Biologia medyczna II, materiały dla studentów kierunku lekarskiego

Przepływ informacji genetycznej Centralny dogmat biologii molekularnej opisuje przepływ informacji genetycznej pomiędzy biopolimerami (kwasy nukleinowe, białka). Wersja I Wersja II F. Crick, 1958 Gdy informacja genetyczna dostanie się do białka, nie może wrócić do kwasu nukleinowego co oznacza: przepływ informacji genetycznej jest możliwy pomiędzy kwasami nukleinowymi lub z kwasu nukleinowego do białka; przepływ informacji pomiędzy białkami lub od białka do kwasu nukleinowego nie jest możliwy. J. Watson, 1965. Molecular biology of the gene. Przepływ informacji genetycznej następuje zawsze od przez RNA do białka. Wersja Watsona jest uproszczeniem i stanowi tylko jedną z możliwości przepływu informacji. Prof. dr hab. Roman Zielinski 1

Przepływ informacji genetycznej Informacja genetyczna jest przekazywana następnym pokoleniom w wyniku procesu replikacji. Jest to przekaz pionowy. Replikacja Gen Transkrypcja w jądrze Gamety Translacja mrna Białko Cecha sobniki Informacja genetyczna u osobników jest przekazywana z kwasu nukleinowego do białek, które warunkują fenotyp. Jest to przekaz poziomy. Replikacja 1. Zasady replikacji Definicja Model semikonserwatywny Kierunek replikacji Fragmenty kazaki Widełki replikacyjne 2. Inicjacja Początek replikacji Denaturacja łańcucha Startery replikacji 3. Elongacja Polimerazy Replisom 4. Sekwencjonowanie Prof. dr hab. Roman Zielinski 2

1. Zasady replikacji: definicja Replikacja to proces, w którym podwójna spirala jest kopiowana i powstają dwie identyczne cząsteczki. Replikacja poprzedza mejozę i proces tworzenia gamet. Replikacja jest podstawą dziedziczenia: przekazywania cech potomstwu. Pyłek sosny na wodzie. Pylniki cebuli. Plemnie i sporofity u Pellia. Różnicowanie kalusa u Lolium temulentum. Somatyczne embriony u bawełny. Replikacja zachodzi w komórkach somatycznych. Poprzedza mitozę i jest podstawą rozwoju i wzrostu organizmów. U Prokariota 500-1000 par zasad jest replikowane w ciągu sekundy. U Eukariota tempo replikacji jest 10-krotnie niższe i wynosi 50 par zasad na sekundę. 1. Zasady replikacji: semikonserwatywna Replikacja jest semikonserwatywna co oznacza, że zsyntetyzowana kopia zawiera jedną nić wyjściową i jedną nową. TACGAACCGGCATTT ATGCTTGGCCGTAAA TACGAACCGGCATTT Cząsteczka wyjściowa ATGCTTGGCCGTAAA nici wyjściowe ( stare ) TACGAACCGGCATTT nici nowo zsyntetyzowane ATGCTTGGCCGTAAA Replikujący plazmid Salmonella typhimurium Każda z dwóch nici cząsteczki jest matrycą do syntezy nowej nici. W wyniku replikacji jednej cząsteczki powstają dwie cząsteczki potomne. Prof. dr hab. Roman Zielinski 3

