dr Robert Bachliński Zakład Chemii Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego Policji robert.bachlinski@policja.gov.pl dr Agnieszka Mroczek Zakład Chemii Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego Policji agnieszka.mroczek@policja.gov.pl Identyfikacja syntetycznego kannabinoidu 5F-NPB-22 (analog indazolowy 5F-PB-22) metodą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas (GC/MS) Streszczenie W niniejszym artykule przedstawiony został problem transestryfikacji syntetycznego kannabinoidu 5F-NPB-22, a także innych pokrewnych związków z grupy indazoli i indoli, takich jak: NPB-22, 5F-PB-22, BB-22 oraz PB-22 przy użyciu metanolu, rozpuszczalnika stosowanego rutynowo do badań metodą chromatografii gazowej sprzężoną ze spektrometrią mas (GC/MS). Proces ten może spowodować błędne wnioskowanie o zawartych w badanym preparacie substancjach, gdyż tworzą się w nim związki o budowie estrowej, co z kolei wpływa na wiarygodność wyników. Do badań oprócz mieszaniny metanolu z toluenem zastosowano także sam toluen, celem zaprezentowania wpływu obydwu rozpuszczalników na otrzymywane później metodą GC/MS wyniki. Jakość analiz potwierdzono również badaniami z wykorzystaniem spektrometrii mas typu kwadrupol-analizator czasu przelotu (Q-TOF), stosując bezpośredni nastrzyk do źródła jonów. Wnioski końcowe wskazują, że w przypadku tego rodzaju związków, podatnych na transestryfikację, duże znaczenie ma wybór odpowiedniego rozpuszczalnika do ekstrakcji. Zalecane jest zastosowanie toluenu oraz wykluczenie rozpuszczalników biorących udział w reakcji transestryfikacji, czyli alkoholi niskocząsteczkowych, takich jak: metanol czy etanol. Ponadto należy zadbać o szybką analizę ekstrahowanych substancji, aby wyeliminować ich potencjalną estryfikację. Słowa kluczowe 5F-NPB-22, estryfikacja, kannabinoidy, ester metylowy, GC/MS Cel pracy Celem pracy jest zwrócenie uwagi na problem zjawiska transestryfikacji syntetycznego kannabinoidu 5F-NPB-22, a także innych pokrewnych związków z grupy indazoli i indoli, takich jak: NPB-22, 5F-PB-22, BB-22 oraz PB-22 przy użyciu metanolu, rozpuszczalnika stosowanego rutynowo do badań metodą chromatografii gazowej sprzężoną ze spektrometrią mas (GC/MS). Proces ten może spowodować błędne wnioskowanie o zawartych w badanym preparacie substancjach, gdyż w jego wyniku tworzą się związki o budowie estrowej, co z kolei wpływa na wiarygodność wyników i możliwe fałszywe wnioskowanie w opiniach z dziedziny chemii kryminalistycznej. Poruszony w niniejszej publikacji temat pojawił się przy okazji wykonywania analiz częściowych dotyczących nowych substancji psychoaktywnych i innych substancji o podobnym działaniu (zgodnie z definicją zawartą w ustawie o przeciwdziałaniu narkomanii) zlecanych do Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego Policji przez zleceniodawców zewnętrznych. Wstęp 5F-NPB-22 (ester chinolin-8-ylowy kwasu 1-(5-fluoropentylo)-1H-indazol-3-karboksylowego) jest syntetycznym kannabinoidem z grupy indazoli, podobnym strukturalnie do NPB-22, wzbogaconym o atom fluoru na końcu alifatycznego łańcucha węglowego (ryc. 1a, b). Związek ten w czystej postaci występuje w formie krystalicznej i jest rozpuszczalny w popularnych rozpuszczalnikach organicznych, takich jak: metanol, etanol, toluen, DMSO (dimetylosulfotlenek) czy DMF (dimetyloformamid). Rozpuszczalność związku PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016 3
