Roman Adamczyk. Wpływ produktów degradacyjnego usuwania antybiotyków stosowanych w hodowli zwierząt na aktywność mikroorganizmów wybranych środowisk

Roman Adamczyk Wpływ produktów degradacyjnego usuwania antybiotyków stosowanych w hodowli zwierząt na aktywność mikroorganizmów wybranych środowisk (The effect of antibiotic degradation products used in animal husbandry for the activity of microorganisms from selected environments) Rozprawa na stopień doktora nauk farmaceutycznych Promotor pracy: Dr hab. n. farm. Wojciech Baran Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej w Sosnowcu Zakład Chemii Ogólnej i Nieorganicznej Katedra Chemii Ogólnej i Analitycznej Sosnowiec 2018 0

Składam najserdeczniejsze podziękowania Promotorowi mojej rozprawy Panu Dr hab. n. farm. Wojciechowi Baranowi za ogromną życzliwość, pomoc naukową oraz bardzo cenne wskazówki w trakcie realizacji mojej rozprawy doktorskiej. Pani Dr hab. n. farm. Ewie Adamek składam serdeczne podziękowania za wszystkie cenne uwagi i wskazówki. 1

SPIS TREŚCI Wykaz tabel, rycin i skrótów... 5 Wykaz tabel... 5 Wykaz rycin... 6 Wykaz skrótów... 11 1. WSTĘP... 12 1.1. Leki przeciwbakteryjne w środowisku... 12 1.2. Generowanie lekooporności u mikroorganizmów środowiskowych i chorobotwórczych... 14 1.3. Skala problemu obserwowana w Polsce... 15 1.4. Główne kierunki prac mających na celu ograniczenie negatywnych skutków obecności leków w środowisku... 17 1.4.1. Biologiczne metody oczyszczania ścieków... 17 1.4.2. Zaawansowane procesy utleniania... 18 2. ZAŁOŻENIA I CELE PRACY... 25 3. MATERIAŁ I METODY... 26 3.1. Zastosowane odczynniki... 26 3.2. Aparatura i sprzęt laboratoryjny... 28 3.3. Procedury badań... 29 3.3.1. Wyznaczanie wrażliwości mikroorganizmów inokulum na wybrane do badań antybiotyki... 29 3.3.2. Degradacja antybiotyków... 31 3.3.2.1. Fotokataliza homogeniczna prowadzona w obecności FeCl3 (modyfikacja procesu fotofentona)... 31 2

3.3.2.2. Metoda Fentona... 33 3.3.2.3. Fotokataliza heterogeniczna z TiO2... 33 3.3.2.4. Hydroliza w warunkach aseptycznych... 34 3.3.2.5. Ozonowanie... 35 3.3.2.6. Biodegradacja... 37 3.4. Oznaczanie stężeń badanych antybiotyków... 39 3.5. Oznaczanie stężeń OWO... 39 3.6. Oznaczanie toksyczności badanych próbek... 39 3.7. Opracowanie wyników... 41 3.8. Sposób przedstawienia wyników... 42 3.9. Analiza statystyczna... 42 3.10. Program badań... 43 3.10.1. Ocena wrażliwości mikroorganizmów inokulum na wybrane do badań antybiotyki.... 43 3.10.2. Proces fotokatalizy homogenicznej w obecności FeCl3... 44 3.10.3. Proces Fentona... 45 3.10.4. Proces fotokatalizy heterogenicznej z TiO2... 46 3.10.5. Proces hydrolizy w warunkach aseptycznych... 47 3.10.6. Proces ozonowania... 48 3.10.7. Proces biodegradacji... 49 4. WYNIKI... 50 4.1. Walidacja metod analitycznych... 50 4.2. Wyznaczanie wrażliwości mikroorganizmów... 51 4.3. Fotodegradacja prowadzona w obecności FeCl3 (fotokataliza homogeniczna, fotosensybilizacja)... 57 3

4.4. Proces Fentona... 62 4.5. Fotokataliza heterogeniczna z TiO2... 67 4.6. Hydroliza w warunkach aseptycznych... 72 4.7. Ozonowanie... 77 4.8. Biodegradacja... 82 5. DYSKUSJA... 87 6. WNIOSKI... 98 Streszczenie... 112 Abstract... 114 4

Wykaz tabel, rycin i skrótów Wykaz tabel Tabela I. Antybiotyki wybrane do badań... 26 Tabela II. Zestawienie parametrów zastosowanych antybiotyków... 31 Tabela III. Warunki prowadzenia oznaczeń antybiotyków... 39 Tabela IV. Charakterystyka statystyczna krzywych wzorcowych oznaczania badanych antybiotyków techniką HPLC... 50 Tabela V. Wydajność kwantowa fotodegradacji antybiotyków w obecności FeCl3... 61 Tabela VI. Wydajność degradacji antybiotyków metodą Fentona względem H2O2... 67 Tabela VII. Wydajność kwantowa fotodegradacji antybiotyków z TiO2... 72 Tabela VIII. Wydajność hydrolizy antybiotyków... 76 Tabela IX. Wydajność procesu ozonowania antybiotyków... 81 Tabela X. Wydajność biodegradacji antybiotyków... 86 Tabela XI. Podsumowanie efektów fotodegradacji antybiotyków w obecności FeCl3 89 Tabela XII. Podsumowanie efektów degradacji antybiotyków metodą Fentona... 90 Tabela XIII. Podsumowanie efektów fotokatalitycznej degradacji antybiotyków prowadzonej w obecności TiO2... 91 Tabela XIV. Podsumowanie efektów hydrolizy prowadzonej w warunkach abiotycznych... 93 Tabela XV. Podsumowanie efektów ozonowania (ozonolizy) antybiotyków... 94 Tabela XVI. Podsumowanie efektów biodegradacji antybiotyków... 95 Tabela XVII. Sumaryczna, graficzna ocena efektywności degradacji, mineralizacji i usuwania ekotoksyczności dla wszystkich przeprowadzonych eksperymentów... 97 5

Wykaz rycin Rycina 1. Zużycie leków przeciwbakteryjnych w Danii do roku 2014 [5]... 12 Rycina 2. Dynamika liczby przypadków MRSA w Dani [17]... 15 Rycina 3. Stężenia trimetoprimu w rzekach Europy [18]... 16 Rycina 4. Przemiany leków i genów oporności w biologicznej oczyszczalni ścieków 18 Rycina 5. Schemat rozcieńczeń na płytce mikrotitracyjnej... 30 Rycina 6. Schemat przebiegu badań wrażliwości mikroorganizmów... 30 Rycina 7. Stanowisko do badań procesów fotochemicznych... 32 Rycina 8. Schemat przebiegu eksperymentu prowadzonego w obecności FeCl3 (a roztwór antybiotyku, b FeCl3, c mieszadło magnetyczne, d 30 minut mieszania w ciemności, e lampa Acnitic BL TL40 W/10 (Philips) (UVA 13,6 W/m 2 ), f naświetlanie, g mieszanie w świetle UVA przez 300 minut, h pobieranie próbek do dalszych badań po 10, 20, 30, 60, 120, 180, 240, 300.)... 32 Rycina 9. Schemat przebiegu procesu Fentona (a roztwór antybiotyku lub woda destylowana, b FeSO4, c H2SO4, d mniej niż minuta, e 30 minut, f H2O2, g NaOH)... 33 Rycina 10. Schemat przebiegu fotokatalizy z TiO2 (a roztwór antybiotyku, b TiO2, c mieszadło magnetyczne, d 30 minut mieszania w ciemności, e lampa Acnitic BL TL40 W/10 (Philips) (UVA 13,6 W/m 2 ), f naświetlanie, g mieszanie w świetle UVA przez 300 minut, h pobieranie próbek do dalszych badań po 10, 20, 30, 60, 120, 180, 240, 300.)... 34 Rycina 11. Schemat przebiegu hydrolizy (a naważka antybiotyku, b woda redestylowana, c cieplarka, d - warunki aseptyczne, stała temperatura 30 C, e pobieranie próbek do badań)... 35 Rycina 12. Schemat aparatury do ozonowania, a) gazomierz; b) płuczka napełniona 10% roztworem Na2S2O3; c) cylindryczny reaktor o wysokości 65 cm i objętości roboczej 350 cm 3 ; d) naczynie na próbki; e) pompa do przedmuchiwania aparatury powietrzem; f) generatora ozonu DST-15, (Blue Planet); g) butla z tlenem medycznym (Linde)... 36 Rycina 13. Stanowisko badawcze do ozonowania... 36 Rycina 14. Stanowisko badawcze do biodegradacji a) filtr HEPA, b) kompresor bezolejowy, c) zbiornik, d) zawór redukcyjny, e) manometr, f) zbiornik bezpieczeństwa, 6

g) płuczka z roztworem KMnO4, h) separator, i) absorber z węglem aktywnym, j) zawór, k) reaktory barbotażowe... 38 Rycina 15. Stanowisko do badań biodegradacji... 38 Rycina 16. Schemat przygotowania płytki mikrotitracyjnej dla badań ekotoksyczności... 40 Rycina 17. Obraz przykładowej płytki mikrotitracyjnej zawierającej DOX o maksymalnym stężeniu 50 mg/l i kroku rozcieńczeń 4, zaszczepionej oczyszczonymi ściekami i inkubowanej przez 48 godziny... 51 Rycina 18. Raport uzyskany za pomocą aplikacji MARA po analizie płytki przedstawionej na Rycinie 17.... 52 Rycina 19. Wpływ stężenia AMP na wzrost wykorzystywanych jako inokulum, nieselekcjonowanych mikroorganizmów pochodzących z rzeki Brynicy... 53 Rycina 20. Wpływ stężenia AMP na wzrost wykorzystywanych jako inokulum, nieselekcjonowanych mikroorganizmów pochodzących z oczyszczonych ścieków. 53 Rycina 21. Wpływ stężenia DOX na wzrost wykorzystywanych jako inokulum, nieselekcjonowanych mikroorganizmów pochodzących z rzeki Brynicy... 54 Rycina 22. Wpływ stężenia DOX na wzrost wykorzystywanych jako inokulum, nieselekcjonowanych mikroorganizmów pochodzących z oczyszczonych ścieków. 54 Rycina 23. Wpływ stężenia TYL na wzrost wykorzystywanych jako inokulum, nieselekcjonowanych mikroorganizmów pochodzących z rzeki Brynicy... 55 Rycina 24. Wpływ stężenia TYL na wzrost wykorzystywanych jako inokulum, nieselekcjonowanych mikroorganizmów pochodzących z oczyszczonych ścieków. 55 Rycina 25. Zmiany stężenia AMP i OWO podczas fotodegradacji prowadzonej w obecności FeCl3... 58 Rycina 26. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w efluencie inkubowanych w pożywce zawierającej produkty fotodegradacji AMP prowadzonej w obecności FeCl3. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 58 Rycina 27. Zmiany stężenia DOX i OWO podczas fotodegradacji prowadzonej w obecności FeCl3... 59 Rycina 28. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w efluencie inkubowanych w pożywce zawierającej produkty fotodegradacji DOX prowadzonej w obecności FeCl3. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 59 7