1. Zasady replikacji: semikonserwatywna Wykorzystanie izotopu azotu N 15 pozwoliło eksperymentalnie udowodnić semikonserwatywny mechanizm replikacji. E.coli: z N 15 Pożywka z N 14 Replikacja i podział I Replikacja i podział II 2 kopie, każda zawiera łańcuch z N 15 i łańcuch z N 14 Izolacja i wirowanie w gradiencie chlorku cezu pozwala rozróżnić niewielkie różnice w gęstości. 4 kopie, 2 mają łańcuch z N 15 i łańcuch z N 14 2 mają łańcuchy tylko z N 14 z N 15 z N 15 i N 14 z N 14 z N 15 i N 14 Fotografia pokazująca różnice w gęstości w kolejnych pokoleniach po podziałach E. coli (Meselson i Stahl 1958). Doświadczenie Meselsona i Stahla było pierwszym eksperymentalnym dowodem potwierdzającym strukturę opisaną przez Watsona i Crick a oraz mechanizm replikacji. 1. Zasady replikacji: kierunek Wiązanie fosfodiestrowe łączy nukleotydy. Powstaje ono pomiędzy grupami w pozycji i pentozy w kolejnych nukleotydach. P Grupa w pozycji pierwszego nukleotydu i grupa w reszcie fosforanowej w pozycji drugiego nukleotydu tworzą wiązanie fosfodiestrowe. P P P C 2 4 C C C 2 4 C C Zasada azotowa 1 C1 2 C Zasada azotowa 2 C1 2 C P 2 cząsteczki P 4 3- C 2 4 C C Reakcja syntezy : (dnmp) n + dntp (dnmp) n+1 P Zasada azotowa 1 C1 2 C C 2 4 C C Zasada azotowa 1 C1 2 C + 2P Prof. dr hab. Roman Zielinski 4

1. Zasady replikacji: kierunek Tworzenie wiązania fosfodiestrowego determinuje kierunek replikacji in vivo: zawsze od końca do końca nowej nici. C G ACTT Nić sensowna Przyjęto zasadę, że górną nić zapisuje się od końca. kreśla się ją jako nić sensowną. Nić sensowna ma taką samą sekwencję jak mrna. AATATACCGGCTGAA TTATATGGCCGACTT AATA Nić antysensowna T A Sekwencje zdeponowane w bankach genów (np. NCBI) zawsze podane są od końca. Nowa nić jest syntetyzowana w kierunku na matrycy ( stara nić ) o przeciwnej orientacji czyli. Zapewnia to tworzenie kopii o niciach antyrównoległych (różna orientacja). Zapis fragmentu sekwencji r myszy w bazie NCBI. 1. Zasady replikacji: kierunek Replikacja jest katalizowana przez polimerazy, które dodają nukleotydy do końca nowej nici (kierunek do ). Starter RNA dntp Polimeraza : matryca Dimery złożone z podjednostek β-polimerazy III E. coli tworzą kleszcze wokół. Model przestrzenny polimerazy faga T7. Polimerazy nie mają zdolności katalizowania reakcji przyłączania nukleotydów do końca. Ma to konsekwencje w sposobie replikacji obu nici. Prof. dr hab. Roman Zielinski 5

1. Zasady replikacji: fragmenty kazaki Polimerazy syntetyzują jednocześnie na obu niciach, ale łańcuch jest wydłużany w kierunkach przeciwnych. Polimeraza może poruszać się tylko w kierunku od do. Dlatego synteza na jednej nici odbywa się w sposób ciągły, a na drugiej w postaci fragmentów. Nić wiodąca Nić opóźniona Replikacja w postaci fragmentów jest bardziej złożona, polimeraza musi się zatrzymywać a następnie ponownie rozpoczynać replikację. Powoduje to opóźnienie w stosunku do nici syntetyzowanej w sposób ciągły. Nić wiodąca to nić replikowana w sposób ciągły. Nić opóźniona to nić replikowana w postaci fragmentów. 1. Zasady replikacji: fragmenty kazaki Fragmenty kazaki, to krótkie fragmenty syntetyzowane przez polimerazę na nici opóźnionej a następnie łączone. Doświadczenie kazaki: Komórki E. coli znakowano radioaktywnie poprzez hodowlę na pożywce przez krótki okres (10-600 s). Znakowane wyizolowano i określono jego ruchliwość podczas wirowania w gradiencie sacharozy. Na podstawie ruchliwości określono długość fragmentów. Fragmenty kazaki mają 1000-2000 nukleotydów u Prokariota i 100-200 u Eukariota. kazaki et al. 1968 Poziom radioaktywności Szczep dziki Krótkie fragmenty Długie fragmenty Mutant: brak aktywności ligazy Krótkie fragmenty Ruchliwość względna (odległość od góry probówki) U szczepów dzikich (aktywna ligaza) krótkie fragmenty pojawiały się tylko w początkowej fazie (do 30 s). U mutantów bez ligazy replikacja prowadziła głównie do krótkich odcinków. Prof. dr hab. Roman Zielinski 6