Ryc. 1. Wzory strukturalne 5F-NPB-22 (a), NPB-22 (b) oraz JWH-018 (c). w ostatnich dwóch wymienionych rozpuszczalnikach wynosi około 10 mg/ml [1]. Ze względu na podobieństwo strukturalne aktywność farmakologiczna NPB-22 i 5F-NPB-22 może być podobna, choć jest ona jeszcze mało poznana. Sam NPB-22 jest analogiem strukturalnym JWH-018 (ryc. 1c) i można wnioskować, że mechanizm działania tych związków jest zbliżony. JWH-018 jest silnym agonistą receptorów kannabi- noidowych o stałych powinowactwach K i 9,00 ± 5,00 nm do receptora CB 1 i K i 2,94 ± 2,65 nm do CB 2 ; w porównaniu do 9 -THC ( 9 -tetrahydrokannabinolem) JWH-018 ma silniejsze właściwości psychoaktywne, ponieważ wykazuje w przybliżeniu czterokrotnie wyższe powinowactwo do receptora CB 1 i dziesięciokrotnie wyższe do receptora CB 2, jednakże jego działanie jest krótsze (ok. 1-2 godziny) [2]. Przygotowanie próbek Do badań został wybrany preparat z grupy tzw. środków zastępczych [3] w postaci jednorodnego suszu roślinnego koloru zielonego, umieszczony w przezroczystej torebce foliowej z zapięciem strunowym (ryc. 2). Badany susz roślinny, w ilości ok. 1 g, zmielono w całości w moździerzu agatowym w celu homogenizacji, a następnie pobrano po ok. 30 mg do dwóch oddzielnych probówek. Do próbek z suszem dodano odpowiednio po 1,5 ml: metanolu zmieszanego z toluenem w stosunku 1:1 z dodatkiem wzorca wewnętrznego nonadekanu (pierwsza probówka) oraz czystego toluenu (druga probówka). Obydwie probówki zamknięto plastikowymi zakrętkami i umieszczono w rotatorze na około 30 minut. Po tym czasie roztwory sączono przez filtry strzykawkowe o wymiarach 13 mm, 0.45 µm z membraną PTFE, uzyskując jednolite dwa roztwory, które przelano do szklanych fiolek używanych w pomiarach przy użyciu chromatografii gazowej (GC). Fiolki zamknięto kapslami jednorazowymi z membraną wykonaną z PTFE. Zastosowana aparatura i warunki pomiaru Ryc. 2. Torebka z suszem roślinnym. Do badań zastosowano chromatograf gazowy sprzężony ze spektrometrem mas GC/MS Single Quad typ 7890 A/ MSD-5975 C firmy Agilent Technologies, wyposażony w kolumnę kapilarną Rxi-5Sil MS o długości 30 m, średnicy 0,25 mm i fazie stałej o grubości 0.25 µm. 4 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016
Użyto następującej metody pomiaru: a. program temperaturowy: 100 C 0,50 min; 100 C 300 C x 12 /min 16,67 min; 300 C 18,00 min; b. temperatura komory nastrzykowej: 230 C; c. nastrzyk: 1 µl; d. typ nastrzyku: split 80:1; e. detektor: MS Quad; f. temperatura detektora: 230 C; g. zakres mas: 30 550 m/z; h. gaz nośny: hel. Ryc. 3. Chromatogram estru metylowego 5F-NPB-22; użyty rozpuszczalnik do ekstrakcji: mieszanina metanolu z toluenem (1:1) z dodatkiem nonadekanu jako wzorca wewnętrznego. Ryc. 4. Widmo masowe próbki zawierającej ester metylowy 5F-NPB-22 porównane z bazą danych GC/MS. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016 5