Rycina 29. Zmiany stężenia TYL i OWO podczas fotodegradacji prowadzonej w obecności FeCl3... 60 Rycina 30. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w efluencie inkubowanych w pożywce zawierającej produkty fotodegradacji TYL prowadzonej w obecności FeCl3. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 60 Rycina 31. Zmiany stężenia AMP i OWO podczas procesu Fentona... 63 Rycina 32. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty degradacji AMP metodą Fentona. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05.. 63 Rycina 33. Zmiany stężenia DOX i OWO podczas procesu Fentona... 64 Rycina 34. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty degradacji DOX metodą Fentona. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05.. 64 Rycina 35. Zmiany stężenia TYL i OWO podczas procesu Fentona... 65 Rycina 36. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty degradacji TYL metodą Fentona. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 65 Rycina 37. Zmiany stężenia AMP i OWO podczas fotokatalizy z TiO2... 68 Rycina 38. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty fotodegradacji AMP z zastosowaniem TiO2. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 68 Rycina 39. Zmiany stężenia DOX i OWO podczas fotokatalizy z TiO2... 69 Rycina 40. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty fotodegradacji DOX z zastosowaniem TiO2. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 69 Rycina 41. Zmiany stężenia TYL i OWO podczas fotokatalizy z TiO2... 70 Rycina 42. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty fotodegradacji TYL z zastosowaniem TiO2. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 70 8

Rycina 43. Zmiany stężenia AMP i OWO podczas hydrolizy... 73 Rycina 44. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty transformacji AMP uzyskane po hydrolizie. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 73 Rycina 45. Zmiany stężenia DOX i OWO podczas hydrolizy... 74 Rycina 46. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty transformacji DOX uzyskane po hydrolizie. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 74 Rycina 47. Zmiany stężenia TYL i OWO podczas hydrolizy... 75 Rycina 48. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty transformacji TYL uzyskane po hydrolizie. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 75 Rycina 49. Zmiany stężenia AMP i OWO podczas ozonowania... 78 Rycina 50. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty degradacji AMP po procesie ozonowania. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 78 Rycina 51. Zmiany stężenia DOX i OWO podczas ozonowania... 79 Rycina 52. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty degradacji DOX po procesie ozonowania. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 79 Rycina 53. Zmiany stężenia TYL i OWO podczas ozonowania... 80 Rycina 54. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty degradacji TYL po procesie ozonowania. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 80 Rycina 55. Zmiany stężenia AMP podczas biodegradacji... 83 9

Rycina 56. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty biodegradacji AMP. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 83 Rycina 57. Zmiany stężenia DOX podczas biodegradacji... 84 Rycina 58. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty biodegradacji DOX. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 84 Rycina 59. Zmiany stężenia TYL podczas biodegradacji... 85 Rycina 60. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty biodegradacji TYL. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05... 85 10

Wykaz skrótów AMP ampicylina, AOP procesy zaawansowanego utleniania, DOX doksycyklina, HPLC wysokosprawna chromatografia cieczowa, MRSA Gronkowiec złocisty oporny na metycylinę, (ang. methicyllin-resistant Staphylococcus aureus) OWO ogólny węgiel organiczny, RPM obroty na minutę, TYL tylozyna, TZR - chlorek 2,3,5-trifenylotetrazoliowy, UE Unia Europejska, UV promieniowanie ultrafioletowe, WAO mokre utlenianie powietrzem, ZChOiN - Zakład Chemii Ogólnej i Nieorganicznej. 11

1. WSTĘP 1.1. Leki przeciwbakteryjne w środowisku W ciągu ostatnich lat na całym świecie leki przeciwbakteryjne oraz ich metabolity uznano jako nową klasę zanieczyszczeń wód [1,2]. Taka sytuacja wydawała się nieunikniona, biorąc pod uwagę tempo rozwoju cywilizacyjnego i szybkość wzrostu liczby ludności na ziemi. Świadomość na temat zagrożeń wynikających z nadmiernego stosowania antybiotyków wydaje się być dużo wyższa niż kilkanaście lat temu. Jednakże niewiele osób zdaje sobie sprawę z tego, jakie ilości antybiotyków są stosowane w celu zabezpieczenia hodowli zwierząt przed groźnymi chorobami. Takie działania wynikają z ciągłego dążenia do zwiększania wydajności produkcji. Kolejnym źródłem zanieczyszczeń środowiska antybiotykami są szpitale, jednak w tym przypadku możliwa jest kontrola i ocenianie zagrożeń. W hodowli i weterynarii, gdzie zużycie leków przeciwbakteryjnych jest dużo wyższe, niezwykle trudno jest kontrolować ilości, które przedostają się do środowiska naturalnego [3,4]. Istnieją szacunki, że obecnie 2/3 stosowanych antybiotyków jest zużywanych w hodowli zwierząt (Rycina 1) [5]. Rycina 1. Zużycie leków przeciwbakteryjnych w Danii do roku 2014 [5] 12

Pod koniec ubiegłego wieku rozpoczęto działania dążące do zmniejszenia ilości stosowanych leków przeciwbakteryjnych w hodowli zwierząt. W 1996 roku w Danii wprowadzono zakaz stosowania antybiotyków, jako promotorów wzrostu. W konsekwencji ich rejestrowane zużycie spadło o niemal połowę. Niestety od tamtego czasu nastąpił powolny, ale systematyczny wzrost stosowania tych leków zarówno w hodowli i weterynarii, jak i w lecznictwie ludzi (Rycina 1). Od 1 stycznia 2006 na terytorium UE obowiązuje całkowity zakaz stosowania antybiotyków, jako promotorów wzrostu w środkach żywienia zwierząt. Jednak jak wskazują doświadczenia Danii, pozytywne skutki tego zakazu mogą być szybko zniwelowane. W najnowszych doniesieniach naukowcy zwracają uwagę na problem trwałości niektórych antybiotyków stosowanych w hodowli zwierząt. Np. stwierdzono, że antybiotyki stosowane w chorobach układu oddechowego u świń są wydalane w większości w postaci niezmienionej i trafiają do gnojowicy. Równocześnie ich średnie okresy półtrwania w gnojowicy wynoszą nawet 120 dni [6]. Stanowi to ogromne zagrożenie dla biocenoz narażonych na kontakt z tego typu odpadami. Pola uprawne gdzie takowa masa jest rozprowadzana jako nawóz, stanowią rezerwuar tych niepożądanych substancji. Badania wykonane przy hodowlach pangii w Wietnamie i krewetek w Chinach wykazały, że aż 25% wykorzystywanych antybiotyków przedostaje się do środowiska. Biorąc pod uwagę masowość produkcji i brak możliwości oczyszczenia wody, do której trafia pokarm z antybiotykami, prawdopodobieństwo potencjalnego rozwoju w takim środowisku bakterii o dużej oporności jest niezwykle wysokie [7]. Antybiotyki i ich metabolity stanowią również zagrożenie dla roślin. Sulfonamidy o właściwościach przeciwbakteryjnych są wykorzystywane w krajach Ameryki Południowej jako przemysłowe herbicydy (Asulam). Zjawisko fitotoksyczności ze strony innych leków przeciwbakteryjnych jest dotąd mało poznane, jednakże pojawiają się coraz to nowe badania udowadniające ten fakt. Wykazano, że leki przeciwbakteryjne mają negatywny wpływ na kiełkowanie nasion czy szybkość wzrostu korzeni roślin, np. sałaty, pomidorów, ogórków i marchwi [8,9]. 13

1.2. Generowanie lekooporności u mikroorganizmów środowiskowych i chorobotwórczych Ciągły wzrost konsumpcji antybiotyków sprawił, że zaczęto zauważać niebezpieczeństwo zachwiania równowagi w ekosystemie wodnym. Naturalnie występujące mikroorganizmy są częścią prawidłowo funkcjonującego ekosystemu. Zmiana ich składu jakościowego bądź ilości może być przyczyną poważnych zaburzeń w pozostałej części ekosystemu. W przypadku, gdy ilość bakterii danego szczepu zaczyna spadać, w jego miejsce mogą wejść inne gatunki, które będą oporne na antybiotyki występujące w tym środowisku. Może się również zdarzyć, że pojawią się nowe bakterie chorobotwórcze stanowiące zagrożenie dla flory i fauny, a przede wszystkim dla człowieka [10]. Niestety nierozważne i masowe stosowanie leków przeciwbakteryjnych sprawia, że oporność bakterii na antybiotyki staje się coraz bardziej powszechna. Źródłem informacji genetycznej o lekooporności wydają się być bakterie glebowe [11]. Udowodniono, że geny oporności mogą być przenoszone poprzez koniugację zachodzącą pomiędzy bakteriami opornymi i wrażliwymi. Dodatkowo problem pogłębia fakt, że zjawisko to jest możliwe również pomiędzy bakteriami różnych gatunków. Taka sytuacja nosi nazwę transportu horyzontalnego. Geny, które są odpowiedzialne za oporność na antybiotyki występują w: plazmidach, integronach, transpozonach, kasetach genowych. Opisano wiele mechanizmów odpowiedzialnych za zjawisko oporności wśród bakterii [12]. Jednak największe znaczenie w rozprzestrzenianiu się tego zjawiska ma możliwość generowania oporności wtórnej mikroorganizmów, w której kluczowa jest obecność nietoksycznych stężeń leków przeciwbakteryjnych w środowisku. Wykazano, że bakterie posiadające geny oporności na antybiotyki znajdują się nie tylko w wodach w pobliżu gospodarstw używających dużych ilości antybiotyków, ale również w miejscach, gdzie mogłoby się wydawać takie sytuacje nie powinny mieć 14

miejsca. Zdarzają się przypadki występowania oporności na niektóre antybiotyki, również wśród bakterii występujących u wybrzeży mórz oraz przy ujściach rzek. Skalę niebezpieczeństwa i ogromne możliwości rozprzestrzeniania się oddaje fakt znalezienia opornych szczepów Escherichia coli w odchodach ptaków arktycznych zasiedlających Morze Arktyczne [13-16]. Wg szacunków Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), rokrocznie z powodu chorób zakaźnych umiera na świecie ponad piętnaście milionów ludzi. Wzrost oporności mikroorganizmów i wywołana przez nie pandemia to najbardziej prawdopodobne scenariusze katastroficznego obniżenia wielkości populacji ludzkiej w XXI wieku. Wagę omawianego problemu dobrze ilustruje dynamika wzrostu ilości stwierdzonych przypadków zakażeń Staphylococcus aureus opornym na metycylinę (MRSA; Rycina 2) zaczerpnięta z duńskiego raportu DANMAP 2013 [17]. Rycina 2. Dynamika liczby przypadków MRSA w Dani [17] 1.3. Skala problemu obserwowana w Polsce Najnowsze badania w zakresie przewidywania obecności antybiotyków w rzekach i innych wodach powierzchniowych wydają się być alarmujące również jeśli chodzi o terytorium Polski. Na podstawie modelu obliczeniowego stworzono mapę Europy (Rycina 3), która ukazuje potencjalną skalę zagrożenia zanieczyszczeniem jednym z leków przeciwbakteryjnych trimetoprimem [18]. Autorzy tej publikacji wskazują Polskę jako jeden z najbardziej zagrożonych krajów Europy. Z kolei, według 15

autorów raportu Zatrzymać lekooporne patogeny z powodu lekoopornych bakterii w Polsce umiera rocznie około 20 30 tysięcy osób [19]. Rycina 3. Stężenia trimetoprimu w rzekach Europy [18] 16

