuniciowa cząsteczka. Jedna z nici dupleksu jest dojrzałym mikrorna. To ona stworzy kompleks z białkiem z rodziny Ago, druga z nici najczęściej ulega degradacji [110]. MikroRNA uczestniczą w potranskrypcyjnym wyciszaniu genów, oddziałując z komplementarnymi fragmentami 3 mrna (3 UTR, ang. untranslated region). Miejscem oddziaływania jest tzw. sekwencja seed, która znajduje się na 5 końcu mikrorna. Związanie mikrorna z transkryptem może prowadzić do zahamowania translacji, bądź do degradacji mrna [110]. Jedno mikrorna może regulować wiele transkryptów docelowych a jeden transkrypt może być celem wielu różnych mikrorna. Znane są mikrorna charakterystyczne zarówno dla komórek niezróżnicowanych np. blastomerów w przedimplantacyjnym zarodku ssaka, komórek ES, komórek podejmujących różnicowanie i tych skrajnie wyspecjalizowanych [111-113]. Dostępnych jest wiele dowodów na udział mikrorna w regulacji pluripotencji oraz samoodnawiania. Wielu z nich dostarczyły analizy komórek ES pozbawionych funkcjonalnych genów kodujących enzymy niezbędne do biogenezy mikrorna. Mutacje w genach kodujących zarówno Dicer, Dgcr8, jak i Drosha powodowały zaburzenia samoodnawiania mysich oraz ludzkich komórek ES. Wstrzymanie syntezy mikrorna powodowało zahamowanie podziałów tych komórek [114-117]. Analizy ekspresji mikrorna w komórkach ES wykazały, że cząsteczki regulujące pluripotencję oraz samoodnawianie należą do zaledwie kilku grup zawierających zbliżone bądź identyczne sekwencje seed. Zarówno w mysich jak i ludzkich komórkach ES wykrywane jest mir-302 [118,119], oraz grupa cząsteczek mir-17/20/106, której odpowiednikiem w ludzkich komórkach ES jest grupa mir-17/92. Grupą mikrorna dominującą w mysich komórkach ES jest mir-290. Do rodziny mir-290 zaliczamy sześć cząsteczek, od mir-290 do mir-295. Są one obecne już w zygocie, najwyższy ich poziom jest wykrywany w blastocyście, spada natomiast podczas różnicowania komórek ES i nie jest obserwowany w tkankach dorosłych organizmów [118,120,121]. Cząsteczki mir-371-373, oraz mir-520 są obecne tylko w ludzkich komórkach ES [118,119,122]. W tych komórkach szczególnie duży udział w całej puli mikrorna stanowią cząsteczki z rodziny mir-302 składającej się z pięciu cząsteczek: mir-302a mir-302d oraz mir-367. Co ciekawe, sekwencje seed grup mir-290 oraz mir-302 różnią się zaledwie jednym nukleotydem [119]. MikroRNA z grupy mir-290 kontrolują samoodnawianie i proliferację komórek ES hamując ekspresję kluczowych regulatorów cyklu komórkowego. Wśród genów, których ekspresja jest regulowana przez te mikrorna są geny kodujące m.in. prb (ang. retinoblastoma suspectibility protein) i pokrewne mu białko p130, które wiążąc czynniki transkrypcyjne z rodziny E2F uniemożliwiają ekspresję cykliny E, a więc kluczowego regulatora fazy S. Wspomniane mikrorna regulują też ekspresję genu kodującego p21cip1 inhibitora CDK [115,120,123]. Obniżają one także poziom kinazy Lats2 (ang. large tumor suppressor, homolog 2), o której wiadomo, że negatywnie reguluje aktywność kompleksu cyklina E/CDK2 [123]. W efekcie możliwa jest wysoka aktywność kinaz CDK, a co za tym idzie możliwe są nieograniczone podziały komórek ES. Funkcje cząsteczek z rodzin mir-290 oraz mir-302 sprawiły, że są one określane jako ESCC mikrorna (ang. ES cell specific cell cycle regulating mirnas) [123]. Tak więc mir-290 pełnią kluczową rolę w regulacji cyklu komórkowego komórek ES. Udowodniono również, że nadekspresja tych cząsteczek hamuje różnicowanie komórek ES w mezodermę oraz komórki linii płciowej, nie powstrzymując różnicowania w inne rodzaje komórek [121]. Analiza roli mir-290 w początkowych etapach różnicowania mysich komórek ES wykazała, że bezpośrednim celem mir-290 jest Dkk1 (ang. Dickkopf-related protein 1), inhibitor ścieżki sygnałowej WNT [124], która reguluje różnicowanie w mezodermę oraz komórki linii płciowej. Nadekspresja mir-290 hamuje ekspresję Dkk1, przez co przyczynia się do zahamowania ekspresji Brachyury, który jest czynnikiem transkrypcyjnym specyficznym dla mezodermy oraz Stella, białka charakterystycznego m. in. dla komórek linii płciowej uczestniczącego w regulacji metylacji [121,125,126]. Ponadto mir-290 i mir-302 działają przeciwstawnie do mikrorna z grupy let-7, o których wiadomo że promują różnicowanie komórek [127,128]. Co ciekawe, let-7g, ulega ekspresji w komórkach