1. Zasady replikacji: widełki replikacyjne Widełki replikacyjne poruszają się w dwóch kierunkach od miejsca inicjacji replikacji (model dwukierunkowy). PRKARITA EUKARITA oric miejsca inicjacji nić wiodąca nić opóźniona nić wiodąca nić opóźniona nić opóźniona nić wiodąca nić opóźniona nić wiodąca Widełki 1 Widełki 2 W1 W2 W3 W4 Kierunek ruchu widełek replikacyjnych Widełki replikacyjne u Escherichia coli. Widełki replikacyjne u drożdży Replikacja kończy się, gdy widełki poruszające się w przeciwnych kierunkach spotykają się. 1. Zasady replikacji: przemysł Na skalę przemysłową syntetyzowane są krótkie fragmenty, np. oligonukleotydy do reakcji PCR, sekwencjonowania itd. Synteza oligonukleotydów prowadzona jest na stałym podłożu, do którego są one kowalentnie przyczepione. Syntetyzer oligonukleotydów, Fisher Chemicals. CPG: pory szklane o średnicy 50 nm, IDT technologies. Specjalnie przygotowany polistyren może być wykorzystany jako trwałe podłoże do syntezy oligonukleotydów. Synteza oligonukleotydów z wykorzystaniem stałego podłoża może być prowadzona w którymkolwiek kierunku ( lub ) ze względu na odpowiednią modyfikację nukleotydów. Najczęściej prowadzi się ją w kierunku. Prof. dr hab. Roman Zielinski 7

Replikacja 1. Zasady replikacji Definicja Model semikonserwatywny Kierunek replikacji Fragmenty kazaki Widełki replikacyjne 2. Inicjacja Początek replikacji Denaturacja łańcucha Startery replikacji 3. Elongacja Polimerazy Replisom 4. Sekwencjonowanie 2. Inicjacja: początek replikacji Replikon to odcinek, który jest replikowany z jednego miejsca inicjacji replikacji. Miejsce inicjacji jest bogate w pary AT. Miejsce inicjacji replikacji u Prokariota: ri C (origin). 13-mery powtórzone tandemowo Miejsca przyłączenia białek inicjatorowych (DnaA) Kompleks DnaA i ATP destabilizuje wiązania wodorowe w 13- merach, co pozwala na przyłączenie kolejnych białek i rozpoczęcie replikacji. 1 13 GATCTNTTTATTT 17 29 GATCTNTTNTATT Sekwencja 13-merów w ric u Escherichia coli. 32 44 GATCTCTTATTAG U bakterii występuje jedno miejsce inicjacji replikacji - cały chromosom jest replikonem. U Archaea i Eukariota jest wiele miejsc inicjacji replikacji wiele replikonów. Prof. dr hab. Roman Zielinski 8

