STRESZCZENIE I ZASADA DZIAŁANIA

Transkrypt

1 Leuko64 Test przeznaczony do wykrywania ostrych ogólnoustrojowych reakcji zapalnych i Informacje o produkcie h LK (75 testów); V Do diagnostyki in vitro LK (250 testów) STRESZCZENIE I ZASADA DZIAŁANIA Ekspresja receptorów CD64 na neutrofilach wzrasta gwałtownie w ciągu kilku godzin zarówno in vitro, jak i in vivo za pośrednictwem mediatorów stanu zapalnego, np. interferonu gamma i G-CSF (1-3). Taką samą zmianę obserwuje się w odpowiedzi na potwierdzoną infekcję lub uraz tkanki, co oznacza, że pomiar ekspresji receptorów CD64 na neutrofilach jest skorelowany z obecnością takich stanów u ludzi (4-14). Test Leuko64 TM wykorzystuje mieszaninę trzech przeciwciał monoklonalnych swoistych względem CD64 (klony 22 i 32.2) oraz CD163 (klon Mac2-158). Zastosowanie dwóch przeciwciał skierowanych przeciwko różnym epitopom CD64 zwiększa stosunek sygnału do szumu dla testu i dostarcza mechanizmu minimalizującego zmienność sygnału fluorescencyjnego odczynnika pomiędzy partiami. Dodanie przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD163, antygenowi swoistemu wobec monocytów, zwiększa swoistość identyfikacji subpopulacji leukocytów, ułatwiając w ten sposób działanie algorytmu wykrywającego antygen CD w oprogramowaniu Leuko64 TM QuantiCALC, a także identyfikację wewnętrznych populacji kontroli dodatniej i ujemnej. Wykorzystanie automatycznego oprogramowania eliminuje zmienność właściwą dla standardowej subiektywnej analizy metodą cytometrii przepływowej w trybie listy. Wykorzystanie zawiesiny cząstek fluorescencyjnych do standaryzacji ilościowego oznaczenia komórek CD64 zapewnia identyfikowalność względem dokumentu NIST Standard Reference Material SRM 1932 (RM 8640), a także dostarcza mechanizmu minimalizującego zmienność pomiędzy partiami zestawów testu Leuko64 TM. Wyniki testu Leuko64 TM przedstawiane są w postaci wskaźnika granulocytów CD64 jako parametru diagnostycznego, a także wskaźników monocytów CD64 i CD163. LK64-V A4 PL Strona 1 z 9

2 ZASTOSOWANIE Wersje LK i LK zestawu testu Leuko64 TM są przeznaczone do stosowania z następującymi cytometrami przepływowymi: Beckman Coulter XL, Beckman Coulter FC-500, Beckman Coulter Navios, BD Biosciences FACScan, BD Biosciences FACSCalibur oraz BD Biosciences Cantos. PRZEZNACZENIE Zestaw testu Leuko64 TM firmy Trillium Diagnostics jest przeznaczony do stosowania w celu pomiaru ekspresji receptorów CD64 na neutrofilach. Jest on przeznaczony do wykorzystywania z wynikami innych badań laboratoryjnych i analiz klinicznych, aby wspomóc diagnostykę in vitro ostrej ogólnoustrojowej reakcji zapalnej na uraz tkanki, np. w przypadku uszkodzenia tkanki, zakażenia lub posocznicy. Trillium Leuko64 TM jest przeznaczony do diagnostyki in vitro wyłącznie przez przeszkolony i posiadający odpowiednie kwalifikacje personel. ELEMENTY ZESTAWU Mieszanina mysich przeciwciał monoklonalnych [zawiera Odczynnik A zbuforowaną sól fizjologiczną i 0,5% oczyszczonej albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 0,01% azydku sodu]. Stężony (10X) roztwór lizujący Trillium (zawiera chlorek Odczynnik B amonu) Zawiesina cząstek polistyrenowych o wielkości 5-6 µm wyznakowanych za pomocą StarFire Red TM oraz izocyjanianu Odczynnik C fluoresceiny (FITC) (zawiera <0,1% azydku sodu i 0,01% Tween 