pluripotentnych ES (na promotorze tego mikrorna znajdują się Oct4, Sox2, Nanog, Tcf3). Dojrzewanie let-7g jest jednak hamowane przez Lin28, białko, którego synteza znajduje się pod kontrolą tych samych czynników transkrypcyjnych. Dopiero zahamowanie ekspresji Lin28, które następuje podczas różnicowania umożliwia działanie let-7g [129]. MiR-290 oraz mir-302 uczestniczą także w początkowych etapach różnicowania komórek ES, kiedy dochodzi do metylacji promotora genu kodującego Oct4. MikroRNA z tych grup hamują produkcję p130 [120]. Oprócz istotnej roli jaką to białko pełni w regulacji fazy G1 cyklu komórkowego zaangażowane jest ono także w kontrolę procesów różnicowania. Między innymi jest ono inhibitorem metylotransferaz Dnmt3a oraz Dnmt3b odpowiadających za metylację promotora genu kodującego Oct4 [120]. Tak więc w odpowiednich warunkach mikrorna zamiast utrzymywać komórki ES w stanie niezróżnicowanym hamują ekspresję czynników pluripotencji umożliwiając różnicowanie. W hamowaniu ekspresji czynników Postępy Biochemii 59 (2) 2013 151

Rycina 3. Schemat zmian w obrębie chromatyny prowadzących do powstania otwartej struktury chromatyny charakterystycznej dla komórek ES oraz heterochromatyny warunkującej proces różnicowania. pluripotencji uczestniczą również inne mikrorna, wśród nich mir-134, mir-145, mir-296 oraz mir-470 [130,131]. Regulatory pluripotencji takie jak Oct4, Sox2, Nanog, Tcf3 lokalizowane są na promotorach większości mikror- NA eksprymowanych specyficznie i preferencyjnie w mysich i ludzkich komórkach ES, w tym także na promotorach mir-290 oraz mir-302 [129,132]. Część promotorów mikrorna, z którymi oddziałują Oct4, Sox2, Nanog, Tcf3 jest jednak nieaktywna. Spowodowane jest to obecnością na nich białek z grupy Polycomb, oraz wysokim poziomem metylacji H3K27. Ekspresja tych mikrorna jest specyficzna dla określonego kierunku różnicowania [129]. Przykładowo ekspresja mir-9, którego promotor w komórkach ES jest zajmowany przez czynniki warunkujące pluripotencję oraz białka Polycomb, rośnie specyficznie w nerwowych komórkach progenitorowych, w których promotor mir-9 jest wolny od modyfikacji H3K27me2/3 nałożonej przez białka Polycomb [129]. Obecność czynników pluripotencji na promotorach mikrorna charakterystycznych dla komórek różnicujących świadczy więc o gotowości komórek ES do rozpoczęcia różnicowania. PODSUMOWANIE Utrzymanie pluripotencji oraz zdolności do samoodnawiania populacji komórek ES podlega ciągłej regulacji, w której niezwykle istotną rolę pełnią modyfikacje epigenetyczne. Chromatyna komórek ES tworzy unikalne środowisko regulujące ekspresję genów odpowiedzialnych za pluripotencję oraz samoodnawianie. Wyjątkowo wysoka zawartość euchromatyny warunkowana przez kompleksy remodelujące chromatynę, aktywujące ekspresję genów modyfikacje histonów, domeny biwalentne oraz białka odpowiadające za heterochromatynizację obecne w nukleoplazmie, tworzą razem charakterystyczną, tzw. otwartą strukturę chromatyny komórek ES (Ryc. 3). Modyfikacje takie jak acetylacja histonów, metylacja lizyny 4 histonu H3, oraz przebudowa chromatyny przeprowadzana przez Chd1 oraz kompleksy SWI/ SNF, umożliwiają ekspresję genów których produkty regulują proliferację komórek ES. MikroRNA z grup mir-290 oraz mir-302 hamują syntezę m.in. inhibitorów cyklu komórkowego umożliwiając nieograniczone podziały komórek ES. W tym samym czasie kompleksy Polycomb oraz modyfikacje histonów takie jak metylacja lizyny 27 histonu H3 hamują ekspresję genów odpowiedzialnych za różnicowanie. Jednocześnie aktywujące ekspresję genów modyfikacje histonów, takie jak acetylacja lizyn histonów H3 czy H4 oraz metylacja H3K4 utrzymują geny odpowiedzialne za różnicowanie w ciągłej gotowości do ekspresji. Podczas różnicowania komórek ES ich chromatyna przechodzi dramatyczne zmiany, które są możliwe m.in. dzięki białkom HP1. Białka te, wraz z białkami Polycomb, hamują ekspresję genów związanych z pluripotencją, dzięki czemu utrzymują różne typy komórek w stanie zróżnicowanym. Dodatkowo mechanizmy epigenetyczne pełnią często podwójna rolę: np. kompleksy Polycomb oraz mikrorna uczestniczą zarówno w utrzymaniu komórek ES w stanie niezróżnicowanym jak i w inicjacji różnicowania. W niezróżnicowanych komórkach ES hamują one ekspresję genów związanych z różnicowaniem oraz inhibitory cyklu komórkowego i w rezultacie utrzymują stan pluripotentny. W momencie zmiany losu komórki, hamują sprzężenie zwrotne odpowiadające za pluripotencję i umożliwiają różnicowanie. Pytanie co jest czynnikiem przełączającym między pluripotencją a różnicowaniem pozostaje otwarte. PIŚMIENNICTWO 1. Waddington CH (1942) Epigenotype. Endeavour 1: 18-20 2. Haig D (2004) The (dual) origin of epigenetics. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 69: 67-70 3. Clapier CR, Cairns BR (2009) The biology of chromatin remodeling complexes. Annu Rev Biochem 78: 273-304 4. Kiefer JC (2007) Epigenetics in development. Dev Dyn 236: 1144-1156 5. Jones PA, Baylin SB (2007) The epigenomics of cancer. Cell 128: 683-692 6. Ho L, Crabtree GR (2010) Chromatin remodelling during development. Nature 463: 474-484 152 www.postepybiochemii.pl

7. Kawasaki H, Abe H (2012) Epigenetics in cancer and inflammation. Personalized Medicine Universe 1: 7-12 8. Momcilovic O, Navara C, Schatten G (2011) Cell cycle adaptations and maintenance of genomic integrity in embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Results Probl Cell Differ 53: 415-458 9. White J, Dalton S (2005) Cell cycle control of embryonic stem cells. Stem Cell Rev 1: 131-138 10. Jaenisch R, Young R (2008) Stem cells, the molecular circuitry of pluripotency and nuclear reprogramming. Cell 132: 567-582 11. Takahashi K, Yamanaka S (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: 663-676 12. Cremer T, Cremer M (2010) Chromosome territories. Cold Spring Harb Perspect Biol 2: a003889 13. Luo SW, Zhang C, Zhang B, Kim CH, Qiu YZ, Du QS, Mei L, Xiong WC (2009) Regulation of heterochromatin remodelling and myogenin expression during muscle differentiation by FAK interaction with MBD2. EMBO J 28: 2568-2582 14. Schneider R, Grosschedl R (2007) Dynamics and interplay of nuclear architecture, genome organization, and gene expression. Genes Dev 21: 3027-3043 15. Deniaud E, Bickmore WA (2009) Transcription and the nuclear periphery: edge of darkness? Curr Opin Genet Dev 19: 187-191 16. Wiblin AE, Cui W, Clark AJ, Bickmore WA (2005) Distinctive nuclear organisation of centromeres and regions involved in pluripotency in human embryonic stem cells. J Cell Sci 118: 3861-3868 17. Bartova E, Galiova G, Krejci J, Harnicarova A, Strasak L, Kozubek S (2008) Epigenome and chromatin structure in human embryonic stem cells undergoing differentiation. Dev Dyn 237: 3690-3702 18. Audit B, Zaghloul L, Vaillant C, Chevereau G, d Aubenton-Carafa Y, Thermes C, Arneodo A (2009) Open chromatin encoded in DNA sequence is the signature of master replication origins in human cells. Nucleic Acids Res 37: 6064-6075 19. Di Paola D, Rampakakis E, Chan MK, Zannis-Hadjopoulos M (2012) Differential chromatin structure encompassing replication origins in transformed and normal cells. Genes Cancer 3: 152-176 20. Butler JT, Hall LL, Smith KP, Lawrence JB (2009) Changing nuclear landscape and unique PML structures during early epigenetic transitions of human embryonic stem cells. J Cell Biochem 107: 609-621 21. Lo D, Lu H (2010) Nucleostemin: Another nucleolar Twister of the p53-mdm2 loop. Cell Cycle 9: 3227-3232 22. Qu J, Bishop JM (2012) Nucleostemin maintains self-renewal of embryonic stem cells and promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency. J Cell Biol 197: 731-745 23. Hirai H, Romanova L, Kellner S, Verma M, Rayner S, Asakura A, Kikyo N (2010) Post-mitotic role of nucleostemin as a promoter of skeletal muscle cell differentiation. Biochem Biophys Res Commun 391: 299-304 24. Lawrence JB, Clemson CM (2008) Gene associations: true romance or chance meeting in a nuclear neighborhood? J Cell Biol 182: 1035-1038 25. Zegalo M, Wiland E, Kurpisz M (2006) Topology of chromosomes in somatic cells. Part 1. Postepy Hig Med Dosw (Online) 60: 331-342 26. de The H, Le Bras M, Lallemand-Breitenbach V (2012) The cell biology of disease: Acute promyelocytic leukemia, arsenic, and PML bodies. J Cell Biol 198: 11-21 27. Efroni S, Duttagupta R, Cheng J, Dehghani H, Hoeppner DJ, Dash C, Bazett-Jones DP, Le Grice S, McKay RD, Buetow KH, Gingeras TR, Misteli T, Meshorer E (2008) Global transcription in pluripotent embryonic stem cells. Cell Stem Cell 2: 437-447 28. Golan-Mashiach M, Dazard JE, Gerecht-Nir S, Amariglio N, Fisher T, Jacob-Hirsch J, Bielorai B, Osenberg