WARUNKI ZALICZENIA PRZEDMIOTU- 7 ECTS PRZEDMIOT PROGOWY!!! W1-4p W2-4p W3-4p W4-4p W5-4p W6-4p W7-4p W8-4p W9-4p W10-4p min 21p wyjściówka I 40p wyjściówka II 40p egzamin I egzamin II min 21p 60p 60p min 31p IZOLACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH Selektywne wyekstrahowanie z komórki roślinnej lub zwierzęcej danego typu kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) Podstawowy proces poprzedzający większość analiz molekularnych Jakość otrzymanego po ekstrakcji kwasu nukleinowego będzie warunkowała wszystkie następne analizy MIEJSCE PRACY UMIEJĘTNOŚCI JAKOŚĆ MATERIAŁU ENZYMY I ODCZYNNIKI DOBÓR METODY 1
MIEJSCE PRACY Miejsce przeznaczone do izolacji kwasów nukleinowych powinno znajdować się z dala od pomieszczeń, w których wykonuje się późniejsze analizy Powinno być podzielone na dwie strefy: 1. przygotowanie materiału biologicznego 2. Izolacja kwasów nukleinowych Powinno być regularnie sterylizowane Wszystkie prace związane z izolacją powinny być wykonywane w rękawiczkach (nitrylowych lub lateksowych) Kontaminacja (zanieczyszczenie jednego materiału biologicznego innym) jest największym niebezpieczeństwem laboratorium molekularnego!!!! ORGANIZACJA GENOMU-EUCARIOTA Genom jądrowy- chromosomy; skład chromatyny: białka (głównie histonowe) 50-60% DNA (30-40%) RNA (1-10%) JAKOŚĆ MATERIAŁU Każda komórka jądrzasta (eukariotyczna) będzie zawierała dwa typy kwasu nukleinowego w jądrze komórkowym i w cytoplazmie DNA genomowy (całkowity) /ang. total DNA/ to mieszanina DNA jądrowego /ang. nucleus DNA- ndna/ oraz DNA mitochondrialnego /ang. mitochondrial DNA-mtDNA/ RNA: rybosomowy RNA-rRNA: (28s rrna D, 18s rrna M, 16s rrna M, 5.8s rrna D, 5s RNA D ); Transportujący RNA- trna Matrycowy (niskocząsteczkowy) RNA- mrna Mikro RNA- mirna, sirna i in. Sposób pobierania materiału biologicznego i sposób jego przechowywania będzie miał bezpośredni wpływ na wydajność izolacji 2
JAKOŚĆ MATERIAŁU Komórka jako substancja organiczna ulega rozkładowi, dlatego kwasy nukleinowe znajdujące się w cytoplazmie degradują szybciej niż w jądrze komórkowym Jednoniciowa struktura RNA jest mniej stabilna niż dwuniciowa DNA Najszybciej degraduje niskocząsteczkowy RNA, najwolniej DNA jądrowy GŁÓWNE ETAPY IZOLACJI Dezintegracja błony komórkowej - liza Trawienie białek histonowych /DNA jądrowy/ Inaktywacja endogennych RNaz /RNA/ Usuwanie DNA lub RNA (w zależności od rodzaju izolowanego kwasu nukleinowego) Wytrącanie (ekstrahowanie) kwasów nukleinowych Stabilizacja kwasów nukleinowych ENZYMY W IZOLACJI KWASÓW NUKLEINOWYCH Enzymy proteolityczne- proteazy (hydrolazy katalizujące proteolizę- hydrolizę wiązań peptydowych) proteinaza (K)- endopeptydaza z rodziny proteaz serynowych (rozcina wiązania peptydowe wewnątrz łańcucha) - Jest inhibitorem nukleaz o bardzo szerokim spektrum (niszczy białka histonowe oraz keratynowe) - Wykazuje aktywność w temperaturach od 37 o do 60 o C, przy ph między 4 a 12. - Zachowuje aktywność w obecności związków denaturujących (np. formalina), chelatujących (np. EDTA) oraz w obecności inhibitorów trypsyny. 3
ENZYMY W IZOLACJI KWASÓW NUKLEINOWYCH Deoksyrybonukleazy (hydrolazy katalizujące hydrolizę łańcucha DNA- hydrolizę wiązań fosfodiestrowych) Deoksyrybonukleaza I (DNAza I)- endonukleaza (rozcina wiązanie fosfodiestrowe przy zasadzie pirymidynowej- Tyminie) - Wykazuje aktywność wobec cząsteczek jedno- i dwuniciowych - Fragmentuje DNA na polinukleotydy złożone z nie więcej niż 4 nukleotydów - Aktywność wykazuje w 37 o C; inaktywacja następuje w 65 o C ENZYMY W IZOLACJI KWASÓW NUKLEINOWYCH Rybonukleazy (hydrolazy katalizujące hydrolizę łańcucha RNA- hydrolizę wiązań fosfodiestrowych) Rybonukleaza A (RNaza A)- endonukleaza (rozcina wiązanie fosfodiestrowe przy zasadzie pirymidynowej- Uracylu) - Wykazuje aktywność wobec wszystkich cząsteczek RNA nie tworząc kompleksów z DNA. (specyficzność tworzenia kompleksów zależna jest od stężenia NaCl wraz ze wzrostem stężenia soli zwiększa się specyficzność hydrolizy) DEZINTEGRACJA BŁONY KOMÓRKOWEJ- LIZA Mechaniczna- homogenizacja Fizyczna- szok osmotyczny- zmiana ciśnienia osmotycznego błony komórkowej poprzez dodanie związków hipotonicznych denaturujących/detergentów - zawieszenie komórek w roztworze o ciśnieniu osmotycznym mniejszym niż w cytoplazmie) Szok temperaturowy (zamrożenie- rozmrożenie) 4