1.4. Główne kierunki prac mających na celu ograniczenie negatywnych skutków obecności leków w środowisku Z biegiem czasu można znaleźć coraz więcej publikacji, które zwracają uwagę na problem wpływu leków przeciwbakteryjnych na środowisko. Na chwilę obecną w bazach naukowych znajduje się bardzo dużo różnych tego typu pozycji. Jednakże nadal nie widać pomysłu na rozwiązanie tego problemu. Główne kierunki prowadzonych obecnie prac zmierzają do: ograniczenia i kontroli stosowania leków przeciwbakteryjnych, wprowadzania nowych leków przeciwbakteryjnych lub leków ograniczających skutki lekooporności, opracowania skutecznych metod eliminujących leki przeciwbakteryjne ze strumienia odpadów. Całkowita rezygnacja ze stosowania tych leków jest niemożliwa. Również pełna kontrola nad ich stosowaniem z uwagi na mnogość zastosowań i skalę także jest niewykonalna [20]. Zwłaszcza, że problem ma zasięg globalny. Natomiast ciągłe wprowadzanie nowych leków przeciwbakteryjnych przypomina kosztowny wyścig z trudnym do przewidzenia rezultatem. Racjonalnym rozwiązaniem wydaje się poszukiwanie skutecznej metody usuwania leków przeciwbakteryjnych ze ścieków pohodowlanych. Jednak taka metoda, aby wykorzystywać ją w praktyce musi być: akceptowalna ekonomicznie, nieskomplikowana technologicznie, wydajna i o ile to możliwe - selektywna, bezpieczna dla środowiska. 1.4.1. Biologiczne metody oczyszczania ścieków Procesy biologiczne prowadzone w warunkach aerobowych i anaerobowych to w chwili obecnej najczęściej stosowana, rutynowa metoda oczyszczania ścieków komunalnych czy gospodarskich. Jest to metoda tania o nieskomplikowanej technologii. Według danych pochodzących głównie z komercyjnych oczyszczalni ścieków zlokalizowanych w krajach azjatyckich, jest również wysoce efektywna, gwarantuje całkowite usunięcie leków przeciwbakteryjnych obecnych w ściekach [21]. 17

Jednak usuwane leki mogą gromadzić się w osadzie czynnym stanowiącym kłopotliwy odpad takich oczyszczalni. Poza tym mikroorganizmy wchodzące w skład osadu czynnego, aby efektywnie rozkładać leki przeciwbakteryjne muszą być względem nich oporne. Z tego powodu mogą stać się niebezpiecznym źródłem genów lekooporności [21]. Ilustrację tego zjawiska przedstawiono na Rycinie 4. Rycina 4. Przemiany leków i genów oporności w biologicznej oczyszczalni ścieków 1.4.2. Zaawansowane procesy utleniania Jednym ze sposobów na pozbycie się ze środowiska niechcianych związków są zaawansowane procesy utleniania (AOPs Advanced Oxidation Processes). W ostatnich latach wykazano wysoką skuteczność stosowania tych metod do usuwania antybiotyków ze środowiska wodnego, w tym ze ścieków. Ogólnie AOPs można scharakteryzować jako kombinację stosowania różnych substancji chemicznych i/lub czynników fizycznych w celu wytworzenia cząsteczki o wysokim potencjale utleniającym [22]. Cząsteczki te (w środowisku wodnym są to najczęściej rodniki hydroksylowe HO ) mogą inicjować szereg procesów prowadzących do utleniającej degradacji lub nawet całkowitej mineralizacji związków organicznych (1). RH + HO ROH, R, ROO,... CO2, H2O, jony nieorganiczne (1) 18

Wykazano jednak, że w przypadkach skomplikowanej budowy chemicznej lub wysokiego stężenia usuwanego związku jego mineralizacja do dwutlenku węgla i wody bywa niemożliwa [23]. Problemem mogą być również obecne w ściekach inne substancje organiczne lub nieorganiczne [22]. Wśród znanych AOP wyróżniamy: Fotoliza UV Bezpośrednie napromieniowanie promieniowaniem UVC prowadzi do przeniesienia cząsteczki ze stanu podstawowego do wzbudzonego stanu singletowego (2). R R + hv R R 2R (2) Powstałe rodniki inicjują reakcje łańcuchowe, np. reagują z rozpuszczonym tlenem i prowadzą do powstawania rodników ponadtlenkowych (3) [24]. R R + O 2 R R + + O 2 (3) Badania laboratoryjne wykorzystujące światło słoneczne i lampy UV wykazały, że wiele farmaceutyków jest wrażliwych na fotodegradację w środowisku wodnym [25,1]. Wyróżnia się fotolizę bezpośrednią lub pośrednią. Podczas bezpośredniej fotolizy reakcja chemiczna jest powodowana przez pochłanianie kwantu promieniowania (co prowadzi do promocji cząsteczki od stanu podstawowego do wzbudzonego stanu singletowego). Natomiast pośrednia fotoliza zachodzi poprzez absorpcję światła przez fotosensybilizatory (fotouczulacze) takie jak np. rozpuszczona materia organiczna. Podczas mechanizmu pośredniego są generowane silnie reaktywne cząstki, na przykład: rodniki hydroksylowe, tlen singletowy, rodniki alkilowe nadtlenowe. 19

Mogą one inicjować cykl przemian prowadzących do utleniania organicznych substratów [26]. Degradacja związków w warunkach napromieniowania jest limitowana poprzez absorpcję promieniowania i wydajność kwantową określonej reakcji [27]. Fotoliza nie jest skuteczna w usuwaniu leków w matrycach zawierających duże ilości ciał stałych w zawiesinie, ponieważ wydajność kwantowa zmniejsza się wraz z rozproszeniem światła lub konkurencyjnym jego pochłanianiem. Warto zauważyć, że w wyżej wymienionych warunkach, eliminacja farmaceutyków może zostać osiągnięta przy dłuższym czasie naświetlania. Niemniej towarzyszy temu jedynie nieznaczna ich mineralizacja. W dodatku niektóre związki (tj. związki hydrofobowe) mogą unikać także degradacji fotochemicznej poprzez sorpcję do zawieszonej w wodze materii. Problemem jest również wysoka energochłonność procesu. Fotokataliza homogeniczna prowadzona w obecności soli Fe 3+ (fotoliza fotosensybilizowana Fe 3+ ). W trakcie tego procesu rodniki HO są generowane podczas inicjowanej światłem słonecznym reakcji; Fe(OH) 2+ + hv Fe 2+ + HO (4) Zaletami tego procesu jest wysoka skuteczność, relatywnie korzystna cena, niska toksyczność oraz łatwa dostępność FeCl3 (przemysłowy koagulant). Dodatkowo na jego korzyść przemawia możliwość wykorzystania światła słonecznego jako źródła promieniowania i względnie wysoka wydajność kwantowa. Niestety problemem może być uzyskanie odpowiedniego ph. Wrażliwe na światło jony Fe(OH) 2+ istnieją w roztworach wodnych w wąskim zakresie ph 3. Uzyskanie odpowiedniego ph może być szczególnie trudne w przypadku prawdziwych ścieków, które posiadają dużą pojemność buforową. W zależności od pochodzenia i składu ścieków dodatkowo może dojść 20

do strącenia soli żelaza. Dlatego ta metoda wydaje się być najodpowiedniejsza do oczyszczania ścieków przemysłowych o stosunkowo niewielkiej różnorodności w zakresie zawartości związków chemicznych [27-28]. Ozonowanie jest metodą AOP już powszechnie stosowaną w technologiach uzdatniania wody oraz coraz częściej stosowaną w oczyszczalniach ścieków. Jej głównym zadaniem jest dezynfekcja. W przebiegu tego procesu w środowisku powstają aktywne rodniki HO, O2 - and HO2 (5). Procesy inicjowane są również przez cykloaddycję cząsteczek O3 bezpośrednio do wiązań wielokrotnych związków organicznych (mechanizm Criegeea) (6). 2O 3 + 2H 2 O 2HO + O 2 + 2HO 2 (5) O 3 + R R OX (6) Utrudnienie w prowadzeniu reakcji stanowi fakt słabej rozpuszczalności ozonu w wodzie, niska wydajność oraz zdolność do selektywnego tworzenia produktów ubocznych. Dużą wadą są również wysokie koszty prowadzenia reakcji [27-32]. Efektywność (wydajność) ozonowania poprawia się stosując jednoczesne naświetlanie promieniowaniem UV lub/i dodatek nadtlenku wodoru. Zwiększa to liczbę i częstotliwość wytwarzanych rodników hydroksylowych (7), jednakże podnosi i tak wysokie koszty prowadzenia procesu [22,24,30-31]. O 3 + H 2 O 2 + hv HO + O 2 + HO 2 (7) Degradacja fotokatalityczna w obecności suspensji lub immobilizowanych półprzewodników (np. TiO2) jest inicjowana promieniowaniem UVA. W wyniku absorpcji fotonu na powierzchni cząstek półprzewodnika generowana jest para wzbudzony elektron (ecb - ) dziura elektronowa (hvb + ) (8). 21

TiO 2 + hv TiO 2 (e CB + h VB +) (8) Są one pułapkowane i separowane w postaci powierzchniowych centrów redukujących i utleniających. Transfer elektronu z powierzchni półprzewodnika do cząsteczki rozpuszczonego tlenu powoduje generowanie reaktywnych form tlenu, m.in. rodnika ponadtlenkowego (9), natomiast w reakcji dziur elektronowych z wodą powstają rodniki hydroksylowe (10) [22]. O 2 + e CB O 2 (9) H 2 O + h VB + HO + H + (10) Zaletą degradacji fotokatalitycznej jest możliwość wykorzystania energii światła słonecznego i potencjalna prostota technologii (TiO2 jest łatwo aktywowany przez promieniowanie o długościach fal poniżej 400 nm) [33]. Poza tym TiO2 jest praktycznie nieszkodliwy dla mikroorganizmów wodnych oraz łatwo ulega immobilizacji, co zmniejsza jego zużycie [34]. Z drugiej strony główną wadą procesu fotokatalitycznego jest niska wydajność kwantowa. Większość badaczy wskazuje, że wynosi ona jedynie kilka % [35]. Jednak wg. Wachs i wsp., w przypadku fotokatalizy heterogenicznej możliwe jest uzyskanie ponad 50% wydajności kwantowej [36]. Cechą charakterystyczną procesów fotokatalitycznej degradacji jest nieselektywność. Z tego powodu wydajność kwantowa fotokatalitycznej degradacji antybiotyków w rzeczywistych ściekach może być jeszcze niższa (proporcjonalnie do ułamka zawartości tych leków w całym strumieniu zanieczyszczeń) [37]. Poza tym antybiotyki, nawet należące do jednej grupy mogą znacznie się różnić podatnością na fotodegradację [37]. Niemniej wyniki procesów prowadzonych w skali półtechnicznej potwierdzają, że proces fotokatalityczny pozwala na całkowitą degradację i przynajmniej 22

częściową mineralizację antybiotyków w ściekach [38]. Większość badaczy wskazuje również na nietoksyczność produktów tego procesu [39]. Reakcja Fentona w tym procesie wykorzystuje się jony Fe 2+ oraz nadtlenek wodoru. W wyniku reakcji pomiędzy tymi substratami dochodzi do wytworzenia rodników hydroksylowych (11). Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH + HO (11) Jej skuteczność jest zależna od stężeń H2O2, FeSO4 oraz ph środowiska, które powinno oscylować wokół 3,0. Istotne jest również, że proces degradacji zachodzi bardzo szybko i w praktyce nie limituje jego przebiegu. Wadą metody Fentona jest wysoki koszt stosowanych odczynników. Problemem jest też kwaśne środowisko reakcji oraz fakt, że aby uzyskać rzeczywiście dobre rezultaty w zakresie mineralizacji, ilości użytych odczynników muszą być wysokie. W takim przypadku uzyskujemy wysoce ekotoksyczne środowisko poreakcyjne. Problemem może być również konieczność zobojętniania ścieków po procesie i usuwania związków żelaza [22]. Proces Fentona posiada wiele modyfikacji zmierzających do ograniczenia jego materiałochłonności są to np. Reakcja foto-fentona polega na naświetlaniu światłem sztucznym lub słonecznym mieszaniny reakcyjnej, co umożliwia efektywniejsze odtwarzanie jonów Fe 2+ i produkcję większej ilości rodników hydroksylowych (12,13) [22]. Fe 2+ + H 2 O 2 Fe 3+ + OH + HO (12) Fe 3+ + H 2 O + hv Fe 2+ + H + + HO (13) 23