S, Barad O, Getz G, Toren A, Rechavi G, Itskovitz-Eldor J, Domany E, Givol D (2005) Design principle of gene expression used by human stem cells: implication for pluripotency. Faseb J 19: 147-149 29. Macia A, Munoz-Lopez M, Cortes JL, Hastings RK, Morell S, Lucena-Aguilar G, Marchal JA, Badge RM, Garcia-Perez JL (2011) Epigenetic control of retrotransposon expression in human embryonic stem cells. Mol Cell Biol 31: 300-316 30. Ruan J, Ouyang H, Amaya MF, Ravichandran M, Loppnau P, Min J, Zang J (2012) Structural basis of the chromodomain of Cbx3 bound to methylated peptides from histone h1 and G9a. PLoS One 7: e35376 31. Bannister AJ, Zegerman P, Partridge JF, Miska EA, Thomas JO, Allshire RC, Kouzarides T (2001) Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature 410: 120-124 32. Meshorer E, Yellajoshula D, George E, Scambler PJ, Brown DT, Misteli T (2006) Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells. Dev Cell 10: 105-116 33. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E (1999) DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 99: 247-257 34. Li E, Bestor TH, Jaenisch R (1992) Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality. Cell 69: 915-926 35. Bestor TH (2000) The DNA methyltransferases of mammals. Hum Mol Genet 9: 2395-2402 36. Tuorto F, Liebers R, Musch T, Schaefer M, Hofmann S, Kellner S, Frye M, Helm M, Stoecklin G, Lyko F (2012) RNA cytosine methylation by Dnmt2 and NSun2 promotes trna stability and protein synthesis. Nat Struct Mol Biol 19: 900-905 37. Irvine RA, Lin IG, Hsieh CL (2002) DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Mol Cell Biol 22: 6689-6696 38. Latham T, Gilbert N, Ramsahoye B (2008) DNA methylation in mouse embryonic stem cells and development. Cell Tissue Res 331: 31-55 39. Kass SU, Landsberger N, Wolffe AP (1997) DNA methylation directs a time-dependent repression of transcription initiation. Curr Biol 7: 157-165 40. Prendergast GC, Ziff EB (1991) Methylation-sensitive sequence-specific DNA binding by the c-myc basic region. Science 251: 186-189 41. Kovesdi I, Reichel R, Nevins JR (1987) Role of an adenovirus E2 promoter binding factor in E1A-mediated coordinate gene control. Proc Natl Acad Sci USA 84: 2180-2184 42. Bednarik DP, Duckett C, Kim SU, Perez VL, Griffis K, Guenthner PC, Folks TM (1991) DNA CpG methylation inhibits binding of NF- -kappa B proteins to the HIV-1 long terminal repeat cognate DNA motifs. New Biol 3: 969-976 43. Nan X, Ng HH, Johnson CA, Laherty CD, Turner BM, Eisenman RN, Bird A (1998) Transcriptional repression by the methyl-cpg- -binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex. Nature 393: 386-389 44. Villa R, Morey L, Raker VA, Buschbeck M, Gutierrez A, De Santis F, Corsaro M, Varas F, Bossi D, Minucci S, Pelicci PG, Di Croce L (2006) The methyl-cpg binding protein MBD1 is required for PML-RARalpha function. Proc Natl Acad Sci USA 103: 1400-1405 45. Hendrich B, Tweedie S (2003) The methyl-cpg binding domain and the evolving role of DNA methylation in animals. Trends Genet 19: 269-277 46. Fujita N, Watanabe S, Ichimura T, Tsuruzoe S, Shinkai Y, Tachibana M, Chiba T, Nakao M (2003) Methyl-CpG binding domain 1 (MBD1) interacts with the Suv39h1-HP1 heterochromatic complex for DNA methylation-based transcriptional repression. J Biol Chem 278: 24132-24138 47. Kaji K, Nichols J, Hendrich B (2007) Mbd3, a component of the NuRD co-repressor complex, is required for development of pluripotent cells. Development 134: 1123-1132 48. Murawska M, Brehm A (2011) CHD chromatin remodelers and the transcription cycle. Transcription 2: 244-253 49. Lei H, Oh SP, Okano M, Juttermann R, Goss KA, Jaenisch R, Li E (1996) De novo DNA cytosine methyltransferase activities in mouse embryonic stem cells. Development 122: 3195-3205 Postępy Biochemii 59 (2) 2013 153