20). Stosowane do analizy plików metodą cytometrii przepływowej Leuko64 TM w trybie listy i obliczania wskaźników CD64 na leukocytach. Na załączonej płycie CD znajdują się także przewodniki Oprogramowanie zawierające szkolenia dla użytkownika i dotyczące optymalnego użytkowania zestawu testu Leuko64 TM. ODCZYNNIKI I MATERIAŁY WYMAGANE, ALE NIE DOŁĄCZONE Woda destylowana Jednorazowe probówki polistyrenowe 12x75 Cytometr przepływowy Mikropipeta(y) dozująca 5 µl, 50 µl i 1ml Wytrząsarka Komputer do analizy plików w trybie listy PRÓBKA Do testu Leuko64 TM potrzeba tylko 50 µl pełnej krwi pobranej na antykoagulant. Antykoagulantami kompatybilnymi z tym systemem testowym są EDTA, heparyna, cytrynian sodu lub ACD. Próbki krwi można wykorzystać do badania przez 8 godzin, jeśli przechowywane są w temperaturze pokojowej (18-22 C) lub 48 godzin, jeśli przechowywane są w lodówce (2-8 C). PRZYGOTOWANIE PRÓBKI 1. Rozcieńczyć 10X stężony roztwór lizujący Trillium (odczynnik B) w stosunku 1:10, mieszając 1 część stężonego odczynnika B z 9 częściami przefiltrowanej wody LK64-V A4 PL Strona 2 z 9

3 destylowanej. Ostateczne ph tego roztworu powinno wynosić 7,40 +0,05. Przygotować objętość wystarczającą dla przewidywanej liczby testów (dla każdej próbki potrzeba 1,0 ml). Rozcieńczony odczynnik B lub 1X stężony roztwór lizujący Trillium zachowuje stabilność przez 1 tydzień w temperaturze pokojowej (20-26 C) lub 30 dni przy przechowywaniu w lodówce (2-8 C). 2. W trakcie pracy rozcieńczony roztwór lizujący Trillium musi znajdować się w temperaturze od 20 C do 37 C. Zimny roztwór może doprowadzić do zbyt słabej lizy i uzyskania suboptymalnych warunków testu. 3. Dla każdej próbki do analizy należy przygotować i oznaczyć jedną próbówkę polistyrenową 12 x 75 mm. 4. Do każdej oznaczonej probówki odpipetować 50 µl odczynnika A Leuko64 TM. 5. Do probówki zawierającej odczynnik A odpipetować 50 µl dobrze wymieszanej próbki krwi pobranej na antykoagulant i zawierającej białe krwinki w ilości <25 x 10 9 komórek/l (w razie potrzeby rozcieńczyć); delikatnie wymieszać lub zworteksować; inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej (18-22 C). 6. Do każdej probówki dodać 1 ml 1X stężonego roztworu lizującego Trillium (rozcieńczony odczynnik B) i dokładnie zworteksować. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Przerywane wytrząsanie nasila lizę. 7. Do każdej probówki dodać 5 µl cząstek Leuko64 TM (odczynnik C), zworteksować i analizować za pomocą cytometru przepływowego, wykorzystując w tym celu niżej opisaną konfigurację urządzenia i protokół analizy. Przygotowane próbki, które nie są natychmiast analizowane, należy przechowywać w temperaturze 2-8 C i chronić przed światłem do momentu analizy. Analizę metodą cytometrii przepływowej należy przeprowadzić w ciągu 4 godzin od wykonania barwienia. KONFIGURACJA CYTOMETRU PRZEPŁYWOWEGO Przed przystąpieniem do analizy pierwszej próbki należy skonfigurować protokół akwizycji w cytometrze przepływowym. Cząstki Leuko64 TM (odczynnik C) służą jako kalibrator dla ustawień wzmocnienia i napięcia w urządzeniu. Aby zautomatyzowane oprogramowanie działało prawidłowo, konieczne jest dokładne wykonanie opisanych niżej czynności. Dodatkowe instrukcje można znaleźć w przewodnikach znajdujących się na płycie CD dołączonej do oprogramowania Leuko64 TM QuantiCALC. 