Wadami procesu są koszty związane z używaniem światła sztucznego oraz utrudnienia w pozbywaniu się żelaza z mieszaniny poreakcyjnej. Dodatkowo trzeba utrzymywać optymalne ph 3,0. Duże perspektywy daje wykorzystanie światła słonecznego, przez co koszty znacząco spadają [22,28,29,32]. Utlenianie elektrochemiczne nazywane reakcją elektro-fentona. Wyróżnia się dwa rodzaje procesów- katodowy (15, 16) lub anodowy (17). W pierwszym stosowana jest sól żelaza, natomiast w drugim stosuje się anodę z żelaza metalicznego. Fe 3+ + e Fe 2+ (15) O 2 + 2H + + 2e H 2 O 2 (16) Fe Fe 2+ + 2e (17) Wadą tej metody są wysokie koszty stosowania oraz potrzeba utrzymywania wysokich stężeń jonów żelaza [22,30,31,32,40,41]. Przy wyborze metody pozbywania się zanieczyszczeń ogromne znaczenie ma zarówno efektywność prowadzonych procesów jak i ich cena, która biorąc pod uwagę skalę prowadzonego oczyszczania, jest zwykle ogromna. Niestety żadna z metod nie przynosi całkowitej mineralizacji. Często przy stosowaniu uporczywego utleniania przez dłuższy czas mogą powstawać bardzo toksyczne produkty uboczne prowadzonego procesu. Poza tym na efektywność oczyszczania ma wpływ wiele czynników, m.in. ph, rodzaj usuwanego leku, obecność innych zanieczyszczeń i stężenia farmaceutyków. Niektórzy naukowcy wskazują również na biologiczne zagrożenie płynące ze stosowania opisanych wyżej metod [22,32,40-53]. 24

2. ZAŁOŻENIA I CELE PRACY Powszechne stosowanie antybiotyków, zwłaszcza w przemysłowej hodowli zwierząt powoduje, że w raz z odpadami duże ich ilości trafiają do środowiska. Coraz częściej uważa się, że sprzyjają one generowaniu lekooporności u bytujących w nim mikroorganizmów. W konsekwencji może to stanowić poważne zagrożenie również dla zdrowia ludzi. Oczywiście na dzień dzisiejszy wydaje się niemożliwe całkowite wyeliminowanie leków przeciwbakteryjnych i ich metabolitów ze środowiska. Jednakże człowiek stosując różnego rodzaju metody oczyszczania ścieków stara się także pozbyć się i tego zagrożenia. Rodzi się pytanie na ile takie metody są skuteczne i jaki wpływ na środowisko mają produkty takich procesów. Celem pracy są: ocena efektywności degradacji i mineralizacji w środowisku wodnym antybiotyków należących do trzech najczęściej stosowanych w hodowli zwierząt grup leków (penicylin, tetracyklin i makrolidów) z zastosowaniem metod degradacyjnego usuwania zanieczyszczeń ze ścieków, ocena efektów oddziaływania produktów degradacji tych antybiotyków na nieselekcjonowane mikroorganizmy pochodzące z komercyjnej oczyszczalni ścieków Sosnowiec Zagórze i zanieczyszczonej rzeki Brynicy, analiza przydatności badanych metod oczyszczania ścieków do usuwania zawartych w nich antybiotyków uwzględniając warunki prowadzenia badanych procesów oraz ekotoksyczność ich potencjalnych produktów. 25

3. MATERIAŁ I METODY 3.1. Zastosowane odczynniki Na podstawie badań wcześniej prowadzonych w Zakładzie Chemii Ogólnej i Nieorganicznej oraz danych literaturowych wyłoniono trzy antybiotyki, które zostały użyte w trakcie eksperymentów. Reprezentują one trzy główne grupy leków często stosowanych w weterynarii a zarazem można je precyzyjnie oznaczać ilościowo z użyciem techniki HPLC bezpośrednio z matryc środowiskowych [44]. Tabela I przedstawia krótką charakterystykę wybranych związków. Tabela I. Antybiotyki wybrane do badań Nazwa Skrót w tekście Grupa leków wg ATC 1 Wzór chemiczny Masa molowa [g/mol] Producent/ czystość J01C Ampicylina (sól sodowa ampicyliny) AMP Antybiotyki betalaktamowe, penicyliny 349,40 Sigma- Aldrich >99% Doksycyklina (hyklan doksycykliny) DOX J01A Tetracykliny 444,43 Sigma- Aldrich >98% Tylozyna (winian tylozyny) TYL J01F Makrolidy i linkozamidy 916,10 Sigma- Aldrich >98% 1 Klasyfikacja anatomiczno-terapeutyczno-chemiczna leków zgodna z wytycznymi Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) We wszystkich eksperymentach wykorzystywano świeżo przygotowane roztwory w/w antybiotyków w wodzie redestylowanej o stężeniach AMP 100 mg/l, DOX 50 mg/l i TYL 200 mg/l. Stężenia te zostały ustalone na podstawie oceny wrażliwości mikroorganizmów inokulum realizowanej w I fazie badań (Rozdział 3.3.1.). 26

W badaniach ekotoksykologicznych wykorzystano nieselekcjonowane mikroorganizmy pochodzące z rzeki Brynicy oraz z kanału odprowadzającego oczyszczone ścieki (efluent) z przemysłowej oczyszczalni ścieków w Sosnowcu- Zagórzu. Próbki wody zawierające te mikroorganizmy (inokulum) pobrano 17.12.2015, zamrożono i przechowywano w temperaturze < -18 C. Taka procedura została opisana przez Montusiewicz i wsp. oraz Dohányos i wsp. [45,46]. Każdorazowo, przed rozpoczęciem eksperymentu inokulum rozmrażano w ciągu 1 godziny w cieplarce, w temperaturze 30 C. Dodatkowo w eksperymentach stosowano następujące odczynniki: pepton sojowy (Sigma-Aldrich), chlorek 2,3,5-trifenylotetrazoliowy (TZR), (cz.d.a., POCH), CH3CN (cz. do HPLC, POCH), HCOOH (cz.d.a., POCH), gotowe testy kuwetowe LCK385 (3-30 mg/l C, HACH LANGE), FeSO4 7H2O (cz.d.a., POCH), H2O2 roztwór 30% (cz.d.a., POCH), H2SO4 roztwór 0,1 mmol/l (cz.d.a., POCH), NaOH roztwór 0,1 mmol/l (cz.d.a., POCH), komercyjny katalizator TiO2-P25 (Aeroxide, Evonik-Degussa GmbH), tlen medyczny (Linde), KI (cz.d.a. POCH), Na2S2O3 (cz.d.a. POCH), KMnO4 (cz.d.a. POCH). 27

3.2. Aparatura i sprzęt laboratoryjny Stanowisko do badań reakcji fotochemicznych wyposażone w 4 lampy fluorescencyjne Actinic BL TL40 W/10 (Philips) o natężeniu w zakresie UVA wynoszącym 13,6 W/m 2, stanowisko do badań procesu ozonowania wyposażone w pionowy reaktor barbotażowy o pojemności 350 ml i generator ozonu DST-15, (Blue Planet) zasilany tlenem medycznym, zestaw hermetycznych reaktorów z polipropylenu o pojemności 250 ml do badań procesu hydrolizy, zestaw reaktorów ze szkła oranżowego o pojemności 2500 ml zasilanych sterylnym powietrzem do badań procesu biodegradacji, zestaw do chromatografii HPLC (YL9100 System: Vacuum Degasser YL9101, Binary Pump YL9111, Column Compartment YL9130, UV/Vis Detector YL9120) z autosamplerem (SHLA84000, Lab Alliance), kolumny HPLC (Vydac C-18, ziarno 5 μm, 250 2,1 mm; Hypersil C-18, ziarno 5 μm, 250x4,6 mm), cieplarka (PBI Brand ZI1U12O7, TIGRET sp. z o.o.), komora laminarna (K1600, ALPINA), miernik HD22569.2 (Delta OHM), z czujnikiem tlenu (D097099S) i elektrodą kombinowaną (KP-30), mineralizator (LT200, LANGE HACH), pipeta automatyczna wielokanałowa Transferpette -8/-12 z adapterem 12-kanałowym (15-300 μl, BRAND), kompresor bezolejowy Aristo B110 (Włochy), skaner (Skanjet G4050, HP), spektrofotometr VIS (DR 3900, LANGE HACH), waga analityczna (AS60/C/2, RADWAG), wirówka laboratoryjna (MPW-223e, MPW Med. Instruments), wytrząsarka (Genius 3, IKA). 28

3.3. Procedury badań 3.3.1. Wyznaczanie wrażliwości mikroorganizmów inokulum na wybrane do badań antybiotyki. Aby móc prawidłowo ocenić wpływ badanych antybiotyków i produktów ich rozkładu na mikroorganizmy testowe należy wykorzystywać w eksperymentach roztwory o na tyle wysokim stężeniu, aby możliwa była obserwacja odpowiedzi tych mikroorganizmów w racjonalnym przedziale czasu. Z drugiej strony stosowanie zbyt wysokich stężeń antybiotyków może spowodować negatywne zmiany w kinetyce badanych procesów chemicznych a nawet je uniemożliwić [44]. Z tych powodów konieczne było wcześniejsze wyznaczenie optymalnych, stosowanych w eksperymentach stężeń badanych antybiotyków. Wykorzystano w tym celu procedurę stosowaną przy ocenie chronicznej ekotoksyczności próbek opisaną przez Wadhia i wsp. [47]. Na podstawie opublikowanych wyników badań kinetycznych oszacowano dopuszczalne maksymalne stężenia AMP, DOX i TYL. Wynoszą one odpowiednio 100, 50 i 200 mg/l [48]. Do świeżo przygotowanych roztworów o takich stężeniach dodawano stały pepton sojowy (2%) i stężony roztwór TZR (do stężenia 0,02%). Następnie sterylizowano je metodą sączenia przez filtr membranowy 0,20 µm (Macherey-Nagel). Do rzędu G, 96 dołkowej płytki titracyjnej (Rycina 5) aplikowano po 200 µl tak przygotowanych roztworów. a) współczy rozcieńc dilution factor 1 / 1024 1 / 256 1 / 64 1 / 16 1 / 4 1 / 1 A B C D E F G H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 b) medium pożywka without bez antibiotic; medium pożywka with z antibiotic; lypophilised puste liofilizowane dołki microorganisms antybiotyku antybiotykiem mikroorganizmy 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 29

Rycina 5. Schemat rozcieńczeń na płytce mikrotitracyjnej Do pozostałych rzędów dodawano po 150 µl sterylnej pożywki pozbawionej antybiotyku. Następnie przenosząc po 50 µl badanych roztworów do kolejnych rzędów płytki (zgodnie ze schematem przedstawionym na Rycinie 5) uzyskano gradient stężeń antybiotyku o kroku wynoszącym 4. Przygotowane płytki (kolumny 1-11) szczepiono inokulum (dodawano 15 l ścieków oczyszczonych lub 30 l wody z Brynicy) i umieszczano w inkubatorze na okres 48 h. Temperatura inkubacji wynosiła 30 C. Po tym czasie dokonywano kolorymetrycznej obserwacji aktywności mikrobiologicznej w badanych próbkach. Efektem aktywności mikroorganizmów była purpurowa (zredukowana) forma TZR. Do analizy wzrostu mikroorganizmów wykorzystano program MARA (NCIMB). Intensywność wybarwienia w dołku jest miarą wzrostu organizmów testowych [46]. Jako rezultat badania uznano przebieg zależności: wzrost mikroorganizmów = f(cantybiotyku) (18) Schemat przebiegu badań zilustrowano na Rycinie 6. Rycina 6. Schemat przebiegu badań wrażliwości mikroorganizmów 30