50. Farthing CR, Ficz G, Ng RK, Chan CF, Andrews S, Dean W, Hemberger M, Reik W (2008) Global mapping of DNA methylation in mouse promoters reveals epigenetic reprogramming of pluripotency genes. PLoS Genet 4: e1000116 51. Monk M, Boubelik M, Lehnert S (1987) Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extraembryonic and germ cell lineages during mouse embryo development. Development 99: 371-382 52. Ramsahoye BH, Biniszkiewicz D, Lyko F, Clark V, Bird AP, Jaenisch R (2000) Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a. Proc Natl Acad Sci USA 97: 5237-5242 53. Li JY, Pu MT, Hirasawa R, Li BZ, Huang YN, Zeng R, Jing NH, Chen T, Li E, Sasaki H, Xu GL (2007) Synergistic function of DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b in the methylation of Oct4 and Nanog. Mol Cell Biol 27: 8748-8759 54. Fouse SD, Shen Y, Pellegrini M, Cole S, Meissner A, Van Neste L, Jaenisch R, Fan G (2008) Promoter CpG methylation contributes to ES cell gene regulation in parallel with Oct4/Nanog, PcG complex, and histone H3 K4/K27 trimethylation. Cell Stem Cell 2: 160-169 55. Tsumura A, Hayakawa T, Kumaki Y, Takebayashi S, Sakaue M, Matsuoka C, Shimotohno K, Ishikawa F, Li E, Ueda HR, Nakayama J, Okano M (2006) Maintenance of self-renewal ability of mouse embryonic stem cells in the absence of DNA methyltransferases Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b. Genes Cells 11: 805-814 56. Panning B, Jaenisch R (1996) DNA hypomethylation can activate Xist expression and silence X-linked genes. Genes Dev 10: 1991-2002 57. Bannister AJ, Kouzarides T (2011) Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res 21: 381-395 58. Kouzarides T (2007) Chromatin modifications and their function. Cell 128: 693-705 59. Liu CL, Kaplan T, Kim M, Buratowski S, Schreiber SL, Friedman N, Rando OJ (2005) Single-nucleosome mapping of histone modifications in S. cerevisiae. PLoS Biol 3: e328 60. O Carroll D, Erhardt S, Pagani M, Barton SC, Surani MA, Jenuwein T (2001) The polycomb-group gene Ezh2 is required for early mouse development. Mol Cell Biol 21: 4330-4336 61. Stoller JZ, Huang L, Tan CC, Huang F, Zhou DD, Yang J, Gelb BD, Epstein JA (2010) Ash2l interacts with Tbx1 and is required during early embryogenesis. Exp Biol Med (Maywood) 235: 569-576 62. Chi P, Allis CD, Wang GG (2010) Covalent histone modifications-- -miswritten, misinterpreted and mis-erased in human cancers. Nat Rev Cancer 10: 457-469 63. Azuara V, Perry P, Sauer S, Spivakov M, Jorgensen HF, John RM, Gouti M, Casanova M, Warnes G, Merkenschlager M, Fisher AG (2006) Chromatin signatures of pluripotent cell lines. Nat Cell Biol 8: 532-538 64. Krejci J, Uhlirova R, Galiova G, Kozubek S, Smigova J, Bartova E (2009) Genome-wide reduction in H3K9 acetylation during human embryonic stem cell differentiation. J Cell Physiol 219: 677-687 65. Markowetz F, Mulder KW, Airoldi EM, Lemischka IR, Troyanskaya OG (2010) Mapping dynamic histone acetylation patterns to gene expression in nanog-depleted murine embryonic stem cells. PLoS Comput Biol 6: e1001034 66. Bernstein BE, Mikkelsen TS, Xie X, Kamal M, Huebert DJ, Cuff J, Fry B, Meissner A, Wernig M, Plath K, Jaenisch R, Wagschal A, Feil R, Schreiber SL, Lander ES (2006) A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell 125: 315-326 67. Zhao XD, Han X, Chew JL, Liu J, Chiu KP, Choo A, Orlov YL, Sung WK, Shahab A, Kuznetsov VA, Bourque G, Oh S, Ruan Y, Ng HH, Wei CL (2007) Whole-genome mapping of histone H3 Lys4 and 27 trimethylations reveals distinct genomic compartments in human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 1: 286-298 68. Vastenhouw NL, Zhang Y, Woods IG, Imam F, Regev A, Liu XS, Rinn J, Schier AF (2010) Chromatin signature of embryonic pluripotency is established during genome activation. Nature 464: 922-926 69. Akkers RC, van Heeringen SJ, Jacobi UG, Janssen-Megens EM, Francoijs KJ, Stunnenberg HG, Veenstra GJ (2009) A hierarchy of H3K4me3 and H3K27me3 acquisition in spatial gene regulation in Xenopus embryos. Dev Cell 17: 425-434 70. Schuettengruber B, Ganapathi M, Leblanc B, Portoso M, Jaschek R, Tolhuis B, van Lohuizen M, Tanay A, Cavalli G (2009) Functional anatomy of polycomb and trithorax chromatin landscapes in Drosophila embryos. PLoS Biol 7: e13 71. de la Serna IL, Ohkawa Y, Imbalzano AN (2006) Chromatin remodelling in mammalian differentiation: lessons from ATP-dependent remodellers. Nat Rev Genet 7: 461-473 72. Schuettengruber B, Chourrout D, Vervoort M, Leblanc B, Cavalli G (2007) Genome regulation by polycomb and trithorax proteins. Cell 128: 735-745 73. Ingham PW (1985) A clonal analysis of the requirement for the trithorax gene in the diversification of segments in Drosophila. J Embryol Exp Morphol 89: 349-365 74. Kennison JA, Tamkun JW (1988) Dosage-dependent modifiers of polycomb and antennapedia mutations