Ligacja DNA - rekombinacja in vitro Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do komórek bakterii Sposoby wprowadzania DNA do innych (niż bakterie) typów komórek
Jak otrzymać zrekombinowane DNA-schemat klonowania molekularnego Schemat doświadczenia polegającego na rekombinacji fragmentu DNA w wektorze plazmidowym: 1. Przygotowanie fragmentu DNA 2. Przygotowanie wektora do rekombinacji (etapy 1 i 2 zwykle odbywają się równocześnie) 3. Ligacja wektora i wstawki 4. Wprowadzenie zrekombinowanego DNA do odpowiedniego gospodarza np. transformacja bakterii zrekombinowanym DNA 5. Selekcja i analiza transformantów (screening)
I. Przygotowanie fragmentu DNA do rekombinacji 1. Fragment DNA do klonowania najczęściej uzyskujemy przez trawienie większej cząsteczki odpowiednim enzymem restrykcyjnym (ale możemy także rekombinować w wektorach fragmenty DNA powielone w reakcji PCR) 2. Elektroforetyczna kontrola jakości, poprawności i wydajności trawienia (lub amplifikacji, jeśli fragment DNA powielamy w PCR), ewentualne oczyszczenie produktu trawienia przez izolację fragmentu DNA z żelu agarozowego OPCJONALNIE: a) Dodanie nowego miejsca restrykcyjnego po trawieniu enzymem generującym tępe końce - poprzez ligację linkerów DNA np. wyposażonych w miejsce restrykcyjne b) Zamiana lepkiego 5 końca na koniec tępy (np. egzonukleazą, polimerazą Klenowa) c) Zamiana lepkiego 3 końca na koniec tępy (np. polimerazą Klenowa)
II. Przygotowanie wektora plazmidowego do rekombinacji in vitro 1. Wektor do klonowania musi być zlinearyzowany odpowiednim enzymem (enzymami) restrykcyjnym (najczęściej takim samym jak fragment poddawany rekombinacji*). Trawienie odbywa się w obrębie MCS wektora * BamHI 5'-G^G A T C C-3 3'-C C T A G^G-5' BglII 5'-A^G A T C T-3 3'-T C T A G^A-5'
2. Elektroforetyczna kontrola jakości, poprawności i wydajności trawienia szczególnie istotna w przypadku wektora!!! a) Opcjonalnie defosforylacja 5 końców wektora, która zapobiega autoligacji DNA wektora!!! (tylko przy trawieniu pojedynczym enzymem)
III. Ligacja wektora i wstawki właściwa rekombinacja DNA in vitro W rekombinacji in vitro wykrzystuje się ligazę DNA uzyskiwaną z komórek E. coli zakażonych fagiem T4 (ligaza ta wymaga ATP i skleja poza lepkimi także tępe końce DNA) Optymalna temp. działania ligazy T4 od 4 (dla końców lepkich), 15-25 (dla końców tępych)
W mieszaninie ligacyjnej rekombinowany fragment DNA (wstawka insert,) powinien stanowić molowy nadmiar względem ilości cząsteczek wektora Przy małym stężeniu DNA wstawki najbardziej prawdopodobne jest połączenie końców tej samej cząsteczki DNA (recyrkularyzacja). Wzrost stężenia DNA w reakcji ligacji zwiększa prawdopodobieństwo połączenia dwóch różnych cząsteczek DNA Dla większości aplikacji można przyjąć stosunek molarny wstawka : wektor - 3:1 W reakcji ligacji prawie nigdy nie powstaje 100% zrekombinowanego DNA, dlatego wektory wyposaża się w systemy wizualnej selekcji zrekombinowanych klonów, poddaj się je defosforylacji itp.
IV. Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do bakterii 1. Transformacja Zjawisko transformacji czyli pobierania nagiego DNA z podłoża do komórek wykazano po raz pierwszy w bakteriach G+ Streptococcus pneumoniae (a potem także w Pneumonococcus czy Diplococcus) - Fred Griffiths 1928.
Zdolność transformacji bakterii zależy od tzw. stanu kompetencji Stan naturalnej kompetencji uwarunkowany jest genetycznie. W takiej transformacji najlepiej pobierany jest liniowy dsdna. Jedna nić ulega degradacji, druga rekombinacji do genomu gospodarza. Naturalną zdolność wchodzenia w stan kompetencji wykazują głównie bakterie Gramdodatnie (Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus). Bakterie Gram-ujemne zwłaszcza te z rodziny Enterobacteriaceae (m.in. E. coli) podlegają tego typu transformacji ze znacznie mniejsza wydajnością.