Uzyskane wyniki 1. Użyty rozpuszczalnik mieszanina metanolu (do LC-MS, czystość min. 99,95%, marki Witko, Polska) z toluenem (do GC-MS, MS SupraSolv, czystość min. 99,8%, marki Merck, Niemcy) w stosunku 1:1, z dodatkiem wzorca wewnętrznego: nonadekanu (czystość min. 99%, ACROS Organics, USA). Przy zastosowanych warunkach pomiaru, jak wskazano powyżej, na chromatogramie uzyskano główny pik przy czasie retencji Rt = 12,57 min i widmie masowym o dominującym m/z = 189 (ryc. 3). Następnie uzyskane widmo masowe porównano z bazą danych SWGDRUG (ver. 3.0) [4], uzyskując wynik wskazujący na ester metylowy 5F-NPB-22 (ryc. 4). Nie uzyskano piku chromatograficznego i widma masowego charakterystycznego dla 5F-NPB-22. 2. Użyty rozpuszczalnik toluen (do GC-MS, MS SupraSolv, czystość min. 99,8%, marki Merck KGaA, Niemcy). Przy zastosowaniu identycznych warunków pomiaru, jak w pkt 1 na chromatogramie uzyskano główny pik przy czasie retencji Rt = 22,40 min i widmie masowym Ryc. 5. Chromatogram 5F-NPB-22; użyty rozpuszczalnik do ekstrakcji: toluen. Ryc. 6. Widmo masowe próbki zawierającej 5F-NPB-22 porównane z bazą danych GC/MS. 6 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016
o dominującym m/z = 233 (ryc. 5). Następnie, podobnie jak poprzednio, uzyskane widmo masowe porównano z bazą danych SWGDRUG (ver. 3.0) [4], uzyskując wynik wskazujący na 5F-NPB-22 (ryc. 6). Nie uzyskano piku chromatograficznego i widma masowego charakterystycznego dla estru metylowego 5F-NPB-22. Potwierdzenie identyfikacji substancji za pomocą tandemowego spektrometru mas typu kwadrupol-analizator czasu przelotu (Q-TOF) przy zastosowaniu bezpośredniego nastrzyku do źródła jonów Rozdrobniony susz w ilości ok. 20 mg umieszczono w szklanej probówce, do której dodano mieszaninę acetonitrylu (do LC-MS, czystość min. 99,99%, marki POCh, Polska) z wodą dejonizowaną w stosunku 60:40. Następnie, podobnie jak w przypadku przygotowań próbek do badań metodą GC/MS, probówkę zamknięto plastikową zakrętką i umieszczono w rotatorze na około 30 minut. Po tym czasie roztwór sączono przez filtr strzykawkowy o wymiarach 13 mm, 0,45 µm z membraną PTFE, uzyskując jednolity roztwór gotowy do nastrzyku. Do badań zastosowano spektrometr mas typu kwadrupol-analizator czasu przelotu (Q-TOF) model TripleTOF 4600 firmy AB SCIEX wyposażony w źródło jonów typu duo-spray (ESI/APCI). Użyto bezpośredniego nastrzyku ze strzykawki o pojemności 1 ml, stosując przepływ ciągły 10 µl/min, bez użycia chromatografu cieczowego oraz źródło jonów typu ESI (ang. electrospray ionisation). Badania przeprowadzono w dwóch trybach pomiaru: 1. TOF MS zakres mas od 30 do 800 Da; czas pomiaru 1 min; tryb pomiaru mas: TIC (ang. total ion current). 2. Product Ion zakres mas od 30 do 400 Da; czas pomiaru 1,30 min; masa prekursora: 378 Da. W wyniku pomiaru w trybie TOF MS uzyskano widmo masowe z widoczną m.in. masą M = 378,1594 Da (ryc. 7), która odpowiada masie związku 5F-NPB-22 powiększonej o jeden proton, gdyż przy pomiarze zastosowano dodatnią polaryzację. W pomiarze w trybie Product Ion użyto masy 378 Da jako głównej masy prekursora, którą w komorze kolizyjnej spektrometru mas poddano fragmentacji, uzyskując następujące jony fragmentacyjne (tabela nr 1) odpowiadające poszczególnym fragmentom związku 5F-NPB-22 (ryc. 8): Ryc. 7. Wynik analizy metodą Q-TOF w trybie TOF MS próbki zawierającej 5F-NPB-22. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016 7