in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA 85: 8136-8140 75. Boyer LA, Plath K, Zeitlinger J, Brambrink T, Medeiros LA, Lee TI, Levine SS, Wernig M, Tajonar A, Ray MK, Bell GW, Otte AP, Vidal M, Gifford DK, Young RA, Jaenisch R (2006) Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells. Nature 441: 349-353 76. Ryme J, Asp P, Bohm S, Cavellan E, Farrants AK (2009) Variations in the composition of mammalian SWI/SNF chromatin remodelling complexes. J Cell Biochem 108: 565-576 77. Ebbert R, Birkmann A, Schuller HJ (1999) The product of the SNF2/ SWI2 paralogue INO80 of Saccharomyces cerevisiae required for efficient expression of various yeast structural genes is part of a high- -molecular-weight protein complex. Mol Microbiol 32: 741-751 78. Schuettengruber B, Martinez AM, Iovino N, Cavalli G (2011) Trithorax group proteins: switching genes on and keeping them active. Nat Rev Mol Cell Biol 12: 799-814 79. Kaeser MD, Aslanian A, Dong MQ, Yates JR, 3rd, Emerson BM (2008) BRD7, a novel PBAF-specific SWI/SNF subunit, is required for target gene activation and repression in embryonic stem cells. J Biol Chem 283: 32254-32263 80. Bultman S, Gebuhr T, Yee D, La Mantia C, Nicholson J, Gilliam A, Randazzo F, Metzger D, Chambon P, Crabtree G, Magnuson T (2000) A Brg1 null mutation in the mouse reveals functional differences among mammalian SWI/SNF complexes. Mol Cell 6: 1287-1295 81. Kim JK, Huh SO, Choi H, Lee KS, Shin D, Lee C, Nam JS, Kim H, Chung H, Lee HW, Park SD, Seong RH (2001) Srg3, a mouse homolog of yeast SWI3, is essential for early embryogenesis and involved in brain development. Mol Cell Biol 21: 7787-7795 82. Gao X, Tate P, Hu P, Tjian R, Skarnes WC, Wang Z (2008) ES cell pluripotency and germ-layer formation require the SWI/SNF chromatin remodeling component BAF250a. Proc Natl Acad Sci USA 105: 6656-6661 83. Kidder BL, Palmer S, Knott JG (2009) SWI/SNF-Brg1 regulates self- -renewal and occupies core pluripotency-related genes in embryonic stem cells. Stem Cells 27: 317-328 84. Ho L, Ronan JL, Wu J, Staahl BT, Chen L, Kuo A, Lessard J, Nesvizhskii AI, Ranish J, Crabtree GR (2009) An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esbaf, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency. Proc Natl Acad Sci USA 106: 5181-5186 85. Ho L, Jothi R, Ronan JL, Cui K, Zhao K, Crabtree GR (2009) An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esbaf, is an essential component of the core pluripotency transcriptional network. Proc Natl Acad Sci USA 106: 5187-5191 86. Singhal N, Graumann J, Wu G, Arauzo-Bravo MJ, Han DW, Greber B, Gentile L, Mann M, Scholer HR (2010) Chromatin-Remodeling Components of the BAF Complex Facilitate Reprogramming. Cell 141: 943-955 154 www.postepybiochemii.pl

87. Schaniel C, Ang YS, Ratnakumar K, Cormier C, James T, Bernstein E, Lemischka IR, Paddison PJ (2009) Smarcc1/Baf155 couples self- -renewal gene repression with changes in chromatin structure in mouse embryonic stem cells. Stem Cells 27: 2979-2991 88. Persson J, Ekwall K (2010) Chd1 remodelers maintain open chromatin and regulate the epigenetics of differentiation. Exp Cell Res 316: 1316-1323 89. Gaspar-Maia A, Alajem A, Polesso F, Sridharan R, Mason MJ, Heidersbach A, Ramalho-Santos J, McManus MT, Plath K, Meshorer E, Ramalho-Santos M (2009) Chd1 regulates open chromatin and pluripotency of embryonic stem cells. Nature 460: 863-868 90. Kaji K, Caballero IM, MacLeod R, Nichols J, Wilson VA, Hendrich B (2006) The NuRD component Mbd3 is required for pluripotency of embryonic stem cells. Nat Cell Biol 8: 285-292 91. Koch HB, Zhang R, Verdoodt B, Bailey A, Zhang CD, Yates JR, 3rd, Menssen A, Hermeking H (2007) Large-scale identification of c-myc-associated proteins using a combined TAP/MudPIT approach. Cell Cycle 6: 205-217 92. Liang J, Wan M, Zhang Y, Gu P, Xin H, Jung SY, Qin J, Wong J, Cooney AJ, Liu D, Songyang Z (2008) Nanog and Oct4 associate with unique transcriptional repression complexes in embryonic stem cells. Nat Cell Biol 10: 731-739 93. Fazzio TG, Huff JT, Panning B (2008) An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity. Cell 134: 162-174 94. Mohan KN, Ding F, Chaillet JR (2011) Distinct roles of DMAP1 in mouse development. Mol Cell Biol 31: 1861-1869 95. Bracken AP, Dietrich N, Pasini D, Hansen KH, Helin K (2006) Genome-wide