1. Przygotować probówkę polistyrenową 12 x 75 mm zawierającą 5 µl cząstek Leuko64 TM (odczynnik C) w 0,5 ml 1X stężonego roztworu lizującego Trillium (odczynnik B rozcieńczony przefiltrowaną wodą destylowaną w stosunku 1:10, ph 7,40 +0,05). Zawiesina cząstek zostanie wykorzystana do ustalenia optymalnych ustawień PMT w cytometrze przepływowym dotyczących napięcia i rozproszenia światła. 2. W trybie akwizycji w cytometrze (informacje dla użytkowników urządzeń Beckman Coulter XL, FC500 lub Navios poniżej) należy ustawić 5 histogramów dwuparametrowych: FS (lin) vs. SS (log) CD64 FITC vs. SS (log) CD163 PE vs. SS (log) FL3 (cząstki) vs. SS (log) CD163 PE vs. CD64 FITC LK64-V A4 PL Strona 3 z 9

4 Oraz 3 histogramy jednoparametrowe: FL1 - CD64 FITC FL2 - CD163 PE FL3 (lub PMT z konfiguracją filtra umożliwiającą wykrywanie światła o długości fali 685 nm) UWAGA: W przypadku urządzeń Beckman Coulter XL, FC500 i Navios konieczny jest wybór parametrów akwizycji w następującej kolejności: P1 = FALS P4=log PE P2 = log side scatter P5=log PMT dla sygnału 685 nm (zwykle P3 = log FITC FL4) 3. WYŁĄCZYĆ wszystkie ustawienia kompensacjii wartości progowych. 4. Ustawienia napięcia dla wszystkich urządzeń, za wyjątkiem BDB FACSCanto II. (instrukcje dla użytkowników urządzenia FACSCanto II znajdują się poniżej) Uwaga: Przed akwizycją wszystkie parametry logarytmiczne w oprogramowaniu cytometru przepływowego należy ustawić na wyświetlanie czterech dekad. Wykonać analizę zawiesiny cząstek i wprowadzić następujące poprawki do histogramów jednoparametrowych (patrz schemat). Środek piku na osi FL1 (FITC) powinien być wyśrodkowany na kanale 100 (na początku trzeciej dekady natężenia fluorescencji). Środek piku na osi FL2 (PE) powinien być wyśrodkowany na kanale ~20 (pierwszy impuls w drugiej dekadzie natężenia fluorescencji). Środek piku na osi FL3 powinien być wyśrodkowany na kanale 100 lub na początku trzeciej dekady natężenia fluorescencji. Na histogramie FS vs. log SS populacja cząstek powinna znajdować się na końcu trzeciej dekady sygnału logarytmicznego rozproszenia bocznego i w pobliżu kanału 200 w przypadku sygnału rozproszenia w przód lub pod niewielkim kątem (na skali 256 należy użyć kanału 25-50). Informacje dla wszystkich użytkowników urządzeń firmy Beckman Coulter, FACSCalibur i FACScan : CD64-FITC CD163-PE Starfire Red SSC Log **Ustawienia napięcia wyłącznie dla użytkowników urządzeń BDB FACSCanto II : Cytometry przepływowe BD FACSCanto II wymagają innej konfiguracji, co wynika z różnic w wyświetlaniu logarytmicznej skali fluorescencji, która jest unikalna dla oprogramowania BD FACSDiva wykorzystywanego w urządzeniu Canto II. LK64-V A4 PL Strona 4 z 9

5 Uwaga: Przed akwizycją wszystkie parametry logarytmiczne w oprogramowaniu cytometru przepływowego należy ustawić na wyświetlanie czterech dekad. Wykonać analizę zawiesiny cząstek i wprowadzić następujące poprawki do histogramów jednoparametrowych (patrz schemat). Środek piku na osi FL1 (FITC) powinien być wyśrodkowany na kanale 3000 (drugi impuls na początku trzeciej dekady natężenia fluorescencji). Środek piku na osi FL2 (PE) powinien być wyśrodkowany w pobliżu końca drugiej dekady natężenia fluorescencji. Środek piku na osi FL3 powinien być wyśrodkowany na kanale 3000 (drugi impuls na początku trzeciej dekady natężenia fluorescencji). Na histogramie FS vs. log SS populacja cząstek powinna znajdować się na końcu trzeciej dekady sygnału logarytmicznego rozproszenia bocznego i w pobliżu kanału w przypadku sygnału rozproszenia w przód lub pod niewielkim kątem. Wyłącznie dla użytkowników urządzenia BD FACSCanto II: CD64-FITC CD163-PE Starfire Red SSC Log 5. Wartość progowa wykluczająca płytki i pozostałości erytrocytów zostanie ustawiona w log SS z wykorzystaniem limfocytów. Dyskryminator log SS należy ustawić nieco w lewo od populacji limfocytów. Nie należy używać dyskryminatora ustawionego na rozproszenie w przód, ponieważ spowoduje to wykluczenie cząstek z akwizycji. 6. Ustawienia akwizycji i przechowywania należy dostosować tak, aby możliwe było zebranie zdarzeń niebramkowanych. Zasadniczo zaleca się ustawienie rozdzielczości na 1024, natomiast jest to wymagane w przypadku cytometrów Beckman Coulter Cytomics FC500 lub BD Biosciences FACSCanto. 7. Należy zapisać ustawienia i szablon akwizycji. Etapy 4-7 należy powtarzać dla każdej nowej partii Leuko64 TM lub po wykonaniu czynności serwisowych dotyczących urządzenia. ANALIZA PLIKU W TRYBIE LISTY Dołączone oprogramowanie Leuko64 QuantiCALC należy zainstalować w komputerze MacIntosh lub PC, który będzie wykorzystywany do analizy danych. Postępować zgodnie z przyjaznymi dla użytkownika instrukcjami dotyczącymi analizy danych w trybie listy, które można znaleźć w pliku pomocy w oprogramowaniu. UWAGA: Oprogramowanie jest specyficzne względem partii, LK64-V A4 PL Strona 5 z 9

6 a protokoły pracy są specyficzne dla modelu urządzenia. Pojawi się monit o potwierdzenie prawidłowego wyboru. STRATEGIA KONTROLI JAKOŚCI DOTYCZĄCA TESTU LEUKO64 TM Test wykorzystuje autologiczne populacje komórek z próbki pobranej od pacjenta jako kontrole dodatnie i ujemne, co optymalizuje ocenę zmiennych przedanalitycznych. Populacja limfocytów, w której nie występuje ekspresja receptorów CD64 i CD163 służy jako ujemna populacja kontrolna i zapewnia dodanie odpowiednich odczynników oraz może wykryć obecność substancji fluorescencyjnych w próbce diagnostycznej. Populacja limfocytów, w której występuje ekspresja receptorów CD64 i CD163, służy jako kontrola dodatnia zapewniająca właściwe wybarwienie próbki za pomocą odczynnika A. Aby uzyskać dalsze informacje dotyczące kontroli ujemnych i dodatnich, należy postępować zgodnie z instrukcjami dotyczącymi analizy danych w trybie listy, które można znaleźć w pliku pomocy w oprogramowaniu Leuko64 TM. UWAGA: Oprogramowanie zawiera znaczniki i zlecenia sterujące związane z kontrolami. t l H Y C POSTĘPOWANIE I PRZECHOWYWANIE Nieużywane fiolki przechowywać w pozycji pionowej, szczelnie zakręcone w temperaturze 2-8 C. Zamknięte fiolki zachowują stabilność do terminu ważności podanego na każdej fiolce i w karcie testu. Należy unikać zbędnych cykli podgrzewania i schładzania, ponieważ test został zatwierdzony dla maksymalnie trzydziestu (30) cykli termicznych. Produkt należy chronić przed zamrożeniem, działaniem temperatur powyżej 30 C, długotrwałym przechowywaniem w temperaturze pokojowej (18-26 C) oraz działaniem światła. OSTRZEŻENIE Wszystkie elementy tego zestawu zawierają azydek sodu (<0,1% w/v). W połączeniu z kwasami lub metalami niniejsza substancja