2. Inicjacja: początek replikacji U Eukariota inicjacja może zachodzić w różnym czasie w poszczególnych miejscach. rganizm Liczba replikonów Długość replikonu [kb] Prędkość replikacji [bp/s] Escherichia coli (bakteria) 1 4 200 830 Saccharomyces cerevisiae (drożdże) Drosophila melanogaster (muszka owocowa) Xenopus laevis (płaz) Mus musculus (mysz) Vicia faba (bób) 500 40 60 3 500 40 45 15 000 200 10 25 000 150 40 35 000 300? Widełki replikacyjne Prokariota poruszają się szybciej. Czas replikacji całego genomu jest krótszy u Eukariota ze względu na wiele widełek replikacyjnych. 2. Inicjacja: denaturacja nici Replikacja może zajść tylko, gdy nici w podwójnej helisie są rozplecione na skutek zerwania wiązań wodorowych. elikazy: rozdzielają nici poprzez hydrolizę wiązań wodorowych przy pomocy ATP. Białka SSB: stabilizują jednoniciowe fragmenty. Topioizomerazy (np. gyraza) usuwają superskręty z i umożliwiają działanie enzymu. musi wykonać pełen obrót (360 o ) co 10 nukleotydów. Szkielet cukrowofosforanowy Przyłączenie podjednostek helikazy do i zerwanie wiązań wodorowych. Zasady azotowe Białka SSB Przyłączenie pierwszego monomeru białek SSB do nici promuje przyłączenie następnych tak, że w krótkim czasie cała nić jest pokryta białkami SSB. Domena A Domena B elikazy uczestniczą we wszystkich procesach, gdzie niezbędne jest rozplecenie nici kwasów nukleinowych. U Eukariota stanowią one 1% wszystkich genów. Prof. dr hab. Roman Zielinski 9

3. Inicjacja: startery replikacji Polimerazy nie mogą inicjować syntezy de novo. Mogą jedynie dodawać nukleotydy do już istniejących łańcuchów. TTATATGGCCGACTT AAUA Prymaza (polimeraza RNA) TTATATGGCCGACTT Starter RNA Polimeraza TTATATGGCCGACTT AAUA TACCGG Wolna grupa na końcu TTATATGGCCGACTT AATATACCGG Usunięcie starterów RNA i dosyntetyzowanie powstałych luk przez polimerazę Starter RNA Rolę starterów w procesie replikacji in vivo pełnią krótkie fragmenty RNA o długości 10-60 nukleotydów. Struktura krystaliczna prymazy człowieka 1. Zasady replikacji Definicja Model semikonserwatywny Kierunek replikacji Fragmenty kazaki Widełki replikacyjne 2. Inicjacja Początek replikacji Denaturacja łańcucha Startery replikacji 3. Elongacja Polimerazy Replisom 4. Sekwencjonowanie Replikacja Prof. dr hab. Roman Zielinski 10

3. Elongacja: polimerazy U bakterii występuje kilka polimeraz (I, II i III), które pełnią różne funkcje. Polimerazy E. coli pol I pol II pol III Struktura Monomer Monomer eteromultimer Liczba cząsteczek w komórce 400 100 10 Prędkość (bp/s) 16-20 2-5 250-1000 Locus pola polb Funkcja Synteza Naprawa Naprawa polc (dnae), dnan, dnax, dnaq, dnat Replikacja Wszystkie polimerazy mogą przyłączać nukleotydy tylko do wolnej grupy na końcu oligonukleotydowego startera. 3. Elongacja: polimerazy Co najmniej 15 różnych polimeraz występuje u Eukariota. Należą one do 5 rodzin białkowych o ograniczonym podobieństwie. Polimerazy ssaków (drożdży) α (I) δ (II) ε (III) β γ Rodzina B B B X A Lokalizacja Jądro Jądro Jądro Jądro Inicjacja Synteza Funkcja fragmentów kazaki Aktywność egzonukleazy ( ) Elongacja, synteza nici wiodącej Elongacja Naprawa Naprawa Mitochondria Replikacja mitochondrialnego Nie Tak Tak Nie Tak Polimerazy należące do rodziny B odpowiadają za replikację chromosomów, polimerazy rodziny A są podobne do polimeraz bakteryjnych i odpowiadają za replikację i naprawę w mitochondrium. Prof. dr hab. Roman Zielinski 11