mapping of Polycomb target genes unravels their roles in cell fate transitions. Genes Dev 20: 1123-1136 96. Richly H, Aloia L, Di Croce L (2011) Roles of the Polycomb group proteins in stem cells and cancer. Cell Death Dis 2: e204 97. Casanova M, Preissner T, Cerase A, Poot R, Yamada D, Li X, Appanah R, Bezstarosti K, Demmers J, Koseki H, Brockdorff N (2011) Polycomblike 2 facilitates the recruitment of PRC2 Polycomb group complexes to the inactive X chromosome and to target loci in embryonic stem cells. Development 138: 1471-1482 98. van der Stoop P, Boutsma EA, Hulsman D, Noback S, Heimerikx M, Kerkhoven RM, Voncken JW, Wessels LF, van Lohuizen M (2008) Ubiquitin E3 ligase Ring1b/Rnf2 of polycomb repressive complex 1 contributes to stable maintenance of mouse embryonic stem cells. PLoS One 3: e2235 99. Buchwald G, van der Stoop P, Weichenrieder O, Perrakis A, van Lohuizen M, Sixma TK (2006) Structure and E3-ligase activity of the Ring-Ring complex of polycomb proteins Bmi1 and Ring1b. Embo J 25: 2465-2474 100. Faust C, Lawson KA, Schork NJ, Thiel B, Magnuson T (1998) The Polycomb-group gene eed is required for normal morphogenetic movements during gastrulation in the mouse embryo. Development 125: 4495-4506 101. Pasini D, Bracken AP, Jensen MR, Lazzerini Denchi E, Helin K (2004) Suz12 is essential for mouse development and for EZH2 histone methyltransferase activity. Embo J 23: 4061-4071 102. Cao R, Wang L, Wang H, Xia L, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Jones RS, Zhang Y (2002) Role of histone H3 lysine 27 methylation in Polycomb-group silencing. Science 298: 1039-1043 103. Li G, Margueron R, Ku M, Chambon P, Bernstein BE, Reinberg D (2010) Jarid2 and PRC2, partners in regulating gene expression. Genes Dev 24: 368-380 104. Walker E, Chang WY, Hunkapiller J, Cagney G, Garcha K, Torchia J, Krogan NJ, Reiter JF, Stanford WL (2010) Polycomb-like 2 associates with PRC2 and regulates transcriptional networks during mouse embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell 6: 153-166 105. Li X, Isono K, Yamada D, Endo TA, Endoh M, Shinga J, Mizutani- -Koseki Y, Otte AP, Casanova M, Kitamura H, Kamijo T, Sharif J, Ohara O, Toyada T, Bernstein BE, Brockdorff N, Koseki H (2011) Mammalian polycomb-like Pcl2/Mtf2 is a novel regulatory component of PRC2 that can differentially modulate polycomb activity both at the Hox gene cluster and at Cdkn2a genes. Mol Cell Biol 31: 351-364 106. Walker E, Manias JL, Chang WY, Stanford WL (2011) PCL2 modulates gene regulatory networks controlling self-renewal and commitment in embryonic stem cells. Cell Cycle 10: 45-51 107. Lee TI, Jenner RG, Boyer LA, Guenther MG, Levine SS, Kumar RM, Chevalier B, Johnstone SE, Cole MF, Isono K, Koseki H, Fuchikami T, Abe K, Murray HL, Zucker JP, Yuan B, Bell GW, Herbolsheimer E, Hannett NM, Sun K, Odom DT, Otte AP, Volkert TL, Bartel DP, Melton DA, Gifford DK, Jaenisch R, Young RA (2006) Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells. Cell 125: 301-313 108. Sato F, Tsuchiya S, Meltzer SJ, Shimizu K (2011) MicroRNAs and epigenetics. FEBS J 278: 1598-1609 109. Axtell MJ, Westholm JO, Lai EC (2011) Vive la difference: biogenesis and evolution of micrornas in plants and animals. Genome Biol 12: 221 110. Kim VN, Han J, Siomi MC (2009) Biogenesis of small RNAs in animals. Nat Rev Mol Cell Biol 10: 126-139 111. Tang F, Kaneda M, O Carroll D, Hajkova P, Barton SC, Sun YA, Lee C, Tarakhovsky A, Lao K, Surani MA (2007) Maternal micrornas are essential for mouse zygotic development. Genes Dev 21: 644-648 112. Krichevsky AM, King KS, Donahue CP, Khrapko K, Kosik KS (2003) A microrna array reveals extensive regulation of micror- NAs during brain development. Rna 9: 1274-1281 113. Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, Meyer J, Lendeckel W, Tuschl T (2002) Identification of tissue-specific micrornas from mouse. Curr Biol 12: 735-739 114. Wang Y, Medvid R, Melton C, Jaenisch R, Blelloch R (2007) DGCR8 is essential for microrna biogenesis and silencing of embryonic stem cell self-renewal. Nat Genet 39: 380-385 115. Qi J, Yu JY, Shcherbata HR, Mathieu J, Wang AJ, Seal S, Zhou W, Stadler BM, Bourgin D, Wang L, Nelson A, Ware C, Raymond C, Lim LP, Magnus J, Ivanovska I, Diaz R, Ball A, Cleary MA, Ruohola- -Baker H (2009) micrornas regulate human embryonic stem cell division. Cell Cycle 8: 3729-3741 116. Wang Y, Blelloch R (2011) Cell cycle regulation by micrornas in stem cells. Results Probl Cell Differ 53: 459-472 117. Murchison EP, Partridge JF, Tam OH, Cheloufi S, Hannon GJ (2005) Characterization of Dicer-deficient murine embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 102: 12135-12140 118. Houbaviy HB, Murray MF, Sharp PA (2003) Embryonic stem cell- -specific MicroRNAs. Dev Cell 5: 351-358 119. Suh MR, Lee Y, Kim JY, Kim SK, Moon SH, Lee JY, Cha KY, Chung HM, Yoon HS, Moon SY, Kim VN, Kim KS (2004) Human embryonic stem cells express a unique set of micrornas. Dev Biol 270: 488-498 120. Sinkkonen L, Hugenschmidt T, Berninger P, Gaidatzis D, Mohn F, Artus-Revel CG, Zavolan M, Svoboda P, Filipowicz W (2008) MicroRNAs control de novo DNA methylation through regulation of transcriptional repressors in mouse embryonic stem cells. Nat Struct Mol Biol 15: 259-267 121. Zovoilis A, Smorag L, Pantazi A, Engel W (2009) Members of the mir-290 cluster modulate in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Differentiation 78: 69-78 122. Laurent LC, Chen J, Ulitsky I, Mueller FJ, Lu C, Shamir R, Fan JB, Loring JF (2008) Comprehensive microrna profiling reveals a unique human embryonic stem cell signature dominated by a single seed sequence. Stem Cells 26: 1506-1516 123. Wang Y, Baskerville S, Shenoy A, Babiarz JE, Baehner L, Blelloch R (2008) Embryonic stem cell-specific micrornas regulate the G1-S transition and promote rapid proliferation. Nat Genet 40: 1478-1483 124. Semenov MV, Zhang X, He X (2008) DKK1 antagonizes Wnt signaling without promotion of LRP6 internalization and degradation. J Biol Chem 283: 21427-21432 125. Sato M, Kimura T, Kurokawa K, Fujita Y, Abe K, Masuhara M, Yasunaga T, Ryo A, Yamamoto M, Nakano T (2002) Identification Postępy Biochemii 59 (2) 2013 155

of PGC7, a new gene expressed specifically in preimplantation embryos and germ cells. Mech Dev 113: 91-94 126. Lindsley RC, Gill JG, Kyba M, Murphy TL, Murphy KM (2006) Canonical Wnt signaling is required for development of embryonic stem cell-derived mesoderm. Development 133: 3787-3796 127. Melton C, Blelloch R (2010) MicroRNA Regulation of Embryonic Stem Cell Self-Renewal and Differentiation. Adv Exp Med Biol 695: 105-117 128. Melton C, Judson RL, Blelloch R (2010) Opposing microrna families regulate self-renewal in mouse embryonic stem cells. Nature 463: 621-626 129. Marson A, Levine SS, Cole MF, Frampton GM, Brambrink T, Johnstone S, Guenther MG, Johnston WK, Wernig M, Newman J, Calabrese JM, Dennis LM, Volkert TL, Gupta S, Love J, Hannett N, Sharp PA, Bartel DP, Jaenisch R, Young RA (2008) Connecting microrna genes to the core transcriptional regulatory circuitry of embryonic stem cells. Cell 134: 521-533 130. Xu N, Papagiannakopoulos T, Pan G, Thomson JA, Kosik KS (2009) MicroRNA-145 regulates OCT4, SOX2, and KLF4 and represses pluripotency in human embryonic stem cells. Cell 137: 647-658 131. Tay Y, Zhang J, Thomson AM, Lim B, Rigoutsos I (2008) MicroR- NAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation. Nature 455: 1124-1128 132. Card DA, Hebbar PB, Li L, Trotter KW, Komatsu Y, Mishina Y, Archer TK (2008) Oct4/Sox2-regulated mir-302 targets cyclin D1 in human embryonic stem cells. Mol Cell Biol 28: 6426-6438 The alchemy epigenetic regulation of pluripotency Joanna Bem, Iwona Grabowska * Department of Cytology, Faculty of Biology, University of Warsaw, 1 Ilji Miecznikowa St., 02-096 Warsaw, Poland * e-mail: igrabowska@biol.uw.edu.pl Key words: chromatin, epigenetics, ES cells, pluripotency, self-renewing, differentiation ABSTRACT Embryonic stem cells (ESCs) self renew their population, also they are pluripotent which means they can differentiate into any given cell type. In specific culture conditions they remain undifferentiated. On the cellular level pluripotency is determined by many transcription factors, e.g. Sox2, Nanog, Klf4, Oct4. Epigenetic regulation is also crucial for both self renewal and pluripotency. This review focuses on epigenetic mechanisms, among them DNA methylation, posttranslational histone modifications, ATP dependent chromatin remodeling and mirnas interactions. These mechanisms affect embryonic stem cells functions keeping them poised for differentiation. 156 www.postepybiochemii.pl