3.3.2. Degradacja antybiotyków Na podstawie wyników badań wrażliwości mikroorganizmów inokulum w dalszych eksperymentach wykorzystywano następujące roztwory przygotowane w wodzie redestylowanej (Tabela II). Roztwory te przechowywano maksymalnie do dwóch godzin. Tabela II. Zestawienie parametrów zastosowanych antybiotyków Antybiotyk Stężenie [mg/l] Stężenie Ogólnego Stężenie molowe Węgla Organicznego [mmol/l] (OWO) [mgc/l] AMP 100 0,270 51,84 DOX 50 0,117 30,89 TYL 200 0,218 120,34 3.3.2.1. Fotokataliza homogeniczna prowadzona w obecności FeCl3 (modyfikacja procesu fotofentona) Do krystalizatorów o pojemności 500 ml, wprowadzono po 100 ml roztworów badanych antybiotyków. Następnie dodawano 1 ml roztworu FeCl3 o stężeniu 0,1 mol/l w charakterze fotokatalizatora (fotouczulacza). Przygotowane roztwory naświetlano na stanowisku do badań procesów fotochemicznych (Rycina 7). 31

Rycina 7. Stanowisko do badań procesów fotochemicznych W trakcie całego procesu było prowadzone mieszanie przy użyciu mieszadeł magnetycznych. Dodatkowo był zapewniony swobodny dostęp powietrza. W trakcie eksperymentu uzupełniano postępujące na skutek parowania straty mieszaniny reakcyjnej wodą redestylowaną. Przed rozpoczęciem naświetlania oraz w jego trakcie pobierano próbki do oznaczania stężenia antybiotyku, OWO i ekotoksyczności względem wybranych do badań mikroorganizmów pochodzących ze środowiska. Schemat przebiegu badań zilustrowano na Rycinie 8. Rycina 8. Schemat przebiegu eksperymentu prowadzonego w obecności FeCl 3 (a roztwór antybiotyku, b FeCl 3, c mieszadło magnetyczne, d 30 minut mieszania w ciemności, e lampa Acnitic BL TL40 W/10 (Philips) (UVA 13,6 W/m 2 ), f naświetlanie, g mieszanie w świetle UVA przez 300 minut, h pobieranie próbek do dalszych badań po 10, 20, 30, 60, 120, 180, 240, 300.) 32

3.3.2.2. Metoda Fentona Do probówek odmierzono po 10 ml roztworów każdego z antybiotyków lub 10 ml wody destylowanej (kontrola). Następnie do każdej z probówek dodano po 100 µl świeżo przygotowanego roztworu FeSO4 (1,0 mmol/l) i roztwór H2SO4 (0,1 mol/l) do uzyskania ph = 3. Do tak przygotowanego zestawu dodawano świeżo przygotowany roztwór nadtlenku wodoru w takiej ilości, aby otrzymać jego założone stężenia. Każdorazowo po dodaniu nadtlenku wodoru i energicznym zamieszaniu proces kontynuowano dokładnie przez 30 min (Rycina 9). Po tym czasie, w celu zatrzymania procesu Fentona do każdej z próbek dodawano po 100 µl roztworu NaOH o stężeniu 0,1 mol/l (ph tak otrzymanych roztworów wynosiło 8) Następnie próbki odwirowywano (10 min, 4000 RPM). W supernatancie oznaczano stężenia antybiotyku, OWO i ekotoksyczność. Rycina 9. Schemat przebiegu procesu Fentona (a roztwór antybiotyku lub woda destylowana, b FeSO 4, c H 2SO 4, d mniej niż minuta, e 30 minut, f H 2O 2, g NaOH) 3.3.2.3. Fotokataliza heterogeniczna z TiO2 Do krystalizatorów o pojemności 500 ml, wprowadzono po 100 ml roztworów badanych antybiotyków i po 50 mg tlenku tytanu (IV). W ciemności mieszano je przez 30 min w celu ustalenia stanu równowagi. Reakcję fotokatalityczną inicjowano poprzez naświetlanie próbek na stanowisku do badań procesów fotochemicznych (Rycina 7). Reakcję prowadzono pod wyciągiem 33

umożliwiając swobodny dostęp powietrza. W trakcie całego eksperymentu zapewniono intensywne mieszanie dzięki zastosowaniu mieszadeł magnetycznych. Przed rozpoczęciem naświetlania oraz w jego trakcie pobierano próbki, które odwirowywano (10 min, 4000 RPM). Po dekantacji w supernatancie oznaczano stężenia antybiotyku, OWO i ekotoksyczność. Schematycznie przebieg eksperymentu przedstawiono na Rycinie 10. Rycina 10. Schemat przebiegu fotokatalizy z TiO 2 (a roztwór antybiotyku, b TiO 2, c mieszadło magnetyczne, d 30 minut mieszania w ciemności, e lampa Acnitic BL TL40 W/10 (Philips) (UVA 13,6 W/m 2 ), f naświetlanie, g mieszanie w świetle UVA przez 300 minut, h pobieranie próbek do dalszych badań po 10, 20, 30, 60, 120, 180, 240, 300.) 3.3.2.4. Hydroliza w warunkach aseptycznych Świeżo przygotowane roztwory antybiotyków sterylizowano metodą sączenia przez jałowy filtr (0,2 µm) bezpośrednio do jałowego, zamykanego hermetycznie naczynia wykonanego z polipropylenu (szkło może katalizować proces hydrolizy). Hydrolizę prowadzono bez dostępu światła w temperaturze 30 ± 0,2 o C przez okres 146 dni. ph roztworów nie było korygowane i wynosiło dla roztworów AMP, DOX i TYL odpowiednio 6,8; 3,75; 6,15. Próbki do analizy pobierano w założonych odstępach czasu z zachowaniem sterylności badanych roztworów. Oznaczano w nich zmiany stężeń antybiotyków, OWO. Próbki do oznaczeń ekotoksyczności zamrażano (-18 C) w celu późniejszej analizy. Schemat eksperymentu zilustrowano na Rycinie 11. 34

Rycina 11. Schemat przebiegu hydrolizy (a naważka antybiotyku, b woda redestylowana, c cieplarka, d - warunki aseptyczne, stała temperatura 30 C, e pobieranie próbek do badań) 3.3.2.5. Ozonowanie Proces ozonowania prowadzono w pionowym reaktorze barbotażowym o pojemności 350 ml. Do przedmuchanego powietrzem reaktora wprowadzano roztwory antybiotyków a następnie mieszaninę gazów bezpośrednio z generatora ozonu (gazy te nie zawierały tlenków azotu). Objętość użytego w reakcji gazu kontrolowano za pomocą gazometru wodnego. Schemat aparatury wykorzystanej w eksperymencie przedstawiono na Rycinie 12. 35

Rycina 12. Schemat aparatury do ozonowania, a) gazomierz; b) płuczka napełniona 10% roztworem Na 2S 2O 3; c) cylindryczny reaktor o wysokości 65 cm i objętości roboczej 350 cm 3 ; d) naczynie na próbki; e) pompa do przedmuchiwania aparatury powietrzem; f) generatora ozonu DST-15, (Blue Planet); g) butla z tlenem medycznym (Linde) ozonowania. Na Rycinie 13 przedstawiono fotografię stanowiska do badań procesu Rycina 13. Stanowisko badawcze do ozonowania 36

Próbki były pobierane na początku procesu oraz po przepuszczeniu przez reaktor założonej objętości gazu. W pobranych próbkach oznaczano stężenia badanych antybiotyków, OWO i ekotoksyczność. Dawkę O3, która była absorbowana przez próbkę określano za pomocą miareczkowania jodometrycznego [49]. W tym celu gaz z generatora przepuszczano w reaktorze przez 350 ml roztworu zawierającego 3,5 g jodku potasu w H2S04 o stężeniu 0,1 mol/l. Próbki były pobierane po przejściu przez roztwór ustalonej objętości gazu i miareczkowane roztworem Na2S2O3 wobec skrobi jako wskaźnika. Jeden mol zużytego Na2S2O3 odpowiada dwóm molom pochłoniętego O3 [49]. 3.3.2.6. Biodegradacja Badania biodegradacji antybiotyków, zwłaszcza w roztworach o tak wysokich stężeniach wymagają zastosowania środowiska zawierającego mikroorganizmy zaadaptowane do tego typu zanieczyszczeń. Dlatego proces prowadzono w odciekach glebowych potencjalnie zawierających dużą różnorodność mikroorganizmów (z parku miejskiego oraz pola uprawianego w sposób naturalny z terenów wiejskich). Odciek przygotowano poprzez zmieszanie w stosunku objętościowym 1:1 gleby z wodą destylowaną i kondycjonowanie z jednoczesnym napowietrzaniem przez okres 3 dni. Po tym czasie zawiesinę pozostawiono na 1 godzinę do częściowej sedymentacji. W eksperymentach wykorzystano warstwę z nad osadu. Naważki antybiotyków rozpuszczano bezpośrednio w tak uzyskanym odcieku. Proces biodegradacji prowadzono na stanowisku przedstawionym na Rycinach 14 i 15. 37

e) j) d) c) f) g) h) i) k) b) a) Rycina 14. Stanowisko badawcze do biodegradacji a) filtr HEPA, b) kompresor bezolejowy, c) zbiornik, d) zawór redukcyjny, e) manometr, f) zbiornik bezpieczeństwa, g) płuczka z roztworem KMnO 4, h) separator, i) absorber z węglem aktywnym, j) zawór, k) reaktory barbotażowe Rycina 15. Stanowisko do badań biodegradacji Przed pompowaniem do reaktorów powietrze było dwukrotnie filtrowane, sterylizowane i nawilżane w roztworze KMnO4 o stężeniu 1%. Podczas całego eksperymentu temperatura wynosiła 22-24 C. Zawartość reaktorów była mieszana pompowanym powietrzem. Przed i w trakcie trwania procesu pobierano próbki i po odwirowaniu oznaczano w nich stężenie antybiotyków. Próbki do oznaczeń ekotoksyczności zamrażano (-18 C) w celu późniejszej analizy [46,35]. Z przyczyn 38

wynikających z charakterystyki procesu biodegradacji bezcelowym byłoby oznaczanie zmian wartości OWO. 3.4. Oznaczanie stężeń badanych antybiotyków Aby ocenić efektywność badanych procesów, oznaczano stężenia antybiotyków w badanych próbkach metodą HPLC. Zastosowano procedury opisane przez Adamek i wsp. [37]. Szczegóły tych procedur przedstawiono w Tabeli III. Tabela III. Warunki prowadzenia oznaczeń antybiotyków Warunki analizy izokratycznej HPLC Nazwa Eluent A Eluent B Kolumna AMP AcCN - 5%; 0,1% roztwór Supelcosil LC-18; HCOOH - 95% 5 μm; 250 4,6 mm TYL AcCN - 70%; roztwór H3PO4 Hypersil C-18; 5 μm; o ph 2,7-30% 150 2,1 mm DOX AcCN - 70%; roztwór H3PO4 Hypersil C-18; ziarno o ph 2,7-30% 5 μm; 150 2,1 mm Długość fali detektora [nm] 210 290 360 3.5. Oznaczanie stężeń OWO Stopień mineralizacji próbek oceniano na podstawie zmian stężenia OWO oznaczanego w próbkach metodą Lange. Wykorzystywano w tym celu komercyjne testy kuwetowe OWO LCK385 (3-30 mg C/l; HACH LANGE), a rezultaty odczytywano z użyciem spektrofotometru VIS DR 3900. Przed analizą próbki rozcieńczano wodą redestylowaną w celu osiągniecia wymaganego testem zakresu stężeń. 3.6. Oznaczanie toksyczności badanych próbek W celu oceny ekotoksyczności badanych próbek wykorzystano procedurę opisaną przez Wadhia i wsp. [47]. Z każdej z badanych próbek pobierano po 5 ml roztworu, następnie dodawano do niego po 0,1 g stałego peptonu sojowego i po 100 µl roztworu TZR (1%). Tak przygotowane próbki po wyjałowieniu za pomocą mikrofiltracji przez filtr membranowy 0,20 µm nanoszono na płytki titracyjne 39