chemiczna jest związkiem toksycznym i niebezpiecznym. W trakcie pracy z tą substancją należy zachować ostrożność. Roztwory zawierające azydek sodu należy odpowiednio utylizować. KONTROLA JAKOŚCI PRODUKTU Działanie i swoistość odczynników znajdujących się w tym zestawie badane są wewnętrznymi metodami kontroli jakości obowiązującymi w firmie Trillium. Wytwarzanie tego produktu odbywa się z wykorzystaniem wytycznych dotyczących systemu jakości i produkcji zgodnych z normami FDA QSR oraz ISO 13485:2003. OGRANICZENIA DOTYCZĄCE PRODUKTU Wiadomo, że terapeutyczne stosowanie interferonu-gamma, G-CSF lub innych środków modulujących własną odpowiedź immunologiczną wpływa na zwiększenie ekspresji receptorów CD64 i w ten sposób na interpretację testu. Wyników testu Leuko64 TM nie należy wykorzystywać jako wyłącznej miary stanu LK64-V A4 PL Strona 6 z 9

7 zapalnego u tych pacjentów, ale można je stosować do monitorowania efektów terapii. Należy zapewnić prawidłowe warunki przechowywania i stosowania tego produktu oraz badanych próbek, co pozwoli uzyskać optymalne działanie i uniknąć fałszywych lub nieprecyzyjnych wyników. Niedostateczne wymieszanie zawartości fiolki przed użyciem sprawia, że zarówno pobrana z niej próbka, jak i materiał pozostający w fiolce są bezużyteczne. Wybór nieprawidłowego protokołu urządzenia lub numeru partii zestawu przy uruchamianiu oprogramowania może doprowadzić do pogorszenia dokładności analizy danych w trybie listy. Oprogramowanie jest specyficzne względem partii, a protokoły pracy są specyficzne dla modelu urządzenia. Po wyświetleniu monitu należy dokonać właściwego wyboru. Za pomocą testu Leuko64 TM nie można analizować jakiegokolwiek pliku uzyskanego z próbki krwi z ciężką leukopenią lub neutropenią wykazujący mniej niż 200 zdarzeń WBC bramkowanych przez oprogramowanie Leuko64 TM w dowolnej z 3 kategorii (PMN, limfocyty lub monocyty), bez istotnego pogorszenia dokładności i precyzji wskaźnika PMN CD64. Należy zbadać plik wykazujący liczbę zdarzeń cząstek mniejszą niż 1000 w celu ustalenia przyczyny niskiej liczby cząstek, np. nieprawidłowych ustawień urządzenia lub nierozcieńczonej próbki krwi o stężeniu leukocytów >25 x 10 9 komórek/l. Cytometry przepływowe rzadko mogą być wyposażone w filtry ustawione w nietypowej konfiguracji, kiedy to FL1 nie jest sygnałem CD64 FITC, a FL2 nie jest sygnałem CD163 PE, co niekorzystnie wpływa na działanie oprogramowania Leuko64 TM. W celu uzyskania pomocy w takiej sytuacji lub w razie problemu z użytkowaniem oprogramowania należy skontaktować się z dostawcą urządzenia lub działem pomocy technicznej firmy Trillium Diagnostics. CHARAKTERYSTYKA Każde laboratorium powinno ustalić dopuszczalne zakresy referencyjne dla każdej partii Leuko64 TM. Przewidywany zakres referencyjny wskaźnika PMN CD64 dla próbek krwi prawidłowej wynosi 1,00. Zasadniczo im cięższa ogólnoustrojowa ostra reakcja zapalna, tym wyższa zmierzona wartość wskaźnika CD64 dla granulocytów (i monocytów). Nie ustalono przewidywanych zakresów referencyjnych wskaźników CD64 i CD163 dla monocytów. BIBLIOGRAFIA 1. Davis BH. Improved diagnostic approaches to infection/sepsis detection. Expert Rev Mol Diag 2005;5: Schiff D, Rae J, et al. Increased phagocyte CD64 expression and improved Fcreceptor mediated phagocytosis following in vivo recombinant human interferon- Ɣ treatment of normal human subjects. Blood 1997;90: Petroni KC, Shen L, Guyre PM. Modulation of human polymorphonuclear leukocyte IgG Fc receptors and Fc receptor-mediated functions by IFN-gamma and glucocorticoids. J Immunol 1988;140: LK64-V A4 PL Strona 7 z 9