Sztuczna kompetencja transformacja E. coli plazmidowym DNA z użyciem metody chemicznej podstawowy sposób wprowadzania zrekombinowanego DNA do bakterii
Procedura transformacji E. coli plazmidowym DNA metodą chemiczną: 1. Przygotowanie hodowli biorcy we wczesnej fazie logarytmicznej (OD 600 0.3-0.4) 2. Otrzymanie komórek kompetentnych przez traktowanie bakterii zimnym (0 st. C) roztworem 50 lub 100mM chlorku wapnia (w niektórych modyfikacjach stosuje się dodatek innych jonów np. Mg lub Rb). Roztwory chlorków sprawiają ze osłona komórkowa staje się przepuszczalna np. dla plazmidu 3. Zmieszanie komórek kompetentnych z preparatem DNA (plazmid adsorbuje się na powierzchni komórki) i poddanie krótkotrwałemu działaniu szoku cieplnego. Szybkie podwyższanie temperatury (do 42 st. C na ok. 3 min.) powoduje zmiany w powłokach komórkowych bakterii (podwyższona temperatura wpływa na stan fizyczny lipidów w błonie powodując powiększenie porów) pozwalające na wniknięcie cząsteczek DNA do wnętrza komórek 4. Pozostawienie komórek w podłożu nieselekcyjnym na okres umożliwiający powrót komórek do normalnego stanu fizjologicznego i wyrażenie się genów zawartych na wprowadzanym plazmidzie lub wektorze fagowym (co najmniej 1 godz. W pożywce bez antybiotyku z napowietrzaniem)- bardzo ważne!!! 5. Wysiew komórek na podłoża selekcyjne lub w przypadku transformacji z wykorzystaniem wektora fagowego (np. M13) na płytki bez selekcji z agarem miękkim top agarem
Od czego zależy wydajność transformacji bakterii metodą chemiczną? 1. Szczep biorcy powinien być bezplazmidowy (wrażliwy na antybiotyki), mieć nieaktywny system restrykcyjny (Res-) zapobiega degradacji obcego DNA oraz system rekombinacji (RecA-) co zapewnia stabilność wprowadzanych plazmidów w komórce Takie cechy mają np. szczepy E. coli DH5 i XL1-Blue rekomendowane jako biorcy w transformacji 2. DNA plazmidowy powinien być oczyszczony nadmiar soli, enzymów restrykcyjnych, resztek fenolu, obniża lub hamuje wydajność transformacji 3. Najbardziej efektywną formą transformacji jest forma ccc DNA plazmidu, transformacja formą liniową jest mało wydajna i stosowana tylko w szczególnych wypadkach 4. Wydajność transformacji zależy od wielkości cząsteczki plazmidu, duże cząsteczki transformują się trudniej 5. Nadmiar DNA nie wpływa na wzrost wydajności, optymalna ilość dla E. coli powinna wynosić od 20-200 ng na reakcję 6. Komórki kompetentne są bardzo wrażliwe i należy się z nimi obchodzić bardzo delikatnie, zwłaszcza podczas wirowania, mieszania z DNA. Wszystkie etapy preparatyki należy przeprowadzać w lodzie. Wydajność podaje się jako liczbę transformantów w przeliczeniu na 1 mikrogram DNA. Dla E. coli wydajność ta w metodzie wapniowej (z chlorkiem wapnia) waha się od 10 4 do 10 6 (max. 10 7 na 1 g plazmidowego DNA).
Po raz pierwszy zastosowana przez Dovera i wsp. 1988 roku dla bakterii, zyskała wielką popularność, ponieważ pozwala transformować gatunki, które trudno uzyskują kompetencję metodami chemicznymi. 2. Elektrotransformacja (elektroporacja ) Istotą metody jest przepuszczenie przez zawiesinę komórek krótkiego (5-10 msek) impulsu prądu o bardzo wysokim napięciu (1250-2500 V). Prowadzi do powstawania porów (wielkości do 2 nm) w błonie (impuls elektryczny przejściowo i odwracalnie przerywa ciągłość błony), przez które do komórek może wnikać DNA.
