INŻYNIERIA GENETYCZNA

Transkrypt

1 INŻYNIERIA GENETYCZNA narzędzia i techniki: enzymy restrykcyjne, wektory, transformacja, PCR, klonowanie transgeniczne rośliny i zwierzęta znakowanie GMO Prowadzący wykład: dr Artur Dzialuk

2 INŻYNIERIA GENETYCZNA Zespół technik umożliwiających: izolowanie, identyfikację, charakterystykę i przenoszenie genów między genomami oraz wprowadzanie do nich zmian.

3 INŻYNIERIA GENETYCZNA silnie związana z genetyką molekularną, która koncentruje się na celach poznawczych stosuje ten sam warsztat i metody silny związek z praktyką przemysłem, medycyną, farmacją jej praktyczne wykorzystanie doprowadziło do rozwoju przemysłu biotechnologicznego

4 PODSTAWOWE TECHNIKI

5 Klonowanie DNA PCR

6 KLONOWANIE DNA zrekombinowany wektor wektor fragment DNA bakteria transport do komórek gospodarza bakteria niosąca zrekombinowany wektor powielanie zrekombinowanego wektora podział komórek gospoda -rza liczne podziały komórkowe kolonie bakteryjne

7 System / układ restrykcji i modyfikacji mechanizm obronny w komórce bakteryjnej zakażonej bakteriofagami (wirusami bakteryjnymi)

8 System restrykcji i modyfikacji EcoRI

9

10 endonukleazy restrykcyjne = enzymy restrykcyjne = restryktazy wysoka specyficzność substratowa hydrolizują wiązania fosfodiestrowe w DNA EcoRI EcoRI

11 Tępe i lepkie końce TĘPE KOŃCE LEPKIE KOŃCE

12

13 LIGACJA DNA nietrwałe parowanie zasad między lepkimi końcami LIGAZA DNA dwa wiązania syntetyzowane przez ligazę DNA

14 Trawienie enzymem EcoRI źródło: DNA Learning Center,

15 Nazewnictwo Trójliterowe skróty: 1. Od rodzaju bakterii lub sinic 2 i 3. od gatunku Następna wielka litera oznacza szczep lub typ Liczby rzymskie to numer enzymy z danego szczepu lub typu

16 ENZYMY RESTRYKCYJNE znanych ponad tysiąc enzymów restrykcyjnych firmy biotechnologiczne oferują w sprzedaży ponad sto

17 Wykorzystanie enzymów restrykcyjnych 1. Technika rekombinowania i klonowania DNA 2. sporządzania fizycznych map genomów, 3. izolacji i identyfikacji genów, 4. sekwencjonowania DNA, 5. porównywania DNA z różnych r organizmów, 6. diagnostyki chorób b genetycznych, 7. diagnostyki niektórych typów w chorób nowotworowych, 8. diagnostyki chorób b infekcyjnych, 9. w transplantologii do ustalania zgodności tkankowej, 10.w w medycynie sądowej s do ustalania pokrewieństwa.

18 WEKTORY GEN LIGAZA DNA GEN WEKTOR plazmidy bakteriofagi kosmidy DNA DO SKLONOWANIA sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC) ZREKOMBINOWANA CZĄSTECZKA DNA

19 Matura 2010 PR m.in. F P P? F

20 PRAWDA: większość genów oporności na antybiotyki kodowanych jest na plazmidach???: Lekooporność nie jest jedynym przykładem fenotypów zależnych od obecności plazmidów

21

22

23

24 BUDOWA PLAZMIDU ori miejsce startu replikacji promotor miejsce inicjacji transkrypcji MCS (multiple cloning site) = miejsce wielokrotnego klonowania, polilinker gen markerowy np. oporności na antybiotyk lub białka fluorescencyjnego GFP

25 Gen kodujący GFP (Green Fluorescent Protein) Białko fluoryzujące w zakresie barwy zielonej. Białko to jest izolowane z meduz morskich. Najwyższe wzbudzenie luminescencji GFP występuje przy λ=395 nm (bliski ultrafiolet) lub λ=475 nm (światło widzialne), emisja światła następuje przy λ=508 nm (barwa zielona). źródło: DNA Learning Center,

26 Matura 2010 PR białka ka pośredni rednią obserwację czasu i miejsca powstawania pewnego pojawia się nowotwór r? kiedy (czas) i gdzie (miejsce)