Biologia medyczna II, materiały dla studentów kierunku lekarskiego 3. Elongacja: polimerazy, jony metalu Jony metalu (magnezu lub manganu) są niezbędne do działania polimeraz. Starter RNA Jon metalu (M2+) współdziała z wolną grupą na końcu startera. NTP Grupa P4 z NTP ba jony współdziałają z grupą P4 z trójfosforanu nukleotydowego (NTP). Grupa P4 rozciąga się między jonami metalu i tworzy most. Brak jonów metalu uniemożliwia elongację. Dlatego niezbędnym składnikiem buforów do łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) są jony metalu, najczęściej magnezu (Mg). 3. Elongacja: polimerazy, struktura Wszystkie bakteryjne polimerazy będące monomerami mają podobną strukturę przestrzenną: kciuk-dłoń-palec. Polimeraza I posiada właściwości korektorskie dzięki aktywności egzonukleazy w kierunku oraz. Kciuk Palec Palec Kciuk Dłoń Dłoń Polimeraza I E. coli składa się z fragmentu Klenowa oraz małej domeny. Fragment Klenowa to domena odpowiedzialna za syntezę. Małą domena odpowiedzialna jest za aktywność egzonukleazy w kierunku. Struktura polimerazy I u E. coli. Fragment Klenowa to polimeraza I E. coli pozbawiona małej domeny czyli właściwości egzonukleazy w kierunku. Jest to jeden z pierwszych enzymów wykorzystywanych w replikacji in vitro. Prof. dr hab. Roman Zielinski 12

3. Elongacja: polimeraza III Polimeraza III E. coli jest odpowiedzialna za wydłużanie łańcucha. Jest to holoenzym zbudowany z 10 podjednostek. oloenzym polimerazy III: α - podjednostki polimerazy, odpowiadają za ciągłą syntezę (elongację); ε - podjednostki o funkcji egzonukleazy w kierunku, odpowiadają za właściwości korektorskie; δ2 - zapobiega oddzieleniu polimerazy od, β2 - tworzy ślizgający się zacisk. Model holoenzymu polimerazy III składa się z dwóch dimerów. Ślizgający się zacisk otacza nić i umożliwia przemieszczanie się holoenzymu polimerazy III. oloenzym polimerazy III E. coli tworzą dwa asymetryczne dimery, jeden dla nici wiodącej i jeden dla nici opóźnionej. 3. Elongacja: replisom Replisom: wielobiałkowy kompleks, który prowadzi replikację od miejsca inicjacji replikacji. RNA Prymaza: polimeraza RNA Pol III: polimeraza III DnaB: helikaza główna SSB: białka stabilizujące Replisom E. coli Replisom obejmuje białka rozplatające (helikazy, SSB, topioizomerazy), syntetyzujące startery (prymaza: polimeraza RNA), polimerazę III oraz usuwające startery RNA (RNA-aza) i łączące fragmenty (ligazy). Prof. dr hab. Roman Zielinski 13

Replikacja 1. Zasady replikacji Definicja Model semikonserwatywny Kierunek replikacji Fragmenty kazaki Widełki replikacyjne 2. Inicjacja Początek replikacji Denaturacja łańcucha Startery replikacji 3. Elongacja Polimerazy Replisom 4. Sekwencjonowanie 4. Sekwencjonowanie Wszystkie współczesne metody sekwencjonowania wykorzystują łańcuchową reakcję polimerazy, PCR. 1975: metoda Sangera polega na terminacji wydłużanego łańcucha, wymaga namnożenia np. za pomocą klonowania lub PCR, obecnie jedyna metoda powszechnie stosowana. 1977: metoda Maxama i Gilberta opiera się na chemicznej degradacji łańcucha za pomocą odczynników specyficznych dla danej zasady. Nie wymagała namnażanie (klonowania), ale okazała się trudna do automatyzacji. Prototypowy sekwenator Sangera z 1987 r. NovaSeq 6000, jeden z najnowszych typów sekwenatorów pozwalający na uzyskanie 6 Tbp w ciągu 48 h. A dotykowy ekran; B sekwenator, czytnik C zestaw odczynników D odpady. Sekwencjonowanie umożliwia poznanie struktury i funkcji genów, struktury genomów oraz ewolucję organizmów żywych. Prof. dr hab. Roman Zielinski 14