w poziomych rzędach (po 150 µl każdej próbki do 12 dołków). Ostatni rząd na płytce stanowił kontrolę wzrostu mikroorganizmów. Zawierał on roztwór po badanym procesie, wraz z pożywką, traktowany identycznie jak roztwory antybiotyków lecz niezawierający tych leków. Dołki w 11 pionowych kolumnach na płytce po nałożeniu wszystkich próbek szczepiono inokulum z wody rzecznej (po 30 µl na dołek) lub z oczyszczonych ścieków (po 15 µl na dołek). Kolumna 12 pozostała niezaszczepiona stanowiła kontrolę sterylności próby. Wszystkie opisane wyżej czynności wykonywano w komorze laminarnej. Schemat przygotowania płytki ilustruje Rycina 16. kontrola roztwór antybiotyku przed reakcją roztwór antybiotyku po reakcji (degradacji) pusty rząd Rycina 16. Schemat przygotowania płytki mikrotitracyjnej dla badań ekotoksyczności Zaszczepione płytki umieszczano w inkubatorze na okres 48 h. Temperatura inkubacji wynosiła 30 C. Podobnie jak w przypadku oceny wrażliwości mikroorganizmów inokulum na antybiotyki (rozdział 3.3.1.), wyniki oceniano na podstawie pomiaru intensywności zabarwienia dołków z wykorzystaniem programu MARA. 40

3.7. Opracowanie wyników Na podstawie danych literaturowych oraz schematów planowanych eksperymentów określono dla każdego procesu główny czynnik mający wpływ na jego wydajność. W przypadku reakcji fotochemicznych (fotokatalizy homogenicznej i heterogenicznej) czynnikiem limitującym przebieg procesu jest liczba fotonów pochłanianych przez mieszaninę reakcyjną (nf). Obliczono ją za pomocą następującego równania: n F = I A S t (19) Gdzie I A oznacza natężenie promieniowania absorbowanego przez próbkę, S stanowi powierzchnię mieszaniny eksponowaną na promieniowanie a t określa czas trwania naświetlania. Dla reakcji prowadzonych w obecności suspensji TiO2 transmisja (przepuszczalność T) próbki dla promieniowana UVA jest 0, zatem IA = I0, gdzie I0 to natężenie promieniowania mierzone na powierzchni naświetlanego roztworu. Natomiast w przypadku reakcji z FeCl3 : T = 0,69, zatem IA = 0,69 I0. Wydajność kwantową reakcji ( została obliczona za pomocą równania (20): Φ = 100 n s n F (20) gdzie oznacza liczbę moli zdegradowanego antybiotyku. Dla procesu Fentona jako czynnik limitujący wybrano liczbę moli użytego nadtlenku wodoru (nh2o2). Reagent ten ma znacznie wyższą cenę niż wykorzystywane w procesie sole żelaza [30,31]. Efektywność tej reakcji (EF) względem nadtlenku wodoru obliczono wg równania (21): E F = 100 n s n H 2O2 (21) W przypadku ozonowania decydujący wpływ ma liczba moli O3 zaabsorbowanych przez roztwór (no3). Wielkość tą wyznaczono w wyniku 41

miareczkowania próbek za pomocą roztworu Na2S2O3 (rozdział 3.3.2.5.). Efektywność procesu ozonowania (E O3 ) wyliczono w oparciu o równanie (22): E O3 = 100 n s n O 3 (22) Dla przebiegu hydrolizy oraz biodegradacji jako kluczowy parametr limitujący przebieg procesu wybrano czas trwania reakcji. 3.8. Sposób przedstawienia wyników Rezultaty oceny wrażliwości badanych mikroorganizmów przedstawiono w postaci zależności wzrostu mikroorganizmów od stężenia antybiotyku, którego toksyczność oceniano. Wyniki uzyskane w trakcie pozostałych eksperymentów zostały przedstawione w postaci zestawionych ze sobą: wykresów zależności zmian stężeń antybiotyków i OWO od czynnika limitującego proces, wykresów zależności wzrostu mikroorganizmów inokulum narażonych na działanie roztworów po badanych procesach od czynnika je limitującego. Wykresy sporządzano w programach: Microsoft Excel 2016 (Microsoft) oraz Statistica 12 (Statsoft). 3.9. Analiza statystyczna W celu oceny współzależności pomiędzy czynnikami limitującymi efektywność badanych procesów degradacyjnych a wzrostem mikroorganizmów wykonano analizę statystyczną dla każdej z serii wyników. Ze względu na brak rozkładów normalnych, w każdym przypadku zastosowano test Kruskala-Wallisa. Wybrany test umożliwia weryfikację hipotezy zerowej czy uzyskane wyniki pochodzą z populacji o tych samych medianach. Za podstawę do odrzucenia hipotezy zerowej, czyli stwierdzenia istotności statystycznej uzyskanych wyników przyjęto p < 0,05. Dokonano również obliczeń wyznaczających wartości ekstremalne, które to zostały następnie usunięte z badanej populacji wyników. Kolejnym elementem było wykonanie wykresów ramka-wąsy 42

w celu wizualizacji uzyskanych wyników analizy statystycznej. Wszystkie obliczenia, testy oraz wykresy wykonano za pomocą programu Statistica 12 (Statsoft). 3.10. Program badań Na poniższych schematach przedstawiono szczegółowo przyjęte założenia i zadania jakie były wykonywane w trakcie trwania eksperymentów. 3.10.1. Ocena wrażliwości mikroorganizmów inokulum na wybrane do badań antybiotyki. Badania wstępne badania literaturowe Wybór optymalnych stężeń antybiotyków stosowanych w dalszych eksperymentach Ocena wrażliwości mikroorganizmów na szeroki zakres stężeń badanych antybiotyków 43

3.10.2. Proces fotokatalizy homogenicznej w obecności FeCl3 Badania wstępne badania literaturowe Identyfikacja głównego czynnika determinującego kinetykę procesu fotokatalizy w obecności FeCl3 Wybór optymalnych warunków prowadzenia procesu Prowadzenie eksperymentów w warunkach uznanych za optymalne Ocena wydajności mineralizacji Ocena aktywności antymikrobiologicznej Ocena wydajności degradacji Sumaryczna ocena prowadzonych procesów 44

3.10.3. Proces Fentona Badania wstępne badania literaturowe Identyfikacja głównego czynnika determinującego kinetykę procesu Fentona Wybór optymalnych warunków prowadzenia procesu Prowadzenie eksperymentów w warunkach uznanych za optymalne Ocena wydajności mineralizacji Ocena aktywności antymikrobiologicznej Ocena wydajności degradacji Sumaryczna ocena prowadzonych procesów 45

3.10.4. Proces fotokatalizy heterogenicznej z TiO2 Badania wstępne badania literaturowe Identyfikacja głównego czynnika determinującego kinetykę procesu fotokatalizy z TiO2 Wybór optymalnych warunków prowadzenia procesu Prowadzenie eksperymentów w warunkach uznanych za optymalne Ocena wydajności mineralizacji Ocena aktywności antymikrobiologicznej Ocena wydajności degradacji Sumaryczna ocena prowadzonych procesów 46

3.10.5. Proces hydrolizy w warunkach aseptycznych Badania wstępne badania literaturowe Identyfikacja głównego czynnika determinującego kinetykę procesu hydrolizy Wybór optymalnych warunków prowadzenia procesu Prowadzenie eksperymentów w warunkach uznanych za optymalne Ocena wydajności mineralizacji Ocena aktywności antymikrobiologicznej Ocena wydajności degradacji Sumaryczna ocena prowadzonych procesów 47

3.10.6. Proces ozonowania Badania wstępne badania literaturowe Identyfikacja głównego czynnika determinującego kinetykę procesu ozonowania Wybór optymalnych warunków prowadzenia procesu Prowadzenie eksperymentów w warunkach uznanych za optymalne Ocena wydajności mineralizacji Ocena aktywności antymikrobiologicznej Ocena wydajności degradacji Sumaryczna ocena prowadzonych procesów 48

3.10.7. Proces biodegradacji Badania wstępne badania literaturowe Identyfikacja głównego czynnika determinującego kinetykę procesu biodegradacji Wybór optymalnych warunków prowadzenia procesu Prowadzenie eksperymentów w warunkach uznanych za optymalne Ocena aktywności antymikrobiologicznej Ocena wydajności degradacji Sumaryczna ocena prowadzonych procesów 49

4. WYNIKI 4.1. Walidacja metod analitycznych Opisane w rozdziale 3 warunki analiz chromatograficznych wykorzystywanych w eksperymentach zostały opracowane wcześniej w ZChOiN. Niemniej przed przystąpieniem do eksperymentów zostały one zwalidowane w zakresie stosowanych stężeń. Uzyskane parametry krzywych kalibracyjnych oraz ich poziomy ufności zestawiono w Tabeli IV. Tabela IV. Charakterystyka statystyczna krzywych wzorcowych oznaczania badanych antybiotyków techniką HPLC Oznaczana substancja Zakres stężeń [mg/l] Liczba punkt. eksp. (n) Równanie regresji y=ax+b R 2 Błąd standardowy Istotność statystyczna (p) DL a) [mg/l] QL a) [mg/l] AMP 0-200 10 DOX 0-50 10 TYL 0-300 11 y = 62,9x 57,0 y = 37,1x 12,2 y = 41,5x + 63,5 0,9997 0,9993 0,9994 a 0,54 3,28x10-14 b 38,0 0,17 a 0,36 8,5x10-14 b 10,3 0,27 a 0,33 6,83x10-16 b 39,0 0,14 a) wyniki obliczone na podstawie wartości stosunku sygnału pomiarowego do szumu dla nastrzyku 20 µl 0,10 0,30 0,03 0,11 0,12 0,40 Wyniki walidacji, oznaczenia antybiotyków metodą HPLC we wszystkich badanych przypadkach wykazywały liniową zależność pomiędzy powierzchnią pod pikiem chromatograficznym a stężeniem tych leków. Wynika z tego, że kinetykę badanych procesów można opisywać jako zależność stosunku powierzchni piku oznaczanej substancji do powierzchni piku wzorca tej substancji od czynnika limitującego proces. 50

4.2. Wyznaczanie wrażliwości mikroorganizmów Produkty oczyszczania ścieków zawierających antybiotyki mogą być równie niebezpieczne dla środowiska jak zawarte w nich leki. Jednym z podstawowych celów pracy była ocena efektywności procesów używanych do oczyszczania ścieków w kontekście powodowanych przez nie zmian ekotoksyczności. W tym przypadku miarą ekotoksyczności jest zdolność do hamowania wzrostu drobnoustrojów pochodzących ze środowisk narażonych na oddziaływanie ścieków zawierających antybiotyki, czyli np. z oczyszczalni ścieków lub wody rzecznej. Jak już wspomniano, aby obserwować zmiany ekotoksyczności w akceptowalnym przedziale czasowym konieczne jest stosowanie w eksperymentach stężeń antybiotyków na tyle dużych, by powodowały inhibicję wzrostu mikroorganizmów testowych i zarazem nie działały silnie inhibitująco na badane procesy oczyszczania. W celu wyznaczenia wrażliwości mikroorganizmów pochodzących z wody rzeki Brynicy i z oczyszczalni ścieków wykonano testy zgodnie z procedura opisaną w rozdziale 3.3.1. Przykładowy obraz płytki testowej z gradientem stężenia DOX oraz odpowiadający jej raport uzyskany za pomocą programu MARA przedstawiono na Rycinach 17 i 18. Rycina 17. Obraz przykładowej płytki mikrotitracyjnej zawierającej DOX o maksymalnym stężeniu 50 mg/l i kroku rozcieńczeń 4, zaszczepionej oczyszczonymi ściekami i inkubowanej przez 48 godziny 51