27 powyżej sekwencja kodująca poniżej promotor GFP jednostka transkrypcyjna

28 TRANSFORMACJA źródło: DNA Learning Center,

29 EKSPRESJA TRANSGENU chromosom gospodarza wektor białko plazmid natychmiast po transformacji po inkubacji 1h w 37ºC

30 PCR Cykl: 1. denaturacja 2. przyłą łączanie starterów 3. wydłużanie

31 Matura 2011 PR kryminalistyka identyfikacja sprawców przestępstw na podstawie analizy DNA ze śladów biologicznych identyfikacja ofiar katastrof i zbrodni wojennych

32 Osiągnięcia w zakresie transgenizacji

33 Matura 2007 PR

34 Transgeniczne rośliny

35 Totipotencja Komórki roślinne są totipotentne, czyli mają nieograniczoną zdolność do dzielenia się oraz odtwarzania poszczególnych organów i całego organizmu.

36 Metody wprowadzania obcego DNA do genomu roślin 1. Metody z wykorzystaniem wektora: bakterie z rodzaju Rhizobium wirusy roślinne np. wirus mozaiki kalafiora (CaMV) 2. Metody bez wykorzystania wektora.

37 Agroinfekcja = agrotransformacja Wykorzystuje się bakterie z rodzaju Rhizobium: Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes, które posiadają naturalną zdolność do wprowadzania swojego DNA do roślin.

38 Agroinfekcja

39 Agroinfekcja poważne ograniczenie - można ją stosować wyłącznie do roślin dwuliściennych, ponieważ tylko one ulegają zarażeniu przez Agrobacterium. Rośliny jednoliścienne, do których należą zboża, nie mogą być transformowane tym sposobem.

40 Metody bezwektorowe Fizyczne Elektroporacja Mikrowstrzeliwanie Mikroiniekcja Chemiczne PEG Fuzja liposomów

41 Elektroporacja seria impulsów elektrycznych, które naruszają strukturę błony, powodując powstanie w niej porów, przez które DNA może przeniknąć do wnętrza komórki

42 Mikrowstrzeliwanie (metoda biolistyczna) Mikroskopijne kulki złota lub wolframu zostają opłaszczone DNA a następnie wstrzeliwane do komórek roślinnych za pomocą armatki genowej

43 Matura 2010 PR

44 Po co tworzy się rośliny transgeniczne? 1. nauka 2. praktyka Ekspresja białka GFP w komórkach korzenia transgenicznego rzodkiewnika

45 Rośliny GM w nauce modele w poznawaniu funkcji genów głównie rośliny modelowe np. rzodkiewnik (Arabidopsis thaliana), tytoń (Nicotiana tabacum) ich genom dobrze poznany i łatwo je transformować Uzyskujemy informacje uniwersalne umożliwiają poznanie i zrozumienie świata żywego Transgeniczny tytoń zawierający gen lucyferazy pochodzący ze świetlika.

46 Pomidor Flavr Savr

47 Pomidor Flavr Savr pierwsza komercyjnie zmodyfikowana genetycznie roślina uprawna i jadalna, dopuszczona do spożycia przez ludzi wprowadzona do sprzedaży w USA w 1994, pozostał na rynku zaledwie przez kilka lat, zanim wstrzymano jego produkcję.

48 Strategia antysensowna wprowadzono antysensowny gen, którego produkt interferował i powstrzymywał produkcję enzymu poligalakturonazy. poligalakturonaza jest enzymem odpowiedzialnnym za rozkład ściany komórkowej (a zatem mięknięcie tkanki), podczas dojrzewania, starzenia i w końcu psucia się owocu.

49 Przyczyny niepowodzeń wysokie koszty produkcji i spedycji zmodyfikowano genetycznie nie najlepszą odmianę niskie plony % w porównaniu do upraw tradycyjnych jedynie połowa owoców była wystarczająco duża i dojrzała, by być sprzedawana jako "McGregors" docelowy produkt o wyższej cenie. wiele uszkodzeń mechanicznych konkurencja z właśnie wprowadzoną tradycyjną odmianą pomidorów - LSL (ang. long shelf life) ANI ZAPACH ANI TRWAŁOŚĆ DZIKIE FLAVR SAVR