Ryc. 8. Wynik analizy metodą Q-TOF w trybie Product Ion próbki zawierającej 5F-NPB-22. Tabela 1. Masa [Da] Intensywność [%] Fragment 233,1093 100,00 C 13 H 14 N 2 OF + 213,1030 84,74 C 13 H 13 N 2 O + 185,1076 3,35 C 9 H 14 N 2 OF + 177,0463 23,54 C 9 H 6 N 2 OF + 145,0399 46,62 C 8 H 5 N 2 O + 69,0702 14,21 C 5 H 9 + Wykonane w ten sposób opisane powyżej badanie, przy użyciu spektrometru mas typu kwadrupol-analizator czasu przelotu (Q-TOF), jednoznacznie potwierdza, że badany związek to 5F-NPB-22, a zidentyfikowany w pomiarach GC/MS ester metylowy 5F-NPB-22 jest tylko produktem transestryfikacji 5F-NPB-22 przy użyciu metanolu jako rozpuszczalnika do ekstrakcji. Związki pokrewne 5F-NPB-22 (syntetyczne kannabinoidy z grupy indazoli i indoli) a transestryfikacja Ze względu na podobną budowę cząsteczki do związku 5F-NPB-22, w przypadku działania metanolem oraz niektórymi innymi rozpuszczalnikami, estryfikacji ulegają także następujące związki: PB-22, 5F-PB-22, BB-22 oraz analog indazolowy PB-22 [5, 6]. Przedstawione wyniki badań przeprowadzone w Węgierskim Instytucie Kryminalistycznym (ang. Hungarian Institute for Forensic Science) wskazują, że reakcja transestryfikacji zachodzi przy użyciu metanolu i etanolu w temperaturze pokojowej po upływie kilku godzin we wszystkich wymienionych związkach (łącznie z 5F-NPB-22). Oprócz wskazanych dwóch rozpuszczalników także użycie n-butanolu do ekstrakcji PB-22 i 5F-PB-22 oraz pentafluoro-propanolu do ekstrakcji PB-22, 5F-PB-22 i BB-22 powoduje powstawanie odpowiednich estrów [4]. Zestawienie poszczególnych substratów i produktów przedstawia rycina nr 9. Dalsze badania przeprowadzone w Węgierskim Instytucie Kryminalistycznym wskazują, że użycie do ekstrakcji izopropanolu lub izobutanolu nie powoduje zjawiska estryfikacji wszystkich analizowanych związków nawet w temperaturze 90 C przez kilka godzin [4]. 8 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016
Ryc. 9. Zestawienie produktów transestryfikacji 5F-NPB-22 i jego pochodnych przy zastosowaniu do ekstrakcji metanolu, etanolu, n-butanolu, pentafluoropentanolu. PB-22 ester PB-22; użyty rozpuszczalnik: metanol ester PB-22; użyty rozpuszczalnik: etanol ester PB-22; użyty rozpuszczalnik: n-butanol PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016 9
ester PB-22; użyty rozpuszczalnik: pentafluoropentanol 5F-PB-22 ester 5F-PB-22; użyty rozpuszczalnik: metanol ester 5F-PB-22; użyty rozpuszczalnik: etanol 10 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016
ester 5F-PB-22; użyty rozpuszczalnik: n-butanol ester 5F-PB-22; użyty rozpuszczalnik: pentafluoropentanol BB-22 ester BB-22; użyty rozpuszczalnik: metanol PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016 11
ester BB-22; użyty rozpuszczalnik: etanol ester BB-22; użyty rozpuszczalnik: pentafluoropentanol PB-22 analog indazolowy ester PB-22 analog indazolowy; użyty rozpuszczalnik: metanol 12 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016
ester PB-22 analog indazolowy; użyty rozpuszczalnik: etanol 5F-NPB-22 ester 5F-NPB-22; użyty rozpuszczalnik: metanol ester 5F-NPB-22; użyty rozpuszczalnik: etanol PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016 13
