Inne podejścia do klonowania 12/14-12-2017 Piotr Gawroński piotr_gawronski@sggw.pl 2/68 pt. 12-13 sites.google.com/site/chlorotfs
Klasyczne klonowanie
Universal TA clonning TdT = terminal deoxynucleotidyl-transferase ddttp = dideoxythymidine triphosphate
Wykorzystanie topoizomerazy
Wykorzystanie topoizomerazy
USER cloning Enzym USER wycina U z produktu PCR
Klonowanie wielu fragmentów
Możliwości systemu USER
Możliwości systemu USER
Sequence/Ligase independent cloning (SLIC) Amplifikacja wektora i GOI aa pomocą acr Wygenerowanie 12-20 nt overhangów dla GOI i wektora wykoraystując aktywność 3 egzonukleazy Pol DNA T4 Dodanie dcta hamuje egaonukleaaę
SLIC pozwala na fuzję wielu fragmentów SLIC pozwala na fuzję do 10 niezależnych fragmentów w odpowiedniej orientacji TaKaRa/Clontach posiada gotowe zestawy do klonowania (In-Fusion)
http://www.clontech.com/pl/products/cloning_and_competent_cells/cloning_resources/online_in-fusion_tools? sitex=10023:22372:us
Klonowanie GIBSONA z wykorzystaniem 5 egzonukleazy, polimerazy DNA i ligazy DNA Klonowanie w mniej niż 2 h Wydajne klonowanie fragmentów do 20 kb Możliwość klonowania do 6 fragmentów jednocześnie Fragmenty powinny zachodzić na siebie na długości 15-40 bp
Klonowanie GIBSONA
http://nebuilder.neb.com/
Golden Gate Cloning Wykorzystanie enzymow restrykcyjnych typu IIS (np. BsaI, BsmBI or BbsI), tworzących lepkie końce poza miejscem rozpoznawanym przez enzym. Enzymy typu IIS pozwalają na tworzenie wielu rożnych lepkich końców Enzymy typu IIS rozpoznają miejsca nie będące palindromami
Golden Gate Pozwala na wydajne klonowanie regionów bogatych w GC oraz sekwencji powtórzonych Możliwość klonowania fragmentów o różnych długościach (< 100 bp to > 15 kb) Możliwość klonowania wielu fragmentów jednocześnie (do 9)
Klonowanie Gateway Zalety technologii Gateway Saybka 1-godainna reakcja klonowania a efektywnością >99% Zachowuje orientację i ramkę odcaytu sklonowanego DNA (klony gotowe do ekspresji) bea koniecaności użycia enaymów restrykcyjnych i ligaay Eliminuje koniecaność resekwencjonowania po każdym etapie praeklonowania Wygodne praenosaenie insertu a międay eksperymentami Rekombinacja oparta na systemie z bakteriofaga Lambda Miejsca rekombinacji at Białko prowadzące do reakcji rekombinacji - Clonase (klonaza)
Gateway
Ścieżka lityczna i lizogeniczna Ścieżka lizogeniczna jest katalizowana przez integrazę (Int) z bakteriofaga λ i Integration Host Factor (IHF) z E. coli (BP Clonase mix) Ścieżka lityczna katalizowana jest przez Int i Excisionase (Xis) z bakteriofaga λ oraz IHF z E. coli (LR Clonase mix)
Schemat klonowania w systemie Gateway Z wykorzystaniem klonazy LR i BP możemy subklonować interesujący nas fragment dowolną ilość razy bez konieczności każdorazowego sekwencjonowania.
Uzyskiwanie klonu Entry Jak uzyskiwać wektory z ccdb?
control of cell death (ccdb) Białko CcdB blokuje gyrazę DNA (topoizomerazę II), która uczestniczy w naprawie DNA gdy komórka produkuje CcdB gyraza jest blokowana, komórka nie jest w stanie naprawić DNA i umiera.
Wykorzystanie pentr/d-topo
Plakaty - wytyczne Rozmiar 70x100 cm (szerokość x wysokość) Ciemna czcionka na jasnym tle Plakaty typu infografika są preferowane Maksymalna redukcja tekstu Termin: 9-11.01.2018 ok. 2 godziny w KGHiBR Hasło: Biotechnologia Arabidopsis125 Można się zgłaszać do POLIMAXu (w Limbie) od początku stycznia.
Programy MS PowerPoint Inkscape (https://inkscape.org/en/) Corel Draw Przed drukiem należy wysłać PDF do dr Marka Kotera (marek_koter@sggw.pl) i czekać na zatwierdzenie