8 4. Davis BH, Bigelow NC, et al. Neutrophil CD64 expression: potential diagnostic indicator of acute inflammation and therapeutic monitor of interferon- therapy. Lab Hematol 1995;1: Guyre PM, Campbell AS, et al. Monocytes and polymorphonuclear neutrophils of patients with streptococcal pharyngitis express increased numbers of type I IgG Fc receptors. J Clin Invest 1990;86: Ng PC, Lam HS. Diagnostic markers for neonatal sepsis. Curr Opin Pediatr 2006;18: Davis BH, Bigelow NC. Comparison of neutrophil CD64 expression, manual myeloid immaturity counts, and automated hematology analyzer flags as indicators of infection or sepsis. Lab Hematol 2005;11: Leino L, Sorvajarvi K, et al. Febrile infection changes the expression of IgG Fc receptors and complement receptors in human neutrophils in vivo. Clin Exp Immunol 1997;107: Davis BH, Olsen S, et al. Neutrophil CD64 is an improved indicator of infection or sepsis in emergency room patients. Arch Pathol Lab Med 2006;130(5): Van der Meer W, Pickkers P, et al. Hematological indices, inflammatory markers and neutrophil CD64 expression: comparative trends during experimental human endotoxemia. J Endotoxin Res 2007;13: Groselj M, Ihan A, Derganc M. Neutrophil and monocyte CD64 and CD163 expression in critically ill neonates and children with sepsis: comparison of fluorescence intensity and calculated Indexes. Mediators Inflamm 2008; 2008: Bhandari V, Wang C, et al. Hematologic profile of sepsis in neonates: neutrophil CD64 as a diagnostic marker. Pediatrics 2008;121: Hoffmann JJ. Neutrophil CD64 as a sepsis biomarker. Biochemica Medica 2011;21: Icardi M, Erickson Y, Kilborn S, et al. CD64 Index provides simple and predictive testing for detection and monitiroing of sepsis and bacterial infection in hospital patients. J Clin Microbiol 2009;47: US Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration. 29 CFR Parts , Occupational Exposure to Bloodborne Pathogens; Final Rule. Federal Register 235: US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication (NIH) Washington: US Government Printing Office ZNAKI TOWAROWE Oprogramowanie Leuko64 QuantiCALC chronione jest prawem autorskim i zostało wspólnie opracowane przez firmy VERITY SOFTWARE HOUSE Topsham, Maine, USA oraz, LLC Brewer, Maine, USA FACSCanto i FACScan to znaki towarowe firmy BD Biosciences San Jose, CA, USA Navios, Gallios Cytomics FC500 i XL to znaki towarowe firmy Beckman Coulter, Inc Brea, CA, USA LK64-V A4 PL Strona 8 z 9

9 Leuko64 to opatentowany test, chroniony patentem nr (USA) i nr (Japonia), dla którego złożono wniosek do Europejskiego Urzędu Patentowego o numerze OBSŁUGA KLIENTA M P Trillium Diagnostics, LLC PO Box 67 Brewer, Maine, USA Tel Faks Kwestie techniczne info@trilliumdx.com Zamówienia telefoniczne, faksem lub przez stronę internetową: IQ Products BV Rozenburglaan 13a 9727 DL Groningen, Holandia Tel. +31 (0) Faks +31 (0) Kwestie techniczne marketing@iqproducts.nl Zamówienia orders@iqproducts.nl Strona internetowa LK64-V A4 PL Strona 9 z 9