4. Sekwencjonowanie Metoda sekwencjonowania Sangera polega na terminacji syntezy w pozycji, w której został wbudowany zmodyfikowany nukleotyd. - - - C 2 zasada - P P P C Modyfikacja nukleotydu polega na zamianie grupy w pozycji deoksyrybozy na. dideoksynukleotyd ddntp C C C Polimeraza może przyłączać nukleotydy tylko do wolnej grupy na końcu. Zastąpienie grupy atomem wodoru uniemożliwia przyłączenie nukleotydu przez polimerazę. Wstawienie dideoksynukleotydu do syntetyzowanego łańcucha uniemożliwia przyłączenie następnego nukleotydu, w efekcie synteza łańcucha ulega zakończeniu terminacji. 4. Sekwencjonowanie Pierwszym etapem sekwencjonowania metodą Sangera jest powielenie przy pomocy PCR. A G C T G A G C A T C G T C G A C T C G T A G C Znana sekwencja, na podstawie której projektuje się starter. Fragment, który chcemy zsekwencjonować. Denaturacja T C G A C T C G T A G C Przyłączenie startera Starter T C G A C T C G T A G C Polimeraza Taq rozpoczyna syntezę fragmentu, który chcemy zsekwencjonować przyłączając nukleotydy do startera. Do tego momentu reakcja przebiega jak typowy PCR. Prof. dr hab. Roman Zielinski 15

4. Sekwencjonowanie Sekwencjonowanie fragmentu wymaga przeprowadzenia 4 specyficznych reakcji PCR, po jednej dla nukleotydów z A, C, G, T. W reakcji PCR specyficznej dla adeniny, A uczestniczą: matryca sekwencjonowany ; starter komplementarny do znanej sekwencji; termostabilna polimeraza ; deoksynukleotydy datp, dctp, dgtp, dttp (podobnie jak w typowej reakcji PCR); dodatkowo dideoksynukleotyd ddatp, znakowany izotopowo lub fluorescencyjnie. Starter Starter Starter Starter A A A dda G C G C G C T G A G C dda Wstawienie ddatp powoduje zakończenie syntezy łańcucha. T G A G C T G dda dda Wstawienie ddatp jest losowe. Prowadzi to do powstania fragmentów o różnej długości. W reakcji PCR specyficznej dla adeniny uczestniczy dideoksynukleotyd ddatp, w reakcji dla cytozyny ddctp, guaniny ddgtp, tyminy ddttp. 4. Sekwencjonowanie Produkty reakcji PCR z dideoksynukleotydami (ddntp) rozdziela się na żelu poliakrylamidowym. T C G A Początek żelu + G C T A C G A G T C G A Produkty najkrótsze poruszają się najszybciej. Starter Kierunek odczytu Pierwsza zasada od startera. Prof. dr hab. Roman Zielinski 16

4. Sekwencjonowanie W automatycznych sekwenatorach dideoksynukleotydy znakowane są fluorescencyjne i odczytywane w programie komputerowym. Autoradiogram otrzymany w wyniku manualnego sekwencjonowania i znakowania izotopowego. Dla każdej próby są 4 ścieżki odpowiadające reakcjom dla A, C, G, T. Chromatogram otrzymany w wyniku sekwencjonowania automatycznego i znakowania fluorescencyjnego. Każdemu nukleotydowi odpowiada inny kolor, np. zielony dla A. Zielony pik oznacza, że w tym miejscu jest A, niebieski C itd. 4. Sekwencjonowanie Współczesne sekwenatory umożliwiają sekwencjonowanie całych genomów w stosunkowo krótkim czasie. CLUSTAL umożliwia porównanie wielu sekwencji. Narzędzia do analizy danych oparte o PYTN. Narzędzia do składania sekwencji uzyskanych w projektach sekwencjonowania genomów. Narzędzia do analizy struktury genów, poszukiwania promotorów, sygnałów poliadenylacji itd. Do analizy sekwencji uzyskanych w wyniku sekwencjonowania niezbędne są zaawansowane narzędzia bioinformatyczne i algorytmy obliczeniowe. Prof. dr hab. Roman Zielinski 17