Rycina 18. Raport uzyskany za pomocą aplikacji MARA po analizie płytki przedstawionej na Rycina 17. Zależność wzrostu mikroorganizmów wykorzystywanych w testach (zawartych w inokulum) od stężeń badanych antybiotyków i ich maksymalne stężenia przedstawiono na Rycinach 19-24. 52

Rycina 19. Wpływ stężenia AMP na wzrost wykorzystywanych jako inokulum, nieselekcjonowanych mikroorganizmów pochodzących z rzeki Brynicy Rycina 20. Wpływ stężenia AMP na wzrost wykorzystywanych jako inokulum, nieselekcjonowanych mikroorganizmów pochodzących z oczyszczonych ścieków 53

Rycina 21. Wpływ stężenia DOX na wzrost wykorzystywanych jako inokulum, nieselekcjonowanych mikroorganizmów pochodzących z rzeki Brynicy Rycina 22. Wpływ stężenia DOX na wzrost wykorzystywanych jako inokulum, nieselekcjonowanych mikroorganizmów pochodzących z oczyszczonych ścieków 54

Rycina 23. Wpływ stężenia TYL na wzrost wykorzystywanych jako inokulum, nieselekcjonowanych mikroorganizmów pochodzących z rzeki Brynicy Rycina 24. Wpływ stężenia TYL na wzrost wykorzystywanych jako inokulum, nieselekcjonowanych mikroorganizmów pochodzących z oczyszczonych ścieków 55

Z przedstawionych zależności (Ryciny 19-24) wynika, że w każdym badanym przypadku możliwe było obserwowanie efektu ekotoksycznego. Na tej podstawie oraz przy założeniu, że stężenia degradowanych antybiotyków nie powinny się znacznie różnić, w dalszych badaniach postanowiono wykorzystywać ich maksymalne stężenia zastosowane w omawianym eksperymencie. 56

4.3. Fotodegradacja prowadzona w obecności FeCl3 (fotokataliza homogeniczna, fotosensybilizacja) Proces fotosensybilizowanej degradacji badanych antybiotyków prowadzono w roztworach zawierających 1 mmol/l FeCl3 przy ph wynoszącym ok. 3,0. Warunki te ustalono jako optymalne na podstawie wcześniejszych badań literaturowych [28]. Roztwory naświetlano promieniowaniem UVA przez 300 minut, co odpowiada strumieniowi świetlnemu padającemu na powierzchnię równemu 0,74 mmol fotonów. Ilość zaabsorbowanych fotonów przez próbkę wynosiła nf 0,51 mmol). Dynamikę zmian stężenia AMP i stężenia OWO w roztworach AMP oraz zmiany ekotoksyczności jej naświetlanych roztworów przedstawiono na Rycinach 25-26. Dynamikę zmian stężenia DOX i stężenia OWO w roztworach DOX oraz zmiany ekotoksyczności jej naświetlanych roztworów przedstawiono na Rycinach 27-28. Dynamikę zmian stężenia TYL i stężenia OWO w roztworach TYL oraz zmiany ekotoksyczności jej naświetlanych roztworów przedstawiono na Rycinach 29-30. 57

Rycina 25. Zmiany stężenia AMP i OWO podczas fotodegradacji prowadzonej w obecności FeCl 3 120 100 Wzrost względem kontroli [%] 80 60 40 20 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Fotony [mmol] Rycina 26. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w efluencie inkubowanych w pożywce zawierającej produkty fotodegradacji AMP prowadzonej w obecności FeCl 3. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05 58

Rycina 27. Zmiany stężenia DOX i OWO podczas fotodegradacji prowadzonej w obecności FeCl 3 120 100 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające Wzrost względem kontroli [%] 80 60 40 20 0-20 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Fotony [mmol] Rycina 28. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w efluencie inkubowanych w pożywce zawierającej produkty fotodegradacji DOX prowadzonej w obecności FeCl 3. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05 59

Rycina 29. Zmiany stężenia TYL i OWO podczas fotodegradacji prowadzonej w obecności FeCl 3 120 100 Wzrost względem kontroli [%] 80 60 40 20 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające 0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Fotony [mmol] Rycina 30. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w efluencie inkubowanych w pożywce zawierającej produkty fotodegradacji TYL prowadzonej w obecności FeCl 3. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05 60

Po dodaniu FeCl3 do roztworów antybiotyków stężenia leków ulegają zmniejszeniu jeszcze przed rozpoczęciem naświetlana. Jest to spowodowane koordynowaniem cząsteczek leków przez kation Fe 3+ a nie ich rozkładem. Podczas naświetlania obserwowano świadczące o degradacji, dalsze, całkowite zmniejszenie stężenia badanych antybiotyków. W przypadku DOX proces ten zachodził znacznie wolniej. W warunkach eksperymentu uzyskano jedynie ok. 90% usuniecie tego leku (Rycina 27). Nie jest wykluczone, że po przedłużeniu naświetlania uzyskanoby całkowity rozkład DOX. Równolegle w roztworach AMP i TYL obserwowano świadczące o mineralizacji powolne obniżanie stężenia OWO (efekt ten ostatecznie nie wystąpił w roztworze DOX). Niemniej całkowitemu rozkładowi AMP i TYL towarzyszyło niespełna 20% obniżenia wartości OWO (Ryciny 25 i 29). Wraz z obniżaniem zawartości antybiotyków w naświetlanych roztworach obserwowano proporcjonalne obniżanie ekotoksyczności tych roztworów. Wzrost mikroorganizmów inokulum w próbkach uzyskanych po naświetlaniu roztworów AMP i TYL był porównywalny z kontrolą (Ryciny 26 i 30). Świadczy to o całkowitym zaniku efektu toksycznego względem inokulum. Natomiast w roztworze zawierającym pozostałości DOX i produkty jej degradacji na koniec eksperymentu nadal obserwowano ok. 20 % inhibicję wzrostu mikroorganizmów (Ryciny 28). Dane dotyczące efektywności (wydajności kwantowej) badanego procesu fotochemicznego zamieszczono w Tabeli V. Tabela V. Wydajność kwantowa fotodegradacji antybiotyków w obecności FeCl 3 Stopień degradacji antybiotyku [%] Antybiotyk 50 90 100 Średnia, osiągnięta wydajność kwantowa degradacji antybiotyku [%] AMP 37,0 9,3 3,4 DOX 11,2 - - TYL 20,9 7,3 3,4 61

Ponieważ degradacja DOX zachodzi z najmniejszą szybkością, odpowiada jej najniższa wydajność kwantowa procesu fotochemicznego. Jednak w każdym przypadku można zaobserwować obniżanie jej wartości wraz z dążeniem do osiągania wyższych stopni degradacji. 4.4. Proces Fentona Jak już wcześniej wspomniano, proces Fentona jest jedną z metod AOP częściej stosowanych do rozkładu niebezpiecznych zanieczyszczeń w ściekach. Kluczowe znaczenie dla ekonomiki tej metody ma ilość zużywanego H2O2. W porównaniu z pozostałymi ten substrat ma znacznie wyższą cenę [30,31]. W eksperymencie zastosowano stałe stężenie FeSO4 wynoszące 1,0 mmol/l oraz odpowiednio dobrane dawki H2O2 w celu uzyskania zakresu stężeń od 0-20 mmol/l. ph reagujących mieszanin było zbliżone do optymalnego i wynosiło ok. 3,0 [54]. Zależność zmian stężenia AMP i stężenia OWO w roztworach AMP oraz zmiany ekotoksyczności roztworów od użytej dawki H2O2 przedstawiono na Rycinach 31-32. Zależność zmian stężenia DOX i stężenia OWO w roztworach DOX oraz zmiany ekotoksyczności roztworów od użytej dawki H2O2 przedstawiono na Rycinach 33-34. Zależność zmian stężenia TYL i stężenia OWO w roztworach TYL oraz zmiany ekotoksyczności roztworów od użytej dawki H2O2 przedstawiono na Rycinach 35-36. 62

Rycina 31. Zmiany stężenia AMP i OWO podczas procesu Fentona A Wzrost względem kontroli [%] 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające -20 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 nh 2 O 2 [mmol] B 120 100 80 60 40 20 0 Wzrost względem kontroli [%] Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające -20 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 nh 2 O 2 [mmol] Rycina 32. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty degradacji AMP metodą Fentona. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05 63

Rycina 33. Zmiany stężenia DOX i OWO podczas procesu Fentona A Wzrost względem kontroli [%] 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0-20 -40 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 nh 2 O 2 [mmol] Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające B 120 Wzrost względem kontroli [%] 100 80 60 40 20 0 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające -20 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 nh 2 O 2 [mmol] Rycina 34. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty degradacji DOX metodą Fentona. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05 64

Rycina 35. Zmiany stężenia TYL i OWO podczas procesu Fentona Wzrost względem kontroli [%] A 160 140 120 100 80 60 40 20 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające 0-20 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 nh 2 O 2 [mmol] B 120 Wzrost względem kontroli [%] 100 80 60 40 20 0 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające -20 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 nh 2 O 2 [mmol] Rycina 36. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty degradacji TYL metodą Fentona. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05 65

W każdym przypadku stężenie antybiotyku spada niemalże do zera przy stężeniu H2O2 mniejszym niż 5 mmol/l. W przypadku AMP obserwujemy bardzo szybki wzrost stopnia degradacji związku wyjściowego wraz ze wzrostem stężenia nadtlenku wodoru. Już po dodaniu najniższej dawki nadtlenku wodoru następuje spadek stężenia antybiotyku o 60%, aby przy stężeniu 2,5 mmol/l osiągnąć stopień degradacji bliski 99% (Rycina 31). DOX cechowała się wyższą podatnością na rozkład w porównaniu do pozostałych antybiotyków. Już najmniejsza zastosowana dawka nadtlenku wodoru spowodowała, że jej stężenie spadło o 90% (Rycina 33). Proces degradacji TYL również zachodził z dużą wydajnością już przy niewielkim stężeniu nadtlenku wodoru. Przy pierwszej dawce tego odczynnika w próbce zostało tylko 25% wyjściowej ilości antybiotyku (Rycina 35). Wyniki przedstawione na Rycinach 31, 33 i 35 pokazują jednak, że efektywność mineralizacji związków organicznych (usuwania OWO) po reakcji Fentona nie jest tak wysoka jak sama degradacja antybiotyków. Maksymalny uzyskiwany w eksperymencie stopień mineralizacji antybiotyków przy zastosowaniu roztworu o stężeniu H2O2 20,0 mmol/l wyniósł od 35% do 60% w zależności od antybiotyku. Mineralizacja DOX na tle pozostałych związków była na najwyższym poziomie. Jest to najprawdopodobniej spowodowane faktem, iż roztwór tego antybiotyku miał niższe od pozostałych stężenie wyjściowe OWO. Efektywność mineralizacji dla TYL była niższa niż dla pozostałych. Efekt ten mógł z kolei wynikać z wyższego od pozostałych stężenia wyjściowego OWO roztworu TYL. Stwierdzono, że w przypadku AMP i DOX wzrost mikroorganizmów na poziomie kontroli obserwowano w próbkach po zastosowaniu 2,5 i 5 mmol/l H2O2 (Ryciny 32 i 34), dla TYL mniej ekotoksyczne produkty uzyskiwano w próbkach zawierających od 0,5 do 2,5 mmol/l H2O2 (Rycina 36). W każdym badanym przypadku wykazano istotną statystycznie (p < 0,05) korelację pomiędzy wzrostem mikroorganizmów a liczbą moli H2O2 (Ryciny 32, 34, 36). Zwiększony wzrost mikroorganizmów następuje początkowo wraz ze wzrostem stężenia nadtlenku wodoru, następnie mimo dalszego zwiększania jego dawek, drastycznie spada. Dane dotyczące efektywności (ilości zużytego H2O2) omawianego procesu zamieszczono w Tabeli VI. 66