50 Złoty ryż (Golden rice)

51 Skala niedoboru witaminy A Problem dotyczy 250 mln ludzi, w tym mln dzieci Rocznie ślepnie tys., w ciągu roku umiera połowa z nich

52 Złoty ryż µg karotenoidów na gram suchej wagi Złoty ryż 2 37 µg karotenoidów na gram suchej wagi. (23 x więcej niż ZR1)

53 Odporność na herbicydy Zmodyfikowane rośliny posiadają geny, odpowiedzialne za produkcję enzymów, które rozkładają herbicydy, dzięki czemu stają się na nie odporne. Wprowadzenie do rośliny cechy odporności na działanie herbicydu o działaniu totalnym pozwala na łatwą kontrolę chwastów na polu uprawnym. nie GMO GMO

54 Modyfikacja typu Roundup Ready glifosat aktywny składnik herbicydu Roundup hamuje działanie syntazy EPSPS - enzymu, który bierze udział w syntezie aminokwasów aromatycznych Do roślin GMO wprowadza się gen kodujący enzym syntazę EPSPS niewrażliwą na działanie glifosatu lub gen odpowiedzialny za powstanie enzymu (oksydoreduktazy glifosatu) rozkładającego glifosat koncerny biotechnologiczne oferują jednocześnie herbicyd i nasiona genetycznie zmodyfikowane, z cechą odporności.

55 Odporność na szkodniki Nazewnictwo geny cry (od crystal protein) Białka Cry to toksyny Bt Rośliny Bt, np. kukurydza Bt (Bt-maize)

56 Powoduje straty na ponad 40% ogólnej powierzchni zasiewów kukurydzy w Polsce. Kolejny szkodnik to zachodnia stonka kukurydziana Omacnica prosowianka (Ostrinia nubialis)

57

58 Matura 2005 PP Modyfikacja polega na wprowadzeniu do rośliny genu kodującego białko Cry z bakterii glebowej Bacillus thuringiensis, co powoduje, że roślina GM staje się toksyczna dla wybranych szkodników owadzich, ale nie dla ludzi i zwierząt. Szkodliwe jest jedynie spożycie przez owada części rośliny GM. Preparaty oparte na bakterii glebowej Bacillus thuringiensis w formie zarodników stosuje się w uprawach polowych, lasach i miejscach wylęgania się komarów. Pokrywają one cały teren, gdzie zostały zastosowane. Nawet przebywanie owadów w środowisku tak skażonym stanowi dla nich zagrożenie.

59 Odporność na choroby powodowane przez grzyby, wirusy i bakterie

60 Papaja odporna na wirusa pierścieniowej plamistości papai (PRSV) PRSV łatwo przenoszony przez mszyce. Na Hawajach, gdzie papaja jest podstawową rośliną uprawną, 80% plantacji to odmiany transgeniczne UH Rainbow z tą odpornością. dzika transgeniczna

61 Ulepszanie cech jakościowych

62 Matura 2010 PR sukces wprowadzenia genu LEAFY do komórek drzew (przykład osiki) wskazuje na możliwości uzyskania genetycznie zmodyfikowanych odmian drzew owocowych (np. jabłoń, grusza, śliwa), które będą kwitły znacznie wcześniej a zbiór ich owoców będzie ułatwiony z uwagi na niski wzrost drzew

63 Przydatność wysoka bo: Krzewiące się drzewa to niższe koszty zbiorów owoców Łatwiejszy dostęp do koron drzew owocowych w celach pielęgnacji Więcej odgałęzień to wyższy plon, zbiór Łatwiejsza uprawa

64 FITOREMEDIACJA

65 Tolerancja stresów środowiskowych wysoka temperatura, zasolenie, zalewanie, susza, stresy oksydacyjne i substancje chemiczne

66 TRANSGENICZNE ROŚLINY W MEDYCYNIE Dieta prozdrowotna złoty ryż zmiany struktury kwasów tłuszczowych w roślinach oleistych (zdrowsze oleje spożywcze) odmiany ryżu i orzeszków ziemnych wolnych od alergenów Szczepionki rośliny GM jako biofabryki wytwarzające szczepionki wolne od ryzyka przenoszenia ludzkich lub zwierzęcych chorób.