Zagadnienia 1-3 1. Przepływ informacji genetycznej Czy stwierdzenie, że przepływ informacji genetycznej zawsze występuje od do RNA i białka jest prawidłowe? Jakie procesy są związane z pionowym przepływem informacji genetycznej? Jakie procesy obejmuje poziomy przepływ informacji genetycznej? Podaj z jakim typem przepływu informacji genetycznej jest związana replikacja, powstawanie gamet, transkrypcja, translacja. 2. Zasady replikacji: definicja Zdefiniuj replikację. Gdzie i kiedy zachodzi replikacja? Podaj przykłady. Jaki proces genetyczny poprzedza wzrost i rozwój organizmów? 3. Zasady replikacji: semikonserwatywna Wyjaśnij na czym polega semikonserwatywny mechanizm replikacji. Jeżeli każdą z nici cząsteczki oznaczymy jako A (AA cząsteczka dwuniciowa), a każdą z nowo syntetyzowanych nici oznaczymy jako B, to jak opiszemy cząsteczkę powstałą w wyniku replikacji cząsteczki AA? Jaki pierwiastek wykorzystano do wykazania semikonserwatywnego mechanizmu replikacji? Dlaczego różnice w masie atomowej pomiędzy N 14 i N 15 mogły pomóc w udowodnieniu semikonserwatywnego mechanizmu replikacji? Na czym polegało doświadczenie Meselsona i Stahla? Zagadnienia 4-5 4. Zasady replikacji: kierunek Pomiędzy którymi grupami powstaje wiązanie fosfodiestrowe łączące nukleotydy (pozycja C w pentozie)? W jakiej pozycji znajduje się wolna grupa na początku cząsteczki, a w jakiej na końcu? Podaj kierunek replikacji. Wyjaśnij z czego wynika taki kierunek? Jak zorientowana jest matryca, na której przebiega replikacja? Dzięki czemu zapewniona jest antyrównoległość łańcuchów podczas replikacji? Do którego końca polimeraza przyłącza nukleotydy, czy? Czy polimerazy mogą prowadzić replikację w dowolnym kierunku? Co to jest nić sensowna? Jaka jest orientacja sekwencji w bankach genów? 5. Zasady replikacji: fragmenty kazaki Na ilu niciach jednocześnie polimeraza prowadzi replikację? Wyjaśnij pojęcia: nić wiodąca i nić opóźniona? Dlaczego jedna z nici jest syntetyzowana w postaci fragmentów? Co to są fragmenty kazaki? Narysuj schemat replikacji z uwzględnieniem nici wiodącej i opóźnionej. Prof. dr hab. Roman Zielinski 18