Zalety elektroporacji w porównaniu z metodą chemiczną : można uzyskać bardzo wysoką wydajność transformacji (10 9-10 10 transformantów na g DNA, to co najmniej dwa rzędy wielkości więcej niż w metodzie chemicznej), można wprowadzać bardzo duże cząsteczki DNA (np. plazmidy z insertami wielkości setek kpz) np. zrekombinowane wektory do konstrukcji bibliotek genowych z dużymi wstawkami. Pewną wadą jest to że łatwo można zniszczyć (zabić) komórki bakteryjne w zawiesinie
V. Selekcja transformantów (bakterii niosących zrekombinowane wektory plazmidowe) na odpowiednich podłożach selekcyjnych Analiza transformantów: Namnożenie bakterii niosących zrekombinowane DNA w płynnym podłożu selekcyjnym Izolacja plazmidowego DNA Kontrolne trawienie plazmidowego DNA analiza obecności wstawki w wektorze
Metody wprowadzania DNA (np. zrekombinowanego) do innych (niż bakterie) typów komórek Zwykle nie służy to klonowaniu molekularnemu!!! Problem z nomenklaturą!!! Jeżeli wprowadzamy zrekombinowane DNA do: 1. Bakterii i drożdży to mówimy o transformacji 2. Komórek roślin także mówimy o transformacji genetycznej roślin choć to zupełnie inny proces niż w przypadku bakterii 3. Komórek zwierzęcych lub ludzkich mówimy o transfekcji (ponieważ używamy wtedy głownie wektorów pochodzenia wirusowego). W tym wypadku pojęcie transformacji dotyczy transformacji nowotworowej tych komórek
Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do drożdży: Transformacja metodami chemicznymi komórek drożdży odbywa się na zasadach podobnych jak w przypadku transformacji komórek bakteryjnych zrekombinowane DNA możemy też wprowadzać do drożdży przez elektrotransformację z wykorzystywaniem odpowiednich wektorów np. typu YAC
Wprowadzanie zrekombinowanego DNA do roślin Wykorzystuje się bakterie z rodzaju Rhizobium: Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes, które posiadają naturalną zdolność do wprowadzania swojego DNA do roślin. Posiadają w swojej komórce plazmid, kodujący geny niezbędne do infekcji rośliny. Jeden z fragmentów tego plazmidu, nazwany odcinkiem T (T-DNA), integruje się z materiałem genetycznym komórki gospodarza. Dzięki usunięciu części sekwencji wewnątrz plazmidu T, w to miejsce można stawić dowolny fragment obcego DNA Metoda ta ma poważne ograniczenie - można ja stosować wyłącznie do roślin dwuliściennych, ponieważ tylko one ulegają infekcji przez Agrobacterium
Transformacja genetyczna roślin dwuliściennych 1) Wybór odcinka DNA mającego stanowić transgen w roślinie i wstawienie go w odpowiednie miejsce wektora będącego pochodną plazmidu T - rekombinacja w E. coli (transformacja I) 2) Wprowadzeniu zrekombinowanego wektora do Agrobacterium (transformacja II), 3) Inkubacja bakterii niosących wektor z fragmentem tkanki roślinnej (kokultywacja) umieszczenie eksplantatów w roztworze bakterii 4) Przeniesienie fragmentów tkanki na pożywkę selekcyjnoregeneracyjną z odpowiednim antybiotykiem (czynnik eliminujący Agrobacterium i czynnik selekcyjny transformantów) 5) Indukcja podziałów komórkowych i powstanie bezkształtnej masy dzielących się komórek zwanej kalusem, 6) Regeneracja roślin z komórek kalusa za pomocą pożywek zawierających hormony roślinne, 7) Ukorzenianie rośliny w odpowiedniej pożywce, 8) Przeniesienie roślin do ziemi, hartowanie; analizy molekularne, fizjologiczno-biochemiczne
Sposoby transformacji genetycznej czyli wprowadzania np. zrekombinowanego DNA do roślin jednoliściennych (zboża, trawy i cebulowate) -Mikrowstrzeliwanie biobalistyka (nie wymaga tworzenia protoplastów z komórek roślinnych) Inne metody są stosowane raczej rzadko w większości wymagają uzyskania protoplastów
Metody wprowadzania zrekombinowanego DNA do komórek zwierzęcych i ludzkich: Dominują metody biologiczne, które są najbardziej skuteczne - transfekcja z użyciem zrekombinowanych wektorów wirusowych tj. inkubacja linii odpowiednich komórek z zawiesiną zrekombinowanego wirusa w odpowiednich warunkach (pożywka, temp. itd.) Inne metody (rzadziej stosowane) Lipofekcja (najczęściej wprowadzane jest DNA bezwektorowe Mikroiniekcja dojądrowa - DNA bezwektorowe
Wykorzystanie liposomów i lipopleksów lipofekcja najczęściej ze względu na ograniczoną pojemność liposomów wprowadza się DNA bezwektorowo Liposomy to drobne syntetyczne pęcherzyki lipidowe. Powstają one spontanicznie, jeżeli pewne typy lipidów zawiesi się w roztworze wodnym. Ich błonę stanowi podwójna warstwa lipidowa, tak więc budową przypominają np. błonę komórki. Liposomy wiążą i kondensują DNA spontanicznie, tworząc komleksy o wysokim powinowactwie do błon komórkowych. Liposomy powinny być także wyposażone w peptydy, zdolne niszczyć błony endosomalne i zapobiegać lizosomalnej degradacji DNA, a także w rekombinazy, wspomagające rekombinację między wprowadzonym DNA a DNA komórki, oraz białka i RNA, które mogą służyć ekspresji wprowadzonego DNA.