Tabela VI. Wydajność degradacji antybiotyków metodą Fentona względem H 2O 2 Stopień degradacji antybiotyku [%] 90 100 Antybiotyk Średnia, osiągnięta wydajność degradacji antybiotyku względem H2O2 [%] AMP 2,6 ~ 1,1 DOX - ~ 1,0 TYL 1,7 ~ 0,4 Opisana wyżej, większa ekotoksyczność próbek po zastosowaniu małych dawek nadtlenku wodoru może świadczyć o tym, że taka jego ilość nie jest wystarczająca do rozłożenia antybiotyków i ich aktywność nadal jest zachowana. Natomiast w próbkach, w których dawki nadtlenku wodoru wynosiły powyżej 10 mmol/l, (5 mg/l dla TYL) wzrost bakterii był minimalny. Toksycznością może wykazywać się pozostały nadtlenek wodoru. Niewykluczone jest również, że w tych warunkach któryś z produktów rozkładu antybiotyków jest ekotoksyczny wobec bakterii. 4.5. Fotokataliza heterogeniczna z TiO2 Proces fotokatalitycznej degradacji badanych antybiotyków prowadzono w roztworach zawierających 500 mg/l suspensji komercyjnego katalizatora TiO2-P25. Podobnie jak poprzednio optymalne warunki procesu ustalono na podstawie danych literaturowych [23,38,44]. Po ustaleniu równowagi adsorpcyjnej mieszaniny naświetlano ją promieniowaniem UVA przez 300 minut, co odpowiada całkowitemu strumieniowi świetlnemu absorbowanemu przez próbkę równemu 0,74 mmol fotonów. Dynamikę zmian stężenia AMP i stężenia OWO w roztworach AMP oraz zmiany ekotoksyczności jej naświetlanych roztworów przedstawiono na Rycinach 37-38. Dynamikę zmian stężenia DOX i stężenia OWO w roztworach DOX oraz zmiany ekotoksyczności jej naświetlanych roztworów przedstawiono na Rycinach 39-40. Dynamikę zmian stężenia TYL i stężenia OWO w roztworach TYL oraz zmiany ekotoksyczności jej naświetlanych roztworów przedstawiono na Rycinach 41-42. 67

Rycina 37. Zmiany stężenia AMP i OWO podczas fotokatalizy z TiO 2 Wzrost względem kontroli [%] B140 B140 160 120 Wzrost wzrost względem kontroli [%] 100 80 60 40 20 0-20 A 140 120 120 100 100 80 80 60 60 40 40 20 0 B140 B140 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające Średnia Średnia Średnia±Błąd Średnia±Błąd std std Średnia±Odch.std Odstające Odstające -20-0,2-0,2 0,0 0,0 0,2 0,2 0,4 0,4 0,6 0,6 0,8 0,8 1,0 1,0 1,2 1,2 1,4 1,4 Fotony Fotony fotony [mmol] [mmol] 120 120 Wzrost względem kontroli [%] Wzrost względem kontroli [%] 100 80 60 40 20 0-20 100 80 60 40 20 0 Średnia Średnia Średnia±Błąd Średnia±Błąd std std Średnia±Odch.std Odstające Odstające -20-0,2-0,2 0,0 0,0 0,2 0,2 0,4 0,4 0,6 0,6 0,8 0,8 1,0 1,0 1,2 1,2 1,4 1,4 Fotony Fotony [mmol] [mmol] Rycina 38. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty fotodegradacji AMP z zastosowaniem TiO 2. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05 68

Rycina 39. Zmiany stężenia DOX i OWO podczas fotokatalizy z TiO 2 Wzrost względem kontroli [%] Wzrost względem kontroli [%] B140A B 160 140 120 Wzrost wzrost względem kontroli [%] 100 80 60 40 20 0-20 140 120 120 100 100 80 80 60 60 40 40 B140 B B140 180 A 160 120 120 140 100 100 120 Wzrost względem kontroli [%] 80 60 40 20 0-20 Średnia Średnia±Błąd Średnia std Średnia±Odch.std Średnia±Błąd std Odstające Średnia±Odch.std Odstające 20 Średnia Średnia Średnia±Błąd Średnia±Błąd std std 0 Średnia±Odch.std Odstające Odstające -20-0,2-0,2 0,0 0,0 0,2 0,2 0,4 0,4 0,6 0,6 0,8 0,8 1,0 1,0 1,2 1,2 1,4 1,4 Fotony Fotony fotony [mmol] [mmol] 100 80 60 80 60 40 40 20 20 0 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające Średnia Średnia Średnia±Błąd Średnia±Błąd std std Średnia±Odch.std Odstające Odstające -20-0,2-0,2 0,0 0,0 0,2 0,2 0,4 0,4 0,6 0,6 0,8 0,8 1,0 1,0 1,2 1,2 1,4 1,4 Fotony Fotony [mmol] [mmol] Rycina 40. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty fotodegradacji DOX z zastosowaniem TiO 2. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05 69

Wzrost względem kontroli [%] Wzrost względem kontroli [%] Rycina 41. Zmiany stężenia TYL i OWO podczas fotokatalizy z TiO 2 B140 A 180 120 Wzrost względem kontroli [%] 100 80 60 40 20 0-20 B140 B 120 100 80 60 40 20 Wzrost względem kontroli [%] 0-20 160 140 120 100 80 60 40 20 0-20 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające -40-0,2-0,2 0,0 0,0 0,2 0,2 0,4 0,4 0,6 0,6 0,8 0,8 1,0 1,0 1,2 1,2 1,4 1,4 140 120 100 80 60 40 20 Fotony Fotony [mmol] [mmol] Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające 0-0,2-0,2 0,0 0,0 0,2 0,2 0,4 0,4 0,6 0,6 0,8 0,8 1,0 1,0 1,2 1,2 1,4 1,4 Fotony Fotony [mmol] [mmol] Średnia Średnia Średnia±Błąd std std Średnia±Odch.std Odstające Rycina 42. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty fotodegradacji TYL z zastosowaniem TiO 2. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05 70

Procesy sorpcyjne (przed rozpoczęciem naświetlania) nie powodowały znaczącego obniżenia stężeń badanych antybiotyków. W każdym przypadku uzyskiwano świadczące o degradacji, obniżenie ich stężenia podczas naświetlania. Degradacja w przypadku Doksycykliny zachodziła najszybciej. Całkowite usunięcie antybiotyku z próbki osiągnięto po pochłonięciu strumienia promieniowania niosącego ok. 0,55 mmola fotonów (Rycina 39). Tylozyna i Ampicylina charakteryzowały się zbliżoną dynamiką procesu degradacji wyjściowych związków. W obu przypadkach uzyskano całkowity rozkład związków badanych po pochłonięciu ponad 1 mmola fotonów (Ryciny 37 i 41). Mineralizacja postępowała znacząco wolniej od degradacji samych antybiotyków. Dlatego też proces uzyskania nieorganicznych produktów reakcji trwa dłużej, niż sama degradacja antybiotyków. Za pomocą badanego procesu udało się zmineralizować aż 80% próbki wyjściowej Doksycykliny (Rycina 39). W przypadku Tylozyny mineralizacja nie była równie skuteczna, gdyż osiągnięto 50% pierwotnego poziomu zawartości związków organicznych (Rycina 41). Dla Ampicyliny uzyskano stopień mineralizacji próbki wyjściowej wynoszący 70% (Rycina 37). Nie jest wykluczone, że podczas dalszego naświetlania w każdym przypadku możliwe by było uzyskanie wyższych stopni mineralizacji [42]. W trakcie trwania całej reakcji można zauważyć, że ze zwiększaniem wielkości strumienia świetlnego (wydłużeniem czasu naświetlania) obniżeniu ulega wypadkowa ekotoksyczność badanych próbek (rośnie stopień wzrostu mikroorganizmów względem kontroli). Wiąże się to ze spadkiem stężenia antybiotyków oraz z faktem, że produkty ich degradacji nie są toksyczne względem tych mikroorganizmów. W każdym przypadku w trakcie eksperymentu osiągnięto intensywność wzrostu mikroorganizmów zbliżona do tej w kontroli bez antybiotyków. Szczególne dużą dynamiką charakteryzuje się to zjawisko w przypadku DOX (Rycina 40). Jest to związane z jednej strony z większą szybkością jej degradacji i mineralizacji, a z drugiej strony, z jej znacznie większą od pozostałych badanych leków toksycznością (dlatego uzyskany efekt jest lepiej widoczny). Analiza statystyczna przeprowadzona dla reakcji fotokatalizy z TiO2 wykazała, że zależności pomiędzy wzrostem ilości dostarczanych 71

do mieszaniny reakcyjnej liczby fotonów a wzrostem mikroorganizmów, zilustrowane na Rycinach 38, 40, 42) są znamienne statystycznie (p < 0,05). Dane dotyczące efektywności (wydajności kwantowej) badanego procesu fotochemicznego zamieszczono w Tabeli VII. Tabela VII. Wydajność kwantowa fotodegradacji antybiotyków z TiO 2 Stopień degradacji antybiotyku [%] Antybiotyk 50 90 100 Średnia, osiągnięta wydajność kwantowa degradacji antybiotyku [%] AMP 12,3 4,9 ~ 3,3 DOX 8,1 3,5 ~ 1,2 TYL 10,4 3,3 ~ 1,8 4.6. Hydroliza w warunkach aseptycznych Hydrolizę badanych antybiotyków prowadzono w hermetycznie zamkniętych aseptycznych naczyniach polipropylenowych bez dostępu światła, w temperaturze 30 ± 0,2 o C przez łączny okres 144 dni. Do roztworów nie wprowadzano jakichkolwiek innych dodatków katalizujących reakcję lub korygujących ph. Obserwowany proces miał charakter abiotyczny. Ze względu na czytelność wykresów oraz brak istotnych zmian po 60 dniu hydrolizy w każdym przypadku procesu zawężono zakres przedstawionych danych do 60 dni. Dynamikę zmian stężenia AMP i stężenia OWO w roztworach AMP obserwowaną podczas hydrolizy oraz zmiany ekotoksyczności roztworów uzyskanych po hydrolizie przedstawiono na Rycinach 43-44. Dynamikę zmian stężenia DOX i stężenia OWO w roztworach DOX oraz zmiany ekotoksyczności roztworów przedstawiono na Rycinach 45-46. Dynamikę zmian stężenia TYL i stężenia OWO w roztworach TYL oraz zmiany ekotoksyczności roztworów przedstawiono na Rycinach 47-48. 72

Rycina 43. Zmiany stężenia AMP i OWO podczas hydrolizy A 160 Wzrost względem kontroli [%] 140 120 100 80 60 40 20 0 Średnia Średnia±Błąd std Średnia±Odch.std Odstające 0 5 10 15 20 25 30 35 Czas [dni] Rycina 44. Analiza statystyczna zmian wzrostu mikroorganizmów zawartych w wodzie z rzeki Brynicy (A) oraz w efluencie (B) inkubowanych w pożywce zawierającej produkty transformacji AMP uzyskane po hydrolizie. Dla wyznaczonej zależności p < 0,05 73