Podsumowanie i wnioski 1. Analiza metodą GC/MS syntetycznego kannabinoidu 5F-NPB-22 (estru chinolin-8- ylowego kwasu 1-(5-fluoropentylo)-1H-indazol-3- karboksylowego) wykazała, że po zastosowaniu do ekstrakcji rozpuszczalnika w postaci mieszaniny metanolu z toluenem w stosunku 1:1 produktem finalnym okazał się ester metylowy 5F-NPB-22 zamiast spodziewanego badanego kannabinoidu. Stosując jako rozpuszczalnik sam toluen, w wyniku badania metodą GC/MS otrzymano ekstrahowany, nie przereagowany związek. 2. Zjawisko to nie jest niczym innym, jak tylko transestryfikacją 5F-NPB-22 w obecności metanolu, zachodzącą po dłuższym działaniu tego rozpuszczalnika (kilka godzin) na badany związek w temperaturze pokojowej. 3. W związku z uzyskaniem takich wyników badań należy założyć, że nie powinno się stosować do ekstrakcji 5F-NPB-22 metanolu, ale inne rozpuszczalniki, takie jak toluen czy acetonitryl, które nie powodują reakcji transestryfikacji. 4. Podobne zjawisko związane z transestryfikacją przy zastosowaniu metanolu oraz etanolu zaobserwowano w przypadku takich związków, jak: PB-22, 5F-PB-22, BB-22 oraz analogu indazolowego PB-22 [5]. Aby estryfikacja nie wystąpiła, należy zastosować do ekstrakcji np. izopropanol, izobutanol [4] lub przetestowany przez autorów niniejszej publikacji toluen. 5. Autorzy niniejszej publikacji proponują bardzo dokładną analizę uzyskanych wyników metodą GC/MS pod kątem możliwości wystąpienia transestryfikacji. Jeśli analiza będzie dotyczyć jakiegokolwiek estru z wyżej wymienionych związków (oraz ewentualnie ich pochodnych), nie należy stosować do ekstrakcji alkoholu niskocząsteczkowego, takiego jak metanol czy etanol, lecz należy wybrać inny rozpuszczalnik, np. toluen lub acetonitryl. Nawet śladowe ilości alkoholu niskocząsteczkowego mogą wywołać częściową transestryfikację. Należy także zadbać o szybką analizę ekstrahowanych substancji, gdyż zbyt długi pomiar i wydłużony czas przebywania wyżej wymienionych estrów w fazie rozpuszczonej może sprzyjać potencjalnej, częściowej transestryfikacji. Źródła rycin i tabel: autorzy Bibliografia 1. 5-fluoro NPB-22 Product Information, Cayman Chemicals, www.caymanchem.com. 2. Aung M.M., Griffin G., Huffman J.W. i inni, Influence of the N-1 alkyl chain length of cannabimimetic indoles upon CB 1 and CB 2 receptor binding. Drug and Alcohol Dependence, 2000, s. 60, 133. 3. Ustawa o przeciwdziałaniu narkomanii z 29 lipca 2005 r. (tekst jednolity Dz.U. z 2016 r., poz. 224). 4. Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs (2016), SWGDRUG MS Liberary Version 3.0, http://www.swgdrug.org/ms.htm [dostęp: 8 listopada 2016]. 5. Transesterification derivatives of synthetic cannabinoids, Hungarian Institute for Forensic Sciences (2014), https://ednd.emcdda.europa.eu/html.cfm/index7246en.html? SUB_ID=380 &detail. 6. Tsujikawa K., Yamamuro T., Kuwayama K. i inni, Thermal degradation of new synthetic cannabinoid QUPIC during analysis by gas chromatography-mass spectrometry, Forensic Toxicol (2014), vol. 32, 2, s. 201-207. 14 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 293(3) 2016