Metoda fenolowo-chloroformowa (organiczna) Mieszanina fenolu i chloroformu (1:1) lub fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego (25:24:1), pozwala wytrącić DNA z roztworu (po proteolizie). Dodanie mieszaniny tworzy dwie fazy: dolna- fenolowa; górna wodna z rozpuszczonym DNA; interfaza to zdenaturowane białko Zalety: metoda tania; można powtarzać proces ekstrakcji kilka razy Wady: praca z substancjami toksycznymi; należy uważać na pozostałości fenolu w próbkach Metoda wykorzystująca związki chelatujące (organiczna) Mechanizm działania żywicy chelatującej (Chelex 100) nie jest do końca poznany, jest ona silnym chelatorem jonów metali, przez co zabezpiecza DNA przed rozpadem w wysokiej temperaturze oraz chroni DNA przed degradacją przez nukleazy. Związek chelatujący opłaszcza i wychwytuje jony metali (po proteolizie) pozwalając rozpuścić się kwasom nukleinowym w wodnej fazie w probówce Zalety: metoda tania; szybka; wydajna Wady: Chelex należy inaktywować! przy dłuższym przechowywaniu należy wytrącić DNA etanolem Metoda solna (nieorganiczna) Sól (NaCl) w wysokim stężeniu (6M) dodana po proteolizie denaturuje resztki białka. DNA wytrącany jest etanolem (denaturacja). Zalety: metoda tania; szybka; wydajna Wady: metoda agresywna dla DNA (denaturacja)- procedury denaturacji nie należy powtarzać 5
Metoda wykorzystująca złoża selektywnie przepuszczalne lub kulki magnetyczne* Zdenaturowany DNA (po proteolizie) zatrzymywany jest w złożu, na którym czyszczony jest z niestrawionych białek, w końcowym etapie wypłukiwany jest ze złoża wodą lub buforem *W przypadku użycia kulek magnetycznych cząsteczki DNA przenoszone są na magnesowych palcach do kolejnych roztworów czyszczących Zalety: metoda tania; szybka; wydajna, pozwalająca na zoptymalizowanie procesu izolacji Wady: należy dobrać odpowiedni zestaw do materiału biologicznego EKSTRAHOWANIE RNA Metoda Chomczyńskiego i Sacchi (organiczna) AGPC - Acid Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction Użycie soli chaotropowych, np. izotiocyjanianu guanidyny (TRIzol/ fenozol): - wspomaga rozpad błony komórkowej - ma silne własności denaturujące białka - jest silnym inhibitorem rybonukleaz Zalety: metoda tania; wydajna Wady: silnie toksyczna! EKSTRAHOWANIE RNA Metoda wykorzystująca złoża selektywnie przepuszczalne lub kulki magnetyczne* Zdenaturowany RNA zatrzymywany jest w złożu w obecności fenozolu, na którym czyszczony jest ze zdenaturowanych białek, w końcowym etapie wypłukiwany jest ze złoża wodą lub buforem * jak w przypadku DNA Zalety: metoda tania; szybka; wydajna, pozwalająca na zoptymalizowanie procesu izolacji Wady: należy dobrać odpowiedni zestaw do materiału biologicznego 6
STABILIZACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH Wyizolowane kwasy nukleinowe należy przechowywać w stanie rozpuszczonym (woda lub bufor TE) Bufor TE to wodny roztwór TRIS - tris(hydroxymetyl)aminometan oraz EDTA- kwas etylonodiaminotetraoctowy; kwas edetenowy/wersenowy-chelat. Zadaniem buforu jest utrzymanie stałego ph (7,5) oraz utrzymanie stabilności cząsteczek DNA podczas zamrażania i odmrażania. STABILIZACJA KWASÓW NUKLEINOWYCH Ektoina jest aminokwasem, który pełni w organizmie funkcje ochronne m.in. stabilizatora enzymów, kwasów nukleinowych, kompleksów DNA-białko oraz całych komórek. SKUTECZNOŚĆ IZOLACJI Wydajność izolacji- ilość otrzymanego kwasu nukleinowego Efektywność izolacji- jakość otrzymanego kwasu nukleinowego w stosunku do ilości Powtarzalność izolacji- zoptymalizowanie procedury pozwalające na otrzymywanie zbliżonej wydajności i tej samej efektywności 7