67 SZCZEPIONKI

68 87-krotny wzrost od 1996 r. do 2010 r., rok do roku wzrost o ok.9 mln ha, czyli ok.7%

69

70 UPOWSZECHNIENIE UPRAW GMO

71 Transgeniczne zwierzęta

72 METODY TRANSGENIZACJI ZWIERZĄT

73 Po co tworzy się zwierzęta transgeniczne? 1. nauka 2. praktyka

74 Zwierzęta GM w nauce modele do badań nad rozwojem, zachowaniem, pamięcią w medycynie, transgeniczne myszy służą jako modele chorób człowieka, takich jak np. otyłość, karłowatość, przyspieszone starzenie, choroby układu krążenia, cukrzyca, i in. oraz jako obiekty do testowania nowych, obiecujących metod leczenia badania funkcji genów 2 1 mrna kodujące białko sygnałowe determinujące rozwój osi ciała wstrzykiwano w brzuszną część blastomeru żaby szponiastej, co spowodowało rozwój drugiej osi ciała

75 Wykorzystanie techniki transgenezy zwierząt gospodarskich Uzyskanie zwierząt o przyspieszonym tempie wzrostu (wzrost produkcji mięsa) przez wprowadzenie do ich genomu genów kodujących np. gen hormonu wzrostu Zwiększenie masy mięśni u zwierząt rzeźnych Ryby zawierające ssaczy gen hormonu wzrostu

76 Wykorzystanie techniki transgenezy zwierząt gospodarskich Uzyskanie zwierząt o przyspieszonym tempie wzrostu (wzrost produkcji mięsa) przez wprowadzenie do ich genomu genów kodujących np. gen hormonu wzrostu Zwiększenie masy mięśni u zwierząt rzeźnych Podwójnie umięśniona krowa

77 Wykorzystanie techniki transgenezy zwierząt gospodarskich Poprawa jakości produktu: np. poprzez obniżenie zawartości cholesterolu w mięsie, mleku i jajach, obniżenie zawartości laktozy w mleku, zmniejszenie zawartości tłuszczu w mięsie i modyfikacje jego składu Modyfikacje cech biochemicznych np. poprawy jakości i tempa wzrostu wełny poprzez wprowadzenie do genomu owiec genów białek keratynowych zwiększenie produktywności: np. zwiększenie mleczności krów, nieśności kur niosek Uzyskanie zwierząt wykazujących tolerancję lub odporność na patogenne wirusy i bakterie

78 ZWIERZĘTA JAKO BIOREAKTORY

79 Wytwarzanie biofarmaceutyków

80 Roczne światowe zapotrzebowanie na czynnik VIII (leczenie hemofilii A) 354 transgenicznych szczurów 217 transgenicznych królików 2 transgeniczne świnie po jednej transgenicznej kozie, owcy lub krowie

81 Humanizacja ekspresji genów człowieka w organizmie zwierzęcym modyfikacja zmian potranslacyjnych tak, aby uzyskać białko identyczne jak w organizmie człowieka ksenotransplantacje genetycznie zmodyfikowane organy zwierzęce nadające się na przeszczepy u ludzi, zniesienie immunologicznej bariery międzygatunkowej i zapewnienie organów do transplantologii.

82 Matura 2009 PR Produkcja leków i szczepionek wolnych od ryzyka przenoszenia chorób ludzkich lub zwierzęcych Złoty ryż może zlikwidować problem niedoboru witaminy A mniejsze zużycie herbicydów fitoremediacja

83 Matura 2006 PP DNA jest trawiony w przewodzie pokarmowym człowieka. Czy ktoś obawia się schabowego z kapustą?

84 Obowiązek znakowania GMO w UE W przypadku gdy cały produkt jest genetycznie zmodyfikowany oznakowanie powinno być uzupełnione informacją: produkt genetycznie zmodyfikowany. Jeśli tylko niektóre składniki są genetycznie zmodyfikowane, obok nazwy składnika należy umieścić napis: genetycznie zmodyfikowany. Napis i informacja powinny być czytelne i zapisane czcionką tej samej wielkości co nazwa składnika lub produktu.

85 JAK ROZUMIEĆ ETYKIETĘ? NIE MODYFIKOWANY GENETYCZNIE MODYFIKOWANY GENETYCZNIE <0.9% <0.9% 1.2 % GM źródło: European Commission, Joint Research Centre =1.2% 1.2% > 0.9%

86 Matura 2007 PP

87 Dziękuję za uwagę