Zagadnienia 6-7 6. Zasady replikacji: widełki replikacyjne Jak poruszają się widełki replikacyjne? Kiedy kończy się replikacja? Co oznacza, że replikacja jest dwukierunkowa? Czy replikacja na skalę przemysłową odbywa się tak samo jak w naturze? W jakim kierunku prowadzi się najczęściej replikację w procesach przemysłowych? 7. Inicjacja: początek replikacji Co to jest replikon? Który organizm ma więcej replikonów: prątek gruźlicy czy jęczmień; Escherichia coli czy człowiek? Co to jest miejsce ric? Kto ma dłuższy replikon: człowiek czy bakteria? U którego organizmu widełki replikacyjne (replikacja) poruszają się najszybciej: E. coli, drożdże, żaba, człowiek? Czyj genom zostanie szybciej zreplikowany: E. coli czy drożdży? uzasadnij odpowiedź. Czy replikacja u Eukariota może zachodzić w wielu miejscach jednocześnie? Uzasadnij odpowiedź. W ilu miejscach jednocześnie zachodzi replikacja u prątka gruźlicy a w ilu u człowieka? Zagadnienia 8-10 8. Inicjacja: denaturacja nici Jakie procesy muszą poprzedzić syntezę przez polimerazy? Jaką funkcję pełnią helikazy? Jaką funkcję pełnią białka SSB? Które enzymy usuwają superskręty w? Jak stabilizowana jest pojedyncza nić (ss) podczas replikacji? Co to są topioizomerazy? 9. Inicjacja: startery replikacji Czy polimerazy mogą rozpoczynać syntezę łańcucha od nowa (de novo)? Dlaczego w replikacji uczestniczy polimeraza RNA (prymaza)? Jakie cząsteczki pełnią funkcję starterów w replikacji? Jaka jest funkcja RNA w replikacji? 10.Elongacja: polimerazy Ile polimeraz występuje u bakterii? Czy wszystkie polimerazy bakterii pełnią taką samą funkcję? Która bakteryjna polimeraza odpowiada za replikację? Która polimeraza usuwa startery RNA? Prof. dr hab. Roman Zielinski 19

Zagadnienia 11-13 11.Elongacja: polimerazy Ile polimeraz występuje u Eukariota? U kogo jest więcej polimeraz : człowieka czy drożdży, drożdży czy prątka gruźlicy, człowieka czy E. coli? Które polimerazy Eukariota są podobne do polimeraz bakteryjnych? Która rodzina polimeraz Eukariota odpowiada za replikację chromosomów? Jaką funkcję pełnią eukariotyczne polimerazy należące do rodziny A, a jaką do rodziny B? 12.Elongacja: polimerazy, jony metalu Jakie składniki nieorganiczne są niezbędne do działania polimeraz? Jaka jest rola jonów magnezu i/lub manganu w replikacji? Dlaczego w mieszaninie reakcyjnej w reakcji PCR znajdują się jony magnezu? 13.Elongacja: polimerazy, struktura Jak najprościej można opisać strukturę przestrzenną polimeraz? Z czym związane jest pojęcie: kciuk-dłoń-palec? Z czym związana jest aktywność egzonuleazy polimeraz? Co odpowiada za właściwości korektorskie polimeraz? Co to jest fragment Klenowa? Jaki enzym był najwcześniej wykorzystywany w replikacji in vitro? Zagadnienia 14-17 15.Elongacja: polimeraza III Która polimeraza jest odpowiedzialna za wydłużanie łańcucha u E. coli? Co oznacza, że polimeraza III jest holoenzymem? Jaka cecha polimerazy III umożliwia jednoczesną syntezę na nici wiodącej i opóźnionej? Co oznacza pojęcie ślizgający się zacisk? mów funkcje głównych podjednostek polimerazy III. Które podjednostki polimerazy III tworzą ślizgający się zacisk? Która podjednostka polimerazy III odpowiada za elongację łańcucha? Dlaczego polimeraza III nie odpada od nici? 16.Elongacja: replisom Co oznacza pojęcie replisom? Jakie enzymy/białka wchodzą w skład replisomu E. coli? 17.Sekwencjonowanie Na czym polega metoda sekwnecjonowania Sangera? Jaką funkcję pełnią dideoksynukleotydy w metodzie Sangera? Ile reakcji należy przeprowadzić aby zsekwencjonować fragment metodą Sangera? Jakie właściwości polimeraz wykorzystywane są w metodzie Sangera? Prof. dr hab. Roman Zielinski 20

Centre for Evolution, Genomics and Biomathematics, e-gene prof.romanzielinski@gmail.com https://www.matgen.pl Prof. dr hab. Roman Zielinski 21