Mikroiniekcja dojądrowa (głównie komórki zwierzęce np. w transgenezie zwierząt) Metoda powstała w latach 70 XX wieku. Polega na wstrzykiwaniu DNA bezpośrednio do jąder komórek za pomocą szklanych mikroigieł, kontrolowanych przez sterowane hydraulicznie mikromanipulatory, przy równoczesnej obserwacji pod mikroskopem o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest bardzo wydajna ale praco- i czasochłonna
Obszary współczesnej biotechnologii, na które inżynieria genetyczna ma największy wpływ: zielona biotechnologia obejmująca rolnictwo i szeroko pojęty przemysł rolno-przetwórczy czerwona biotechnologia związana z różnymi aspektami ochrona zdrowia ludzi i zwierząt (włącznie z diagnostyką, farmacją, jak również weterynarią)
Podstawą współczesnej zielonej biotechnologii jest transgeneza przeniesienie na stałe do jakiegoś organizmu jednego lub więcej genów pochodzących z innej komórki lub innego organizmu GMO Podstawą transgenezy jest rekombinacja in vitro - łączenie dowolnych cząsteczek DNA
Transgeniczne rośliny bardziej odporne na choroby i czynniki środowiska
Transgeniczne rośliny - poprawione cechy jakościowe: pszenica więcej glutenin = lepsza wartość wypiekowa mąki ananas białko utrudniające zamarzanie = mniejsze straty przy przechowywaniu w chłodniach pomidor więcej karotenu = lepsze wybarwianie owoców ryż zwiększenie zawartości prowitaminy A kawa usunięcie enzymów zaangażowanych w syntezę kofeiny
Rośliny GM jako bioreaktory - agrofarmaceutyka wykorzystanie roślin transgenicznych jako bioreaktorów do produkcji białek, które mogą być wykorzystane w terapii lub diagnostyce medycznej somatotropina kolagen podj. hemoglobiny interleukina-2 interferon alfa ziemniak bulwa tytoń liście tytoń nasiona ziemniak bulwy ziemniak
Transgeniczne zwierzęta - poprawione cechy użytkowe Szybszy wzrost zwierząt hodowlanych Większa wydajność produkcji np. mleka albo mięsa - (mleko specjalnie przystosowane do produkcji serów) Transgeniczne zwierzęta w medycynie i badaniach biomedycznych badania podstawowe - transgeniczne myszy są niezastąpionym modelem w badaniu chorób człowieka, np. nowotworów, otyłości, starzenia, chorób układu krążenia, cukrzycy itp. Genetycznie modyfikowane zwierzęta np. świnie jako dawcy narządów albo ksenogenicznych komórek i tkanek do przeszczepów
Czerwona biotechnologia - ochrona zdrowia ludzi i zwierząt Produkcja rekombinowanych białek (leków, hormonów, białek wykorzystywanych w biologii molekularnej) w mikroorganizmach i komórkach eukariotycznych
Rekombinowane biofarmaceutyki: Do chwili obecnej na świecie do użytku dopuszczonych jest ok 650 leków białkowych, z czego 400 to leki oparte na białkach rekombinowanych Kolejne 1300 rekombinowanych biofarmaceutyków jest w fazach testów, z wyraźną tendencją wzrostu udziału w ich produkcji komórek eukariotycznych
Jakiego typu schorzenia próbujemy leczyć za pomocą rekombinowanych biofarmaceutyków
Zysk ze sprzedaży rekombinowanych biofarmaceutyków przeciwnowotworowych przewyższa zyski ze sprzedaży leków chemicznych
Terapia genowa - leczenie chorób genetycznych np. przez wprowadzenie terapetucznego DNA albo wprowadzenie tzw. genu samobójczego zniszczenie chorych komórek np. nowotworowych wektor AAV wektor retrowirusowy
Unia Europejska dopuściła na swój rynek pierwszą terapię genową Glybera jest przeznaczona dla osób cierpiących na rzadką (jedna-dwie osoby na milion) chorobę związaną z niemożnością właściwego metabolizowania tłuszczów (wrodzony niedobór lipazy lipoproteinowej (LPLD lipoprotein lipase deficiency) Stężenie tłuszczów we krwi chorych poddawanych terapii ulega wyraźnemu zmniejszeniu, znacząco zmniejsza się ryzyko wystąpienia zapalenia trzuski, które stanowi główne powikłanie w tej chorobie Glybera jest obecnie jednym z najdroższych leków świata. Koszt terapii jednego pacjenta wynosi ponad 1,2 mln euro
Technologia oparta na wiedzy o DNA umożliwia ponadto rozwój precyzyjnej, szybkiej i taniej diagnostyki projektowanie osobistych leków custom drugs